香水蓮花花色素苷的提取及穩(wěn)定性

周 琦，趙 峰，張慧會，祝遵凌，湯 鵬

（1.江蘇開放大學(xué) a.環(huán)境生態(tài)學(xué)院；b.建筑工程學(xué)院，江蘇 南京 210036； 2.南京林業(yè)大學(xué) a.風(fēng)景園林學(xué)院；b.藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，江蘇 南京 210037）

香水蓮花Nymphaea hybrida是睡蓮科睡蓮屬珍貴的水生觀賞花卉，屬于熱帶大型睡蓮，其花形優(yōu)美，花色鮮艷，花香怡人，觀賞價值極高[1-2]。在中國，香水蓮花主要分布在海南、福建、廣州、浙江、江蘇等地區(qū)，在園林中除可用于盆栽、水景布置及鮮切花等，還可用于壓制干燥花[3]。由于體內(nèi)富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，其在食品和醫(yī)藥方面也具有十分廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。

花色素苷類色素是自然界中最廣泛存在的一種天然色素，可以從水果[6]、蔬菜[7]和某些花的花瓣[8-9]中提取出來，影響植物的呈色。以往對花色素的研究大多集中在月季[10]、芍藥[11]、菊花[12]、海棠[13]等觀賞植物，對水生植物的研究報道較為鮮見。花色素苷類色素被認(rèn)為是一種潛在的人工合成色素替代品，其色彩鮮亮，具有水溶性，能提高視力，具有抗衰老、抗癌和抗病毒等生物活性[14]。然而，花色素苷顏色的穩(wěn)定性受外界環(huán)境影響較大，在生產(chǎn)處理和儲存過程中極易變色，這種不穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和極高的降解速度制約了花色素苷類色素在商業(yè)中的應(yīng)用。提高花色素的穩(wěn)定性對于改善干燥花保色技術(shù)十分重要。

香水蓮花鮮花花瓣中含有大量的花色素苷類色素，色彩鮮艷，具有良好的開發(fā)前景，而關(guān)于香水蓮花花色素提取及穩(wěn)定性的研究鮮見報道。本文中以紫色香水蓮花和粉色香水蓮花為研究對象，篩選香水蓮花花色素的適宜提取條件，并對其色素的穩(wěn)定性進行初步研究，旨在為香水蓮花花色素的開發(fā)利用以及干燥花保色研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料采自廈門香水蓮花種質(zhì)資源圃，包括香水蓮花紫色品系中的“紫花型”香水蓮花（紫色）和粉色品系中的“粉花型”香水蓮花（粉色），分別簡稱為“紫色香水蓮花”和“粉色香水蓮花”。于晴天8:00，溫度約26 ℃，露水剛干時，采集盛花期的香水蓮花花朵由外至內(nèi)第3 輪花瓣。每個品系取3 次重復(fù)，每個重復(fù)選取5 朵花，要求5朵花分別生長于5 株對應(yīng)花色的香水蓮花植株上。釆后，將花瓣立即用錫箔紙包好，液氮保存，然后置于實驗室-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 香水蓮花花色素苷提取條件的確定

1）提取溶劑的選擇。稱取1 g 香水蓮花花瓣，分別加入3 種浸提溶劑各10 mL（1%鹽酸甲醇、1%鹽酸乙醇、0.1 mol/L 鹽酸），置于32 ℃的恒溫水浴鍋中避光浸提6 h，過濾后定容至25 mL 的容量瓶中，以提取劑為對照，用紫外可見分光光度計掃描，波長為400 ～700 nm，每處理設(shè)3 次重復(fù)，并進行比較分析，確定合適的提取溶劑。

2）提取時長的確定。稱取1 g 香水蓮花花瓣，加入10 mL 上述試驗中確定的提取溶劑，置于32 ℃ 的恒溫水浴鍋中分別避光浸提1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h，過濾后定容至25 mL 的容量瓶中，以1%的鹽酸甲醇溶液為對照，用紫外可見分光光度計檢測提取液在530 nm 處的吸光值（A530），每處理設(shè)3 次重復(fù)，參考徐麗萍等[15]的方法，以每克鮮樣在10 mL 提取液中的吸光值0.1 為1 個色素單位，計算花色素苷含量（C），并加以比較分析，確定合適的提取時長。

1.2.2 香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的測定

稱取5.00 g 香水蓮花花瓣，加入50 mL 1%的鹽酸甲醇提取劑充分研磨后，移到試劑瓶中，在32 ℃的恒溫水浴鍋中避光浸提，浸提時長根據(jù)1.2.1 中試驗結(jié)果進行確定。過濾去渣，置于-4 ℃的冰箱中黑暗保存?zhèn)溆?。? mL 提取液置具塞試管中，加入9 mL 含1%濃鹽酸的甲醇，分別檢測光照、溫度對色素顏色的效應(yīng)[16]。測定無其他條件影響下提取液在對應(yīng)檢測波長下的初始吸光值（ACK）。

1）光強對花色素苷顏色呈現(xiàn)的效應(yīng)。光強設(shè)置自然光照、日光燈照和避光3 種處理。自然光照處理為將花瓣色素提取液置于室內(nèi)向陽窗臺上；日光燈照處理為將提取液置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，光強設(shè)置為(6 300±100) lx，溫度設(shè)置 為(20.0±0.5) ℃；避光處理為將提取液置于避光條件下的恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為(20.0±0.5) ℃。每天白天將裝有色素提取液的具塞試管放在3 種光照條件下，靜置10 h，然后取樣測定波長530 nm 處的吸光值（A530），晚上再置于避光培養(yǎng)箱中，連續(xù)測定8 d。

2）溫度對花色素苷顏色呈現(xiàn)的效應(yīng)。在室內(nèi)日光燈下，用電熱恒溫水浴鍋分別設(shè)20、30、40、50、60、70、80 ℃處理，每隔1 h 取樣1 次，用自來水冷卻至室溫，迅速測定波長530 nm 處的吸光值（A530），連續(xù)監(jiān)測7 h，并觀察溶液顏色的變化。

3）pH 對色素顏色呈現(xiàn)的效應(yīng)。取1 mL 提取液于具塞試管，分別加入pH 為0 ～8 的HCl 溶液9 mL，搖勻后于黑暗中平衡2 h，在400 ～700 nm 范圍內(nèi)掃描，檢測溶液在可見光區(qū)的最大吸收波長（λvismax）處的吸光值（Aλvismax）。其中，pH0的HCl 為1.00 mol/L，pH1.0 的HCl 為0.10 mol/L，pH2.0 的HCl 為0.01 mol/L，pH 為3 ～8 的HCl溶液使用磷酸氫二鈉和檸檬酸的緩沖液進行配制。

4）化學(xué)成分對色素顏色呈現(xiàn)的效應(yīng)。取1 mL 提取液于具塞試管，均加入9 mL 反應(yīng)液，混勻后在黑暗中平衡1 h，觀察溶液顏色，檢測波長 530 nm 處的吸光值（A530）。以“反應(yīng)液+蒸餾水”為對照。反應(yīng)液包括濃度均為0.5 mol/L 的

Al3+（AlCl3·6H2O）、Fe3+（FeCl3·6H2O）、Cu2+（CuSO4·5H2O）、Zn2+（ZnSO4·7H2O）、Mg2+（MgSO4）、Fe2+（FeSO4·7H2O）、Ca2+（CaCl2）、K+（KCl）、Na+（NaCl）和Mn2+（MnSO4·H2O），以及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氧化劑（H2O2）、還原劑（維生素C 和Na2SO3）、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2007 軟件對數(shù)據(jù)進行基礎(chǔ)處理，用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行顯著性檢驗和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香水蓮花花色素苷的提取條件

2.1.1 最大吸收波長

以香水蓮花花色素苷提取液吸收的波長為橫坐標(biāo)，以不同波長下吸光值為縱坐標(biāo)，香水蓮花花色素苷提取液在波長400 ～700 nm 處的紫外-可見光譜如圖1 所示。由圖1 可看出，紫色香水蓮花和粉色香水蓮花花色素苷提取液在波長530 nm 附近均有1 個吸收峰?；ㄇ嗨卦诳梢姽鈪^(qū)域最大吸收波長為500 ～550 nm[17]，因此，香水蓮花花色素苷符合花青素類物質(zhì)的特征吸收峰，故可初步斷定是花青素類物質(zhì)。

圖1 香水蓮花花色素苷提取液紫外-可見光吸收光譜Fig.1 The ultraviolet-visible spectrum of different color pigments in N.hybrid

2.1.2 適宜的提取溶劑

香水蓮花在不同提取溶劑下的吸收光譜如圖2 所示。由圖2 可看出，紫色香水蓮花和粉色香水蓮花花色素苷提取液以0.1 mol/L 的鹽酸為提取溶劑的吸收峰值波長均約在530 nm 處，吸光峰值分別為0.145、0.180，提取液呈淡粉紅色；以1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇為提取溶劑的吸收光譜基本一致，在波長530 nm 處均有1 個較大的吸收峰值，紫色香水蓮花花色素苷提取液在可見光區(qū)最大吸收峰分別為0.213 和0.202，粉色香水蓮花花色素苷提取液在可見光區(qū)最大吸收峰分別為0.295和0.215，這正是花色素苷的特征吸收峰。紫色香水蓮花色素苷提取液在1%鹽酸甲醇提取溶劑中呈深紫紅色，在1%鹽酸乙醇提取溶劑中呈深紅色，粉色香水蓮花色素苷提取液在2 種提取溶劑中分別呈深粉紅色和粉紅色，與花瓣顏色類似。因此，在提取香水蓮花花瓣中花色素苷時，可選擇1%鹽酸甲醇為提取溶劑。

2.1.3 適宜的提取時長

不同提取時長對2 種香水蓮花花色素苷提取效果的影響如圖3 所示。由圖3 可看出，浸提時長在6 h 內(nèi)時，隨著提取時長的延長，香水蓮花花色素苷含量顯著增加；在提取時長達到6 h 時，花色素苷含量達到最高值；之后，隨著浸提時長繼續(xù)延長，2 種香水蓮花的花色素苷含量均趨于相對穩(wěn)定，提取時長達10 h 后，含量逐漸下降，可能是因為提取時長過長，花色素產(chǎn)生了分解。因此，在香水蓮花花色素苷提取及其穩(wěn)定性的研究中，浸提時長選用6 h 較為合適。

圖2 不同提取溶劑中香水蓮花花色素苷提取液吸收光譜Fig.2 The ultraviolet-visible spectrum of anthocyanin in N.hybrid in different extraction solutions

圖3 不同提取時長下香水蓮花花色素苷的含量Fig.3 The content of anthocyanin in N.hybrid under different extraction time

2.2 香水蓮花花色素苷的穩(wěn)定性

2.2.1 光照的影響

光照對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響如圖4 所示。由圖4 可看出，光照對香水蓮花花色素苷提取液產(chǎn)生褪色效應(yīng)，光照越久，強度越大，花色素苷降解幅度越大。自然光和日光燈光均導(dǎo)致紫色和粉色香水蓮花花色素苷的降解，具體表現(xiàn)為提取液顏色變淡，在波長530 nm 處的吸光值持續(xù)下降，其中，自然光的作用最強烈。在避光條件下，2 種香水蓮花的花色素苷均較為穩(wěn)定。光照處理8 h 后，紫色香水蓮花在日光燈和自然光下花色素苷提取液吸光值比遮光條件下分別下降了20.0%和30.2%；粉色香水蓮花花色素苷提取液吸光值分別下降了26.4%和37.0%，下降幅度較大。因此，香水蓮花的花色素苷對光較為敏感，尤其是自然光，避光能夠有效防止其花色素苷的降解，香水蓮花花瓣的花色素苷類色素表現(xiàn)出光穩(wěn)定性較差的顯著特征。

圖4 光照對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of light on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.2 溫度的影響

溫度對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響如圖5 所示。由圖5 可看出，香水蓮花花色素苷的耐熱性較差，溫度升高會降低香水蓮花花色素苷提取液的吸光值，使其顏色變淡，且溫度越高，作用越明顯。隨著溫度的升高和處理時長的延長，香水蓮花花色素苷提取液在波長530 nm 處的吸光值不斷下降，而且，溫度越高，處理時長越長，其下降幅度越明顯，香水蓮花花色素苷提取液的顏色則更淡。處理7 h 后，在80 ℃條件下紫色香水蓮花和粉色香水蓮花的花色素苷提取液吸光值比20 ℃條件下分別下降了35.0%和45.2%，說明粉色香水蓮花的花色素苷受溫度影響更大。

香水蓮花花色素苷在不同溫度下發(fā)生的變化，可能是因為溫度影響其花色素苷與輔色素的共色作用，高溫也會導(dǎo)致花色素苷向無色的查爾酮轉(zhuǎn)變。

圖5 溫度對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.3 pH 的影響

pH 對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響見表1。由表1 可知，不同pH 使香水蓮花花色素苷的顏色產(chǎn)生不同程度的變化。在強酸性條件下，隨著酸性減弱，香水蓮花花色素苷提取液的吸光值不斷減小，當(dāng)pH 為5 時，吸光值最低，與pH0 ～2 時的吸光值差異極顯著。在弱酸條件下（pH4 ～6），提取液的吸光值較低，說明弱酸性環(huán)境會使香水蓮花的花色素苷提取液褪色。在中性環(huán)境中，提取液的吸光值逐漸增大。從吸光值的總體變化趨勢可以看出，酸性環(huán)境對香水蓮花花色素苷的影響較大，酸性增強，香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性較好，提取液顏色加深；弱酸環(huán)境不利于香水蓮花花色素苷的穩(wěn)定，在中性的環(huán)境中，其色素又較為穩(wěn)定。

表1 pH 對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響?Table 1 Effect of pH on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.4 金屬離子的影響

金屬離子對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響見表2。由表2 可知，不同金屬離子對香水蓮花花色素苷的影響存在差異。Al3+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+、Mn2+對香水蓮花花色素苷的影響不大，提取液的顏色和吸光值均無極顯著變化；Cu2+使提取液呈現(xiàn)藍(lán)紫色；Fe3+使提取液由紫紅色或粉紅色轉(zhuǎn)為黃棕色；Fe2+使紫色香水蓮花和粉色香水蓮花的花色素苷提取液分別變?yōu)樽虾谏退{(lán)黑色。說明Cu2+、Fe3+和Fe2+這3 種金屬離子對香水蓮花花色素苷的影響較大，使其提取液呈現(xiàn)出不同的顏色。其原因可能是這幾種金屬離子與香水蓮花花色素苷發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，從而使其褪色或轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌伾奈镔|(zhì)。所以，在儲存或生產(chǎn)香水蓮花花色素苷時，盡可能避免與Cu2+、Fe3+和Fe2+等金屬離子相接觸。

表2 金屬離子對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of metal ions on the stability of flower color pigment from N.hybrid

2.2.5 氧化劑和還原劑的影響

氧化劑和還原劑對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響見表3。由表3 可知，隨著氧化劑和還原劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，2 種香水蓮花花色素苷提取液的吸光值均不斷減小。氧化劑H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時，2 種香水蓮花的花色素苷提取液均轉(zhuǎn)為無色，吸光值顯著降低。還原劑Vc 使香水蓮花花色素苷提取液顏色變淡，吸光值隨其體積分?jǐn)?shù)的增大而下降。還原劑Na2SO3（也可作為防腐劑）對香水蓮花花色素苷破壞性較大，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶液（0.1%）即可使其吸光值迅速下降，且提取液的顏色由紅褪為無色；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，提取液為極淺黃色；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時，提取液變?yōu)闇\黃色，且 2 種香水蓮花對應(yīng)的吸光值均發(fā)生顯著下降。說明，香水蓮花花色素苷對氧化劑和還原劑較為敏感。

2.2.6 糖和檸檬酸的影響

糖和檸檬酸對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響見表4。由表4 可知，紫色香水蓮花和粉色香水蓮花花色素苷提取液在葡萄糖、蔗糖和檸檬酸溶液中分別呈紫紅色和粉紅色。隨著蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，花色素苷提取液的吸光值不斷減小，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% 與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 條件下吸光值的差異極顯著，顏色變淡。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖溶液對香水蓮花花色素苷的影響不明顯，提取液的吸光值變化不大。隨著檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，香水蓮花花色素苷提取液的吸光值有所增加，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、3% 與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 條件下吸光值的差異顯著。由此可見，蔗糖和葡萄糖對香水蓮花花色素苷的影響存在差異，葡萄糖對花色素苷提取液的顏色幾乎不產(chǎn)生影響，而蔗糖會使其顏色偏淡。檸檬酸則可以維持花色素苷提取液的顏色，且隨檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，花色素苷更為穩(wěn)定。

表3 氧化劑和還原劑對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of oxidant, reductant on the stability of flower color pigment from N.hybrid

表4 糖和檸檬酸對香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of sugar and citric acid on the stability of flower color pigment from N.hybrid

3 結(jié)論與討論

不同植物的葉片、花瓣或果實中花色素苷的最佳提取條件不同[18]。在對香水蓮花花色素苷提取條件的研究中發(fā)現(xiàn)，1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇的提取效果比0.1 mol/L 鹽酸的提取效果好，且1%鹽酸甲醇的提取效果要優(yōu)于1%鹽酸乙醇，這與橡膠樹葉片中花色素苷的提取效果相似[19]。因此，在進行香水蓮花花色素苷提取時，選用1%鹽酸甲醇作為提取溶劑，提取6 h，可以充分提取花瓣中的花色素苷。

環(huán)境因素會影響植物花色素的穩(wěn)定性，這在一定程度上限制了花色素的應(yīng)用[20]。因此，研究植物中天然色素的性質(zhì)，選擇使其穩(wěn)定的因素，有利于天然花色素的開發(fā)和利用[21]?；ㄉ剀疹伾姆€(wěn)定性受pH、氧氣、溫度、花色素苷濃度和結(jié)構(gòu)、光、酶，以及其他輔助因素的影響[22]。當(dāng)植物的外界環(huán)境發(fā)生變化時，其組織也可能產(chǎn)生相應(yīng)的變化，植物本身所呈現(xiàn)的顏色就會發(fā)生改變。在本研究中，香水蓮花花色素苷屬于花色苷類色素，色素穩(wěn)定性受諸多理化因素的影響。

香水蓮花花瓣花色素苷對光和熱較為敏感。光照和高溫可以使香水蓮花花色素苷發(fā)生降解，且光照越強，溫度越高，色素的降解幅度越大。因此，適當(dāng)?shù)牡蜏睾捅芄鈼l件能較好地維持香水蓮花花色素苷的穩(wěn)定性。在研究香水蓮花花瓣花色素苷時，整個提取過程要盡量避光，同時還應(yīng)注意溫度要求，這與劉曉東等[23]對紫葉風(fēng)箱果葉片花色素苷穩(wěn)定性的研究結(jié)果相似。而楊曉娜等[24]對紫皮石斛色素的研究得出相反的結(jié)論，其花色隨溫度的增高而加深，花色苷通過分子自聚作用而使其顏色增強，說明不同植物花色苷受溫度的影響不同。

香水蓮花花瓣花色素苷的顏色受介質(zhì)pH 影響產(chǎn)生不同的變化。在本研究中，隨酸性增強，香水蓮花花色素苷穩(wěn)定性較好，顏色加深；而弱酸環(huán)境不利于香水蓮花花色素苷的穩(wěn)定；在中性環(huán)境中，香水蓮花花色素苷又趨于穩(wěn)定。楊科家等[25]在對元寶楓葉片花色素苷的研究中，也發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境有利于提高花色的穩(wěn)定性。因此，在較低的pH 環(huán)境中，可以保持香水蓮花花瓣花色素苷顏色的穩(wěn)定性。花色素對氧化還原作用較為敏感，這在較大程度上限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用[26]。在本研究發(fā)現(xiàn)，香水蓮花花色素苷的穩(wěn)定性隨氧化劑和還原劑濃度的提高而不斷下降，產(chǎn)生褪色反應(yīng)。相似結(jié)果在歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的研究中也得到了證實[27]。Cu2+、Fe3+和Fe2+對香水蓮花花色素苷的影響較大，可能是因為花色素苷與這類金屬離子形成了絡(luò)合物，從而改變其顏色。葡萄糖對花色素苷的顏色幾乎不產(chǎn)生影響，而蔗糖會使花色偏淡，檸檬酸則可以維持花色，且隨檸檬酸濃度增加，花色更為穩(wěn)定。在黃刺玫花色素穩(wěn)定性的試驗中，昝立峰等[28]卻發(fā)現(xiàn)蔗糖、檸檬酸等食品添加劑對色素的穩(wěn)定性無顯著影響，色素顏色未發(fā)生變化，與本研究中結(jié)果存在差異。

在不同的生長周期，植物體內(nèi)的花色素苷含量會發(fā)生變化，從而影響其呈色[29]。在適宜的生長環(huán)境內(nèi)，香水蓮花能全年開花，花量大，花色多變，資源豐富。本研究中僅選擇香水蓮花盛花期的花瓣進行了研究，后續(xù)可對其不同生長周期內(nèi)天然色素的穩(wěn)定性進行系統(tǒng)研究，也可從其色素的化學(xué)成分、生理活性以及毒理學(xué)等方面進一步研究，以充分挖掘香水蓮花的潛在利用價值。香水蓮花花色素可以作為酸性食品、冷飲食品及化妝品等的天然添加劑加以開發(fā)利用。在應(yīng)用其花色素時，要注意避免強光和高溫，避免接觸銅鐵離子及氧化劑和還原試劑。