何烈干 鄒芬 周云峰 李湘民 黃瑞榮 馬輝剛

摘要 ：為明確江西番茄綿疫病菌的類別和抗藥性水平，采用單孢菌落直接配對法和菌落生長量法，測定2018年-2019年江西番茄主產(chǎn)區(qū)綿疫病菌的交配型及其對甲霜靈的敏感性。結(jié)果表明，江西番茄綿疫病菌存在A 2和A 0交配型，發(fā)生頻率分別為86.2%和13.8%，未檢測到其他交配型，且A 2交配型在各個產(chǎn)區(qū)均有分布。58株番茄綿疫病菌株對甲霜靈的EC 50范圍為0.602 9～3.313 3 μg/mL，平均EC 50為1.372 7 μg/mL，最不敏感菌株EC 50值為最敏感菌株的5.5倍，差異較為明顯。3個菌株對甲霜靈達(dá)到中抗水平，占供試菌株的5.17%，病原菌對甲霜靈的抗性水平上升，亟須加強(qiáng)藥劑的輪換或替代。

關(guān)鍵詞 ：番茄; 綿疫病菌; 交配型; 甲霜靈; 敏感性

中圖分類號：

S 436.412

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020451

Mating type of Phytophthora capsici and its sensitivity to metalaxylin Jiangxi province

HE Liegan1， ZOU Fen1， ZHOU Yunfeng2， LI Xiangmin1， HUANG Ruirong1， MA Huigang1*

（1.Plant Protection Institute， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanchang 330200， China;

2.Poyang Agro-Tech Extension Center， Shangrao 333100， China）

Abstract

In order to clarify category of Phytophthora capsici and resistance level to metalaxyl， the mating type and sensitivity to metalaxyl of P.capsici collected from the main tomato producing areas of Jiangxi in 2018 and 2019 were determined by the methods of matching pairs with standard isolates and determination of colony growth.The results showed that there were two mating types， A 2 and A 0， in the isolates with frequency of 86.2% and 13.8% respectively， while no other mating types were detected， and A 2 was distributed in all sampling regions.The EC 50values of 58 isolates to metalaxyl ranged 0.602 9-3.313 3 μg/mL， with anaverage EC 50value 1.372 7 μg/mL.The EC 50 value of the most insensitive strain was 5.5 times that of the most sensitive strain， and sensitivity of isolates from different regions have a greater difference.There were three isolates with moderate resistance to metalaxyl， accounting for 5.17% of the tested strains.The resistance level increased， so it is urgent to strengthen the rotation or substitution of pesticides.

Key words

tomato; Phytophthora capsici; mating type; metalaxyl; sensitivity

番茄綿疫病是番茄生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，其病原菌主要為寄生疫霉Phytophthora parasitica Dast.、辣椒疫霉P.capsici Leonian和茄疫霉P.melongenae Sawada[12]。許多疫霉的有性生殖過程為異宗配合，即需要有兩個不同交配型的菌株交配才能進(jìn)行有性生殖，交配后在藏卵器中形成卵孢子，可以度過外部不良環(huán)境，從而得以延續(xù)物種[34]。同時，菌株在進(jìn)行有性生殖時可能進(jìn)行基因重組，其后代可能具有更強(qiáng)的致病力、生存能力和更廣泛的寄主范圍。國內(nèi)外有關(guān)番茄綿疫病菌的交配型的報道較少，而有關(guān)江西省番茄綿疫病菌的交配型的研究還未見報道，為此，筆者對江西番茄綿疫病菌的交配型進(jìn)行測定，了解該病害的發(fā)生規(guī)律，以期為江西番茄綿疫病的防治和抗病育種提供理論依據(jù)。

甲霜靈屬苯酰胺類殺菌劑[5]，廣泛應(yīng)用于霜霉、疫霉和腐霉等引起的卵菌病害的防治。但由于其作用位點單一，極易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效大幅降低。近年來，有關(guān)疫霉對甲霜靈產(chǎn)生抗藥性的報道日益增多[611]，江西從20世紀(jì)90年代起一直使用甲霜靈防治番茄卵菌病害，因此，有必要測定本地區(qū)番茄綿疫病菌對甲霜靈的敏感性，明確抗藥性程度和地理分布，為殺菌劑的選擇和抗藥性治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基

10% V8培養(yǎng)基：100 mL V8蔬菜汁，0.2 g CaCO 3，900 mL去離子水，18 g瓊脂粉，混合置于三角瓶中搖勻，在121℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min，待冷卻至60℃時倒入90 mm培養(yǎng)皿中即制得10% V8培養(yǎng)基。

選擇性培養(yǎng)基：待上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，加入20 mg/L利福平、200 mg/L氨芐青霉素和100 mg/L制霉菌素，混勻，倒平皿即制得。

1.1.2 供試病原菌

2018年-2019年分別從永新、于都、安義、萬載、瑞昌、余江、貴溪、樂平等番茄主產(chǎn)區(qū)的綿疫病重發(fā)田塊采集典型病果，用冰袋裝好迅速帶回實驗室進(jìn)行分離。先將病果在自來水下沖洗3 min，再用滅菌水沖洗，然后在病果表面病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm方形小塊，經(jīng)75%乙醇和3%次氯酸鈉消毒后置于選擇性培養(yǎng)基平板上。待形成微小菌落后在邊緣切取菌絲塊移入不含抗菌素的10% V8培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此重復(fù)3次后得到純培養(yǎng)物，共分離純化得到58株菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS測序結(jié)果鑒定為辣椒疫霉P.capsici。將菌株轉(zhuǎn)接至試管中10% V8斜面培養(yǎng)基上，加入滅菌石蠟油覆蓋菌面，在10℃條件下避光保存?zhèn)溆?，菌株命名采用地名漢語拼音首字母+序號，如YX1表示永新地區(qū)1號菌株。

標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株A 1和A 2由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.3 供試藥劑

97%甲霜靈原藥由江蘇寶靈化工有限公司提供，原藥溶于丙酮中，配制10 mg/mL母液，保存于4℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 交配型測定

在10% V8培養(yǎng)基上測定辣椒疫霉的交配型，測定方法采用鄭小波的直接配對法[12]：將供試菌株及標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株活化后，轉(zhuǎn)接于10% V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后用直徑6 mm打孔器從菌落邊緣打取菌餅，置于培養(yǎng)基平板，兩塊菌餅之間距離4 cm。將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)14 d后，在兩個菌落的交界處直接挑取少許菌絲鏡檢是否有雄器、藏卵器和卵孢子產(chǎn)生。各供試菌株均分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株A 1、A 2配對，并與自身相配對為對照，試驗設(shè)3個重復(fù)。

菌株交配型的確定參照鄭小波的方法[12]：僅與A 1菌株配對能產(chǎn)生卵孢子的為A 2交配型;僅與A 2菌株配對能產(chǎn)生卵孢子的為A 1交配型;與A 1和A 2菌株配對均不能產(chǎn)生卵孢子的為A 0交配型;與A 1和A 2菌株配對均能產(chǎn)生卵孢子，但單株培養(yǎng)不產(chǎn)生卵孢子的為A 1，A 2交配型;單株培養(yǎng)能產(chǎn)生卵孢子為A 1A 2交配型。

1.2.2 病原菌對甲霜靈的敏感性測定

辣椒疫霉對甲霜靈的敏感性測定參照Misra等[7]的方法。將所有供試菌株活化后轉(zhuǎn)接到含甲霜靈0、5、100 μg/mL 的10% V8培養(yǎng)基中，設(shè)3個重復(fù)，置于26℃下黑暗培養(yǎng)7 d后，測量各菌落的生長量，根據(jù)生長量確定菌株的抗性：5 μg/mL甲霜靈平板上菌落生長量≤40%對照（甲霜靈濃度0 μg/mL）生長量的為敏感;100 μg/mL甲霜靈平板上的菌落生長量≥40%對照生長量的為抗性;100 μg/mL甲霜靈平板上的菌落生長量<40%對照生長量<5 μg/mL甲霜靈平板上的菌落生長量為中抗。

根據(jù)上述菌落的生長情況設(shè)定兩組含甲霜靈濃度梯度，敏感菌株甲霜靈濃度梯度設(shè)置為0、0.05、0.15、0.50、1.50、4.50、10.0 μg/mL，中抗菌株甲霜靈濃度梯度設(shè)置為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL。用直徑為6 mm的打孔器在培養(yǎng)好的菌落邊緣打取菌餅，置于含上述濃度甲霜靈的10% V8培養(yǎng)基平板中央，共設(shè)3次重復(fù)，在培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)，當(dāng)對照（0 μg/mL甲霜靈）組菌落直徑達(dá)到7～8 cm時，用垂直十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算抑制率，抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-6）]×100%。將抑制率轉(zhuǎn)化成幾率值，采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，求出毒力回歸方程的斜率、有效抑制中濃度（EC 50）及95%置信限并進(jìn)行卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配型測定結(jié)果

將58株菌株分別與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行交配型測定，結(jié)果顯示（表1），50株為A 2交配型，發(fā)生頻率為86.2%，8株為A 0交配型，發(fā)生頻率為13.8%，未檢測到其他交配型，表明江西省的辣椒疫霉以A 2交配型為主。

進(jìn)一步分析交配型的地理分布可知，A 2交配型在全部8個采集地區(qū)均有分布，A 0交配型主要分布在永新、安義、樂平和瑞昌，且各地均以A 2交配型為主。此次試驗中未檢測到A 1、A 1A 2和A 1，A 2等交配型，表明這3種交配型在江西省可能沒有或者比例很小。

2.2 番茄綿疫病菌對甲霜靈的敏感性測定

對江西省內(nèi)8個縣市番茄主產(chǎn)區(qū)分離到的58個番茄綿疫病菌株進(jìn)行了甲霜靈敏感性測定。結(jié)果表明（表2），所有菌株在含100 μg/mL甲霜靈的培養(yǎng)基上均未長出菌絲，未見抗性菌株，YD2、YD8和RC7等3株菌株在含5 μg/mL甲霜靈的培養(yǎng)基上的生長量超過對照組上生長量的40%，達(dá)到中抗水平，占供試菌株的5.17%，其余55株菌株均為敏感菌株，占供試菌株的94.83%。

58株辣椒疫霉菌株對甲霜靈的EC 50范圍0.602 9～3.313 3 μg/mL，平均EC 50為1.372 7 μg/mL，最不敏感菌株EC 50為最敏感菌株的5.5倍，差異較為明顯。

2.3 不同地理分布的菌株的敏感性區(qū)別

對江西不同地理分布菌株進(jìn)行敏感性分析，從表3可見，不同地區(qū)菌株對甲霜靈的敏感性有較大差異，來自于都的菌株其平均EC 50最高，為1.723 0 μg/mL，來自貴溪的菌株其平均EC 50最低，為1.145 9 μg/mL。同一地區(qū)的菌株對甲霜靈敏感性差異較大，如瑞昌的菌株其最不敏感菌株EC 50為最敏感菌株的3.54倍，于都的為3.06倍，貴溪的為2.64倍。

3 討論

辣椒疫霉為異宗配合卵菌，需與A 1 和A 2兩種不同交配型進(jìn)行有性生殖產(chǎn)生卵孢子，而在有性生殖過程中，將會產(chǎn)生新的致病小種、強(qiáng)毒力或抗藥性后代群體，對病害的防控造成嚴(yán)重威脅。明確菌株的交配型及分布，對番茄綿疫病防治、抗綿疫病育種和了解病原菌的起源、衍化和遷徙具有重要意義。李萍等[13]和戚仁德等[3]研究發(fā)現(xiàn)，安徽省辣椒疫霉存在A 1和A 2兩種交配型，其中以A 2占優(yōu);劉永剛等[14]測定了甘肅省辣椒疫霉存在A 1、A 2和A 03種交配型，以A 1和A 0占優(yōu)勢;付迎坤等[15]研究表明青海省辣椒疫霉出現(xiàn)A 1、A 2和A 03種交配型，以A 1和A 0占優(yōu)勢;Silvar等[16]研究認(rèn)為西班牙西北部辣椒疫霉均為A 1型;Gevens等[17]發(fā)現(xiàn)美國食用豆上的辣椒疫霉以A 1型為主;本研究結(jié)果表明，江西番茄綿疫病辣椒疫霉為A 2 和A 0兩種，未發(fā)現(xiàn)A 1型，意味著病原菌在田間不能完成有性生殖，因此發(fā)生遺傳變異的可能性較低，從而可能降低了病害的防治難度。

甲霜靈是由瑞士Ciba-Geigy公司研發(fā)的一種苯酰胺類殺菌劑，能有效防治由卵菌引起的病害，但長期單一使用易導(dǎo)致病原菌對其產(chǎn)生抗性。Deahl等[18]和畢朝位等[6]報道了致病疫霉對甲霜靈已產(chǎn)生較重抗藥性，Misra等[7]研究發(fā)現(xiàn)芋疫霉已開始對甲霜靈產(chǎn)生抗藥性，曹繼芬等[5]、朱桂寧等[10]和孟建玉等[11]研究表明寄生疫霉對甲霜靈中抗和抗性群體比例上升明顯。張海良等[19]2010年測定江西省辣椒疫霉均為敏感菌株，本研究測定有3株菌株對甲霜靈表現(xiàn)為中抗，占供試菌株的5.17%，表明在江西境內(nèi)已出現(xiàn)抗甲霜靈菌株，因此，建議甲霜靈與其他無交互抗性藥劑交替使用，以克服或延緩抗藥性的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)

[1] 呂佩珂， 李明遠(yuǎn)， 吳鉅文， 等. 中國蔬菜病蟲原色圖譜[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1992： 64.

[2] 殷潔， 范倩， 黃建國. 撕裂蠟孔菌的新功能—防治茄子綿疫病及促生效應(yīng)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 51（12）： 23002310.

[3] 戚仁德， 汪濤， 李萍， 等. 安徽省辣椒疫霉交配型的分布及在無性后代的遺傳[J]. 植物病理學(xué)報， 2012， 42（1）： 4550.

[4] CAVALIER S T. The neomuran origin of archaebacteria， the negibacterial root of the universal tree and bacterial megaclassification [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2002， 52（1）： 776.

[5] 曹繼芬， 霍超， 戶艷霞， 等. 云南省大理州煙草疫霉交配型及甲霜靈敏感性研究[J]. 中國煙草科學(xué)， 2019， 40（6）： 4954.

[6] 畢朝位， 車興壁， 馬金成， 等. 致病疫霉對甲霜靈抗性及抗性水平測定[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2002， 24（4）： 307309.

[7] MISRA R S， MISHRA A K， SHARMA K， et al. Characterisation of Phytophthora colocasiae isolates associated with leaf blight of taro in India [J]. Archives of Phytopathology & Plant Protection， 2011， 44（6）： 581591.

[8] GISI U， COHEN Y. Resistance to phenylamide fungicides： A case study with Phytophthora infestans involving mating type and race structure[J]. Annual Review of Phytopathology， 1996， 34 （1）： 549572.

[9] 汪漢成， 李文紅， 馮勇剛， 等. 煙草黑脛病化學(xué)防治的歷史與現(xiàn)狀[J]. 中國煙草學(xué)報， 2011， 17（5）： 96102.

[10]朱桂寧， 賢小勇， 黃福新， 等. 廣西煙草黑脛病菌對甲霜靈的敏感性檢測[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2011， 42（6）： 623626.

[11]孟建玉， 汪漢成， 賈蒙驁， 等. 貴州省煙草黑脛病菌對甲霜靈的抗藥性[J]. 植物保護(hù)， 2014， 40（5）： 168171.

[12]鄭小波. 疫霉菌及其研究技術(shù)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1997.

[13]李萍， 戚仁德， 楊光紅， 等. 辣椒疫霉交配型及其對辣椒致病力的關(guān)系初步研究[J]安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 38（3）： 319322.

[14]劉永剛， 張海英， 郭建國， 等. 甘肅省辣椒疫霉菌的交配型分布及其致病力差異[J]. 植物保護(hù)學(xué)報， 2008， 35（5）： 448452.

[15]付迎坤， 田曉麗， 李屹， 等. 青海省辣椒疫霉菌交配型分析及分布特征[J]. 北方園藝， 2014（18）： 139141.

[16]SILVAR C， MERINO F， DIAZ J. Diversity of Phytophthora capsici in northwest Spain： analysis of virulence， metalaxyl response， and molecular characterization[J]. Plant Disease， 2006， 90（9）： 11351142.

[17]GEVENS A， DONAHOO R， LAMOUR K， et al. Characterization of Phytophthora capsici causing foliar and pod blight of snap bean in Michigan[J]. Plant Disease， 2008， 92（2）： 201209.

[18]DEAHL K L， INGLIS D A， DEMUTH S P. Testing for resistance to metalaxyl in Phytophthora infestans isolates from Northwestern Washington[J]. American Potato Journal， 1993， 70（11）： 779795.

[19]張海良， 馬輝剛， 李湘民， 等. 辣椒疫霉菌對甲霜靈的敏感性測定[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 33（2）： 270274.

（責(zé)任編輯：田 喆）