長 城，鄭海婷，于文杰，秦立武 ，牛麗君 ，范宇光

(1.長白山科學(xué)研究院，吉林 二道白河 133613；2.長白山生物群落與生物多樣性吉林省聯(lián)合重點實驗室，吉林 二道白河 133613；3.長白山保護開發(fā)區(qū)水資源管理服務(wù)中心，吉林 二道白河 133613；4.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199；5.海南省藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海南 ?？?571199)

桑黃是一類重要的藥用真菌，在我國歷代本草著作中均有記載，最早可見于《神農(nóng)本草經(jīng)》.桑黃具有治療痢疾、盜汗、血崩、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)、止瀉、延年等功效[1]，以及抗腫瘤、保肝、降血糖、增強免疫力、抗氧化、抗菌、抗炎、抗誘變、抗突變等作用，主要用于預(yù)防或治療癌癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎，以及胃腸道功能紊亂、腹瀉和過敏等，在東亞地區(qū)尤其是中國、日本和韓國有廣泛應(yīng)用[2].

近年來，因具有良好的藥理活性，國內(nèi)關(guān)于桑黃的研究成果、科研項目逐年增加.吉林、浙江、陜西等地均有桑黃生態(tài)栽培[3-4]，桑黃茶、桑黃護膚品、口服液等桑黃終端產(chǎn)品已經(jīng)上市，但桑黃質(zhì)量評價、質(zhì)量控制標準滯后，未列入國家藥典、部頒標準等國家級標準，嚴重影響了桑黃作為醫(yī)藥、保健品等市場新興產(chǎn)品的銷售與監(jiān)管.本文將簡要梳理桑黃分類、栽培、發(fā)酵情況，參考2020版《中華人民共和國藥典》[5](下文簡稱《藥典》)綜述桑黃質(zhì)量評價研究進展，針對桑黃標準化質(zhì)量控制無國家級標準的問題，提出未來制定桑黃標準的建議，以促進桑黃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展.

1 桑黃基源、人工栽培及發(fā)酵

1.1 桑黃基源

雖然在我國歷代本草著作中多有記載，但桑黃的基源物種一直未能明確.桑黃曾經(jīng)被認為隸屬廣義木層孔菌屬(Phellinuss.l.)或纖孔菌屬(Inonotus)，在2012年之前的文獻中多以火木層孔菌(Phellinusigniarius)、裂蹄木層孔菌(Phellinuslinteus)被記載和報道.直到2016年，周麗偉等[6]建立了桑黃孔菌屬(Sanghuangporus)，該屬包含民間被當(dāng)作“桑黃”應(yīng)用的核心種類，如桑樹桑黃(S.sanghuang)、楊樹桑黃(S.vaninii)、小孔忍冬桑黃(S.lonicericola)和暴馬桑黃(S.baumii)等.2019年又發(fā)現(xiàn)該屬一新物種——漆樹桑黃(S.toxicodendri)[7]，該種在神農(nóng)架林區(qū)也被當(dāng)作桑黃使用.目前，全球已知桑黃孔菌屬14種，中國分布有8種(見表1)[8-9].另外，在考證大量本草文獻的基礎(chǔ)上，也有觀點認為新疆、山東等地生長于桑樹上的粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)是傳統(tǒng)中藥桑黃的基源物種[10].目前，關(guān)于桑黃性狀的描述多集中在藥材檢驗的“眼看”，未見關(guān)于“手摸”“水試”等常規(guī)藥材檢驗方法.同時，桑黃類真菌在分類學(xué)上主要屬于桑黃屬、纖孔菌屬，關(guān)于桑黃基源物種尚存在一定爭議，且民間應(yīng)用的桑黃種類更為寬泛，因此，有必要結(jié)合藥理活性、有效成分含量、安全性評價等手段明確桑黃來源.

表1 中國桑黃孔菌屬種類Tab.1 Species of Sanghuangporus in China

1.2 桑黃人工栽培

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局2018年發(fā)布的第16號通告——《省級中藥飲片炮制規(guī)范修訂的技術(shù)指導(dǎo)原則》[11]，應(yīng)對飲片的藥材原植物產(chǎn)地和資源情況進行全面調(diào)查研究.隨著野生桑黃資源的急劇減少，桑黃的規(guī)范化栽培成為桑黃作為中藥材應(yīng)用的必經(jīng)之路.目前，國外僅見韓國和日本有關(guān)于桑黃人工栽培的報道，我國學(xué)者正積極開展桑黃人工栽培技術(shù)研究[12-15].不同地域逐漸形成了差異化的栽培模式，比較有代表性的是短木段栽培模式和袋料栽培模式.短木段栽培模式主要在吉林省長白山區(qū)，安徽省大別山區(qū)的金寨縣也有一定規(guī)模；袋料栽培模式主要在江浙地區(qū)，正逐漸向工廠化方向發(fā)展.于文杰等[16]、范宇光等[17]充分利用長白山區(qū)的氣候優(yōu)勢，采用本地楊樹桑黃菌株進行桑黃生態(tài)栽培技術(shù)探索，最終形成了從菌種選擇、菌段生產(chǎn)、接種到子實體自然培育、采收的關(guān)鍵技術(shù)，實現(xiàn)了楊樹桑黃的原生境生態(tài)栽培.近年來，粗毛纖孔菌也被成功馴化[18]，其袋料栽培在山東、山西及河南等地發(fā)展迅速.林蔚紅等[19]研究了桑黃主要病蟲害種類，調(diào)查了桑黃設(shè)施化栽培環(huán)境監(jiān)測與病蟲害發(fā)生情況，總結(jié)出桑黃病蟲鼠害的防控措施.綜上可知，桑黃的栽培技術(shù)已日漸完善，并在不斷發(fā)展，不同地區(qū)逐漸形成了適合本地的栽培模式.然而，即使同一地區(qū)從事桑黃栽培的企業(yè)或組織之間在技術(shù)細節(jié)上仍存在不少差異，這些差異足以影響到桑黃子實體的產(chǎn)量和品質(zhì).

1.3 桑黃發(fā)酵

桑黃發(fā)酵是擴大桑黃產(chǎn)業(yè)產(chǎn)能、保護野生桑黃資源的有效手段.桑黃發(fā)酵過程具有低能耗、高效率和低污染等特點，發(fā)酵產(chǎn)品可作為生物制劑加以應(yīng)用.宋紅志等[20]以桑黃菌株為對象，以菌絲體生物量為考核指標，開展了桑黃菌絲體液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素試驗，篩選出比較適合的培養(yǎng)條件；TIAN Xuemei等[21]以菌絲體中的黃酮、總酚、多糖為指標，優(yōu)化了桑黃發(fā)酵過程；周蔓等[22]通過觀察、對比接種于不同氮源、碳源培養(yǎng)基中的桑黃菌絲體生長曲線、生長形態(tài)、生物量、生理生化等指標，篩選出最適合桑黃菌絲體生長的培養(yǎng)基；高麗霞[23]將抗菌肽基因?qū)肟共⌒滦蜕涿?，發(fā)酵新型桑樹苗培養(yǎng)基，提取桑黃發(fā)酵菌粉，對比研究了新型桑黃發(fā)酵菌粉與原始桑樹桑黃子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新型桑黃發(fā)酵菌粉中，氨基酸總和及Ca、Na、Fe、Zn、Mg的含量都高于原始桑樹桑黃子實體，說明桑樹桑黃發(fā)酵菌粉的新型培養(yǎng)方法可行，發(fā)酵菌在弱酸性環(huán)境中的產(chǎn)量更高.

2 桑黃質(zhì)量標準與質(zhì)量控制

2.1 分類學(xué)鑒別

吳聲華等[9]、戴玉成等[1]對我國桑黃的中文名(俗名)、拉丁名及主要性狀、顯微特征進行了研究和總結(jié)；周蔓[24]鑒定了桑樹桑黃，包括生物學(xué)特性、子實體形態(tài)宏觀觀察，顯微鏡、掃描鏡微觀觀察，開展了基于ITS序列的分子鑒定；王偉科[25]采用rDNA-ITS 序列分析技術(shù)，參考《藥典》中有關(guān)中藥材及中成藥部分檢驗項目，對收集到的國內(nèi)22個桑黃菌株進行分子鑒定，分析遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多采用形態(tài)與顯微觀察方法，較少采用分子生物學(xué)手段進行鑒別、判定.目前，《藥典》(一部)中蛇類動物藥、川貝母植物藥等都采用聚合酶鏈式反應(yīng)方法檢測，而被當(dāng)作“桑黃”應(yīng)用的真菌種類多，區(qū)分難度大，僅依靠肉眼與顯微技術(shù)不足以完全準確區(qū)分，也可以采用這種方法加以鑒別.

2.2 化學(xué)鑒別

徐賓朋[26]采用薄層色譜法鑒別桑黃中的亮氨酸.參考《藥典》中菌物藥靈芝的標準，以活性成分——靈芝多糖作為含量檢測項目，以半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖為對照品進行薄層鑒別.《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范(2019年版)》[27]中對桑黃進行了原兒茶醛和亮氨酸薄層鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑黃多糖成分為其重要的活性物質(zhì)[28]，根據(jù)多糖理化性質(zhì)[29]可以對其中的葡萄糖、甘露糖、半乳糖進行薄層鑒別.由于桑黃來源廣泛，在進行薄層鑒別時，應(yīng)有桑黃對照藥材參與試驗.

2.3 水分、灰分、浸出物限定

《藥典》中，水分、灰分是中藥質(zhì)量控制的一項重要指標，如果水分、灰分超標，不僅會影響中藥飲片質(zhì)量和中藥制劑穩(wěn)定性，也會影響性狀、浸出物、含量等檢驗結(jié)果.陜西省地方標準(2018)[30]中桑黃的水分限定不高于13%，灰分不高于3.50%；《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范(2019年版)》[27]規(guī)定桑黃的水分不得超過16.0%，總灰分不得超過4.0%，酸不溶性灰分不得超過2.5%.對照《藥典》，部分藥材因指標性成分不清或含量很低，尚無精確測量的定量方法，需要測定浸出物含量.目前，除鄧改改等[31]在忍冬木層孔菌質(zhì)量標準研究中對忍冬桑黃的浸出物進行過測定外，尚未見關(guān)于其他桑黃浸出物含量測定的研究.

2.4 農(nóng)藥殘留、重金屬及有害元素限定

周蔓[24]對不同野生桑黃子實體中的Pb、Cu進行了測定，結(jié)果見表2；《藥典》中關(guān)于植物類以及冬蟲夏草的重金屬及有害元素限量：ω(Pb)不超過5 mg/kg、ω(Cd)不超過1 mg/kg、ω(As)不超過2 mg/kg、ω(Hg)不超過0.2 mg/kg、ω(Cu)不超過20 mg/kg.由表2可知，桑黃樣品安全性較好，可為桑黃質(zhì)量標準制定提供參考.陜西省地方標準[30]對桑黃干品的農(nóng)藥殘留、重金屬及有害元素限定見表3.暫未發(fā)現(xiàn)桑黃中蓄積某種生物毒素.無論野生品種桑黃還是栽培品種桑黃生長周期均較長，應(yīng)對其農(nóng)藥殘留及重金屬進行監(jiān)測，以保證用藥安全.

表2 桑黃子實體中Pb、Cu含量[24]Tab.2 Contents of Pb and Cu in the fruiting body of Sanghuang mushrooms /(mg·kg-1)

表3 桑黃干品的農(nóng)藥殘留、重金屬及有害元素限定[30]Tab.3 Limits of pesticide residues，heavy metals and harmful elements in dried Sanghuang mushroom ω/(mg·kg-1)

2.5 活性成分含量測定方法

目前，桑黃活性成分含量測定多集中在多糖、總黃酮、三萜、多酚[30-33].壽旦[34]采用高速逆流色譜法從桑黃提取液中制備出名為inoscavin A和Hypholomine B的2個單體成分，建立了含量測定方法，并成功應(yīng)用于桑黃樣品檢測；鄧改改等[31]選擇麥角甾醇過氧化物和3，4-二羥基芐叉丙酮作為忍冬木層孔菌質(zhì)量標準的特征性成分進行含量測定；《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范(2019年版)》[27]以麥角甾醇含量為指標，采用高效液相色譜法進行含量測定；李慶杰[35]從寄生于蒙古黃榆的粗毛纖孔菌中自制phelligridin D為對照品，建立了phelligridin D含量測定方法，同時建立了指紋圖譜，結(jié)果表明，指紋圖譜法穩(wěn)定可行，可有效鑒別粗毛纖孔菌.目前，尚沒有一種公認的桑黃活性成分可對其進行質(zhì)量評價，因此，應(yīng)更多地結(jié)合藥理作用研究加以確認，并判斷是否具有專屬性.在桑黃單一活性成分評價得到學(xué)界認可前，可對不同品種桑黃進行特征指紋圖譜研究，結(jié)合多指標成分定量分析，增加桑黃作為中藥的質(zhì)量整體可控性與可行性.

2.6 桑黃炮制

中藥炮制的作用主要是增效減毒，古籍文獻記載和現(xiàn)代研究證明桑黃無毒副作用.張赫男等[36]利用小鼠急性毒性試驗和遺傳毒性試驗考察了桑樹桑黃子實體粉的毒性，結(jié)果表明，桑樹桑黃子實體粉基本無毒性.《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范(2019年版)》[26]中桑黃的炮制方法：取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，潤軟，切厚片，干燥，篩去碎屑；桑黃味甘、辛、微苦，寒，考慮可蜜炙或炒制，以緩和苦寒藥性，同時補益脾胃.除此，暫未發(fā)現(xiàn)關(guān)于桑黃炒制、炙制等其他炮制工藝的研究與標準.

3 桑黃質(zhì)量標準制定建議

目前，有關(guān)桑黃的質(zhì)量標準并不多.頒布桑黃子實體質(zhì)量標準的省份有安徽[27]、陜西[30]、甘肅[37]，有的桑黃栽培、銷售企業(yè)參照國家農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準NY/1676—2008[38]對桑黃進行質(zhì)量控制，浙江、吉林等桑黃產(chǎn)業(yè)大省正在加快制定桑黃中藥材標準.隨著桑黃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，應(yīng)盡快建立國家級的桑黃質(zhì)量標準.不僅要建立企業(yè)控制標準，也需要建立行業(yè)標準，通過建立各級標準，統(tǒng)一進行桑黃質(zhì)量控制，為桑黃國家級質(zhì)量控制標準制定做準備.

只有開展標準化、規(guī)范化栽培，才能更加準確地對桑黃進行標準化的質(zhì)量控制.江蘇、黑龍江、陜西、吉林等省份相繼頒布了桑黃栽培技術(shù)規(guī)范標準[39-42](見表4)，為桑黃的標準化栽培奠定了基礎(chǔ).根據(jù)中藥材標準“習(xí)用”的要求，可考慮將廣泛栽培的楊樹桑黃作為桑黃質(zhì)量標準中的桑黃來源之一，以保證藥材的道地性以及資源利用的可持續(xù)性.

表4 桑黃栽培技術(shù)規(guī)范Tab.4 Standard formulation and implementation of Sanghuang mushroom

3.1 科學(xué)選擇桑黃基源

2019年10月29日，中國菌物學(xué)會桑黃產(chǎn)業(yè)分會在2019年工作會議上提出了桑黃屬拉丁名統(tǒng)一用Sanghuangporus，并通過學(xué)會及《菌物學(xué)報》發(fā)布[43].雖然主流觀點認為桑黃基源物種為桑黃孔菌屬種類，但樺樹桑黃(Phellinusigniarius(L.)Quél)、松木層孔菌(Phellinuspini(Brot.)Pilát)、落葉松木層孔菌(Phellinuslaricis(Jacz.ex Pilát))、亞馬木層孔菌(Phellinusyamanoi(Imazeki)parmasto)、哈爾蒂木層孔菌(Phellinushartigii(Allesch.& Schnabl ) Bo ndart sev)等種類在民間也當(dāng)作桑黃使用[4]，有必要進行相應(yīng)的藥理、藥效及安全性研究，進而明確這些種類的利用前景.

作為藥品，桑黃加入國家藥典或部頒標準、行業(yè)標準需解決品種混亂的問題，建議遵循兩條原則篩選法定品種：1)明確樣品生物學(xué)來源.在進行藥理活性研究、質(zhì)量評價與控制、生態(tài)栽培、功能產(chǎn)品研制時都應(yīng)確定生物學(xué)分類，結(jié)合性狀描述、顯微鑒別、分子生物學(xué)手段開展研究，如將DNA條碼列入桑黃標準，既可拓展現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)在中藥標準方面的應(yīng)用，也有利于嚴格控制桑黃質(zhì)量.2)明確活性成分及藥理作用.應(yīng)推進功能性成分研究，建立相關(guān)檢測方法，結(jié)合古籍與現(xiàn)代研究成果、藥用療效，根據(jù)活性成分和藥理研究數(shù)據(jù)篩選桑黃入藥種類.

3.2 嚴格考量桑黃發(fā)酵產(chǎn)品

桑黃發(fā)酵產(chǎn)品可作為中藥材或生物、化學(xué)制品應(yīng)用，發(fā)酵過程具有時間短、見效快等優(yōu)點，但其中的活性物質(zhì)與傳統(tǒng)應(yīng)用的桑黃子實體是否一致，有待論證.同時，發(fā)酵過程容易發(fā)生染菌等污染，應(yīng)嚴格對發(fā)酵產(chǎn)品進行相關(guān)微生物和毒素類考察與限定.

3.3 充分考慮桑黃道地性

桑黃野生資源急劇減少，生態(tài)栽培是桑黃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ).只有規(guī)范生產(chǎn)栽培技術(shù)，才便于建立行之有效的質(zhì)量控制標準.目前，桑黃來源不一，因地理氣候等原因，南北栽培技術(shù)也不同，可根據(jù)各地模式化栽培情況進行區(qū)域化統(tǒng)一，執(zhí)行行業(yè)標準，如可參考《藥典》中南五味子、北五味子進行桑黃“南北”區(qū)分.

3.4 注重前瞻性、實用性和代表性

作為單一方劑，桑黃可視為藥材進行質(zhì)量控制，同時也可作為方劑中的一味藥材進行質(zhì)量控制，如《圣惠》卷中的白礬丸、《六十圣濟總錄》卷的補益桑黃丸，均是將桑黃作為方劑中的一味藥材.但目前暫未發(fā)現(xiàn)市場中有此兩味丸劑的中成藥，相信隨著桑黃應(yīng)用的不斷深入，含有桑黃的中成藥可能會陸續(xù)出現(xiàn)在我國醫(yī)藥市場.因此，有關(guān)桑黃質(zhì)量標準的研究應(yīng)具有前沿性、實用性和代表性，只有這樣，才能更加科學(xué)地對桑黃及其中成藥進行質(zhì)量控制.