外泌體在肺癌診斷及治療中的應(yīng)用前景

王麗 顧巖

肺癌是我國最常見惡性腫瘤。據(jù)我國2019年1月，國家癌癥中心發(fā)布的最新全國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，發(fā)病率和死亡率位居首位的仍是肺癌[1]。肺癌起病隱匿，多數(shù)患者首次就診時(shí)已處于中晚期，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)。肺癌病理類型中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)最常見，約占80%～85%。Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后5年生存率可達(dá)80%, 而晚期患者術(shù)后5年生存率僅為15%左右, 且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[2]。因此高效的肺癌診斷標(biāo)志物，是患者得到早期診斷、及時(shí)治療、改善生活質(zhì)量、延長患者生存期的有效途徑。近年來多項(xiàng)研究表明，外泌體作為細(xì)胞間生物信息媒介，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了在診斷和治療方面的價(jià)值。本文著重從外泌體在肺癌診斷、治療方面的作用進(jìn)行綜述。

外泌體概述

一、外泌體形成及其生物成分

外泌體(exosomes EXs)是組織細(xì)胞分泌的直徑約40～160 nm納米級脂質(zhì)雙膜層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外多囊泡體(extracellular vesicle MVB)。主要指由細(xì)胞膜內(nèi)陷，起源于內(nèi)小體的多囊泡體稱為exosomes，即外泌體,而由胞膜出芽方式分泌的囊泡，如微粒、微囊泡和大囊泡稱為Extosomes[3]。EXs最初細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體與細(xì)胞器相互作用，進(jìn)一步形成管腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicle，ILV)，ILV進(jìn)一步成熟形成 MVBs[4]。MVB一部分與細(xì)胞膜融合以胞吐方式釋放外泌，另一部分被溶酶體降解，還有一部分經(jīng)胞內(nèi)高爾基體再循環(huán)[5]。

外泌體含有多種生物活性物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等。核酸包括：信使RNA(mRNA)、非編碼RNA(miRNA、lncRNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)等。脂質(zhì)成分主要含有磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、膽固醇[6]。蛋白質(zhì)成分最為豐富，如整合素和四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD8)、熱休克蛋白(如Hsp70、Hsp84)、Rab蛋白、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(ALix)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、膜融合蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)等參與外泌體形成和分泌[3，7]。

二、外泌體細(xì)胞間通訊

外泌體攜帶其活性物質(zhì)由細(xì)胞分泌到胞外，通過多種機(jī)制，進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生生物效應(yīng)，改變受體細(xì)胞的生理病理狀態(tài)。外泌體可經(jīng)自身表面蛋白分子,直接與靶細(xì)胞膜融合，也可以通過受體-配體介導(dǎo)的各種信號通路(MAPK/MAP、mTOR、TGFR-β)進(jìn)入靶細(xì)胞[8]；而受體細(xì)胞通過網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用(clathrin-independent endocytosis，CIE)和巨胞飲作用(micropinoc-ytosis，MP)主動從其周圍環(huán)境中的攝取外泌體[3-4，9]。EXs進(jìn)入靶細(xì)胞后，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞基因表達(dá)及功能。EXs通過上述途徑參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移侵襲、血管生成、免疫抑制、耐藥等促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。

外泌體在肺癌的診斷中的作用

外泌體因有脂質(zhì)雙層膜分子結(jié)構(gòu)保護(hù)，其內(nèi)容物(蛋白質(zhì)、miRNA)可保持穩(wěn)定存在，研究顯示EXs在4℃, -20℃及-80℃條件下可保存3月至5年的時(shí)長[10]。腫瘤細(xì)胞分泌的EXs含有特異性蛋白質(zhì)和核酸，能確切反映親代細(xì)胞特征。EXs廣泛存在于機(jī)體各種體液中，如血漿、唾液、淚液、尿液、羊水、支氣管灌洗、腦脊液、腹腔液、胸腔積液和精液等[11]。EXs與活組織檢查相比較，具有微創(chuàng)、取材方便、低風(fēng)險(xiǎn)、低成本，且能實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤動態(tài)等優(yōu)勢，具有成為新型腫瘤標(biāo)志物的潛力。

一、外泌體miRNA

肺癌患者和健康個(gè)體的組織和外周循環(huán)中外泌體miRNA表達(dá)譜不同，因而外泌體miRNA對肺癌早期診斷具有潛在的臨床價(jià)值。Rabinowits等[12]對肺腺癌患者血漿外泌體研究，結(jié)果顯示肺腺癌組的平均外泌體濃度為2.85 mg/mL(95%CI: 1.94～3.76)，對照組0.07 mg/mL (95%CI: 0.68～0.86)；肺腺癌組的平均外泌體miRNA 濃度為158.6 ng/mL (95%CI: 145.7～171.5) ，明顯高于對照組68.1ng/mL( 95%CI: 57.2～78.9)，差異表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，并且證實(shí)了周圍循環(huán)外泌體miRNA與腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體imRNA結(jié)構(gòu)極為相似，認(rèn)為循環(huán)中外泌體miRNA在肺癌患者和對照組中的差異表達(dá)有助于肺癌篩查。Grimolizzi等[8]研究中納入45例NSCLC患者和31例健康個(gè)體，分別檢測早期NSCLC、晚期NSCLC和健康對照組的血清、外泌體、無外泌體血清中的miRNA-126，發(fā)現(xiàn)晚期NSLCL患者血清miRNA-126水平顯著下調(diào)。分析miRNA-126的分布情況，NSCLC的miRNA-126主要存在于外泌體中，且晚期NSCLC患者外泌體中miRNA-126水平更高，而健康對照組miRNA-126在血清和外泌體中分布均勻。評估血清miRNA-126和外泌體miRNA-126在肺癌診斷效能，受試者操作特征曲線分析(ROC)結(jié)果提示，外泌體miRNA-126的診斷肺癌的準(zhǔn)確性更高。將NSCLC細(xì)胞來源外泌體與非腫瘤性上皮細(xì)胞(BEAS-2B)和內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育，觀察到NSCLC外泌體可使BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和血管生成。NSCLC細(xì)胞(A549)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體(富含miRNA-126)共同孵育，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞中miRNA-126水平明顯升高，抑制A549細(xì)胞的增殖。表明NSCLC外泌體miRNA-126可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞血管形成和惡性轉(zhuǎn)化，正常內(nèi)皮細(xì)胞來源外泌體miR-126抑制NSCLC細(xì)胞的生長。發(fā)現(xiàn)miRNA-21也有促進(jìn)腫瘤血管生成和惡性轉(zhuǎn)化的作用，通過激活STAT3基因，增加受體細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平?？梢姡饷隗wmiRNA-126、miRNA-21作為肺癌的診斷性生物標(biāo)志物和治療方法具有重要的應(yīng)用前景。Zhang等[13]分析172名NSCLC患者和137名健康志愿者血清外泌體，發(fā)現(xiàn)miR-17-92家族中miR-17-5p在NSCLC患者血清中顯著上調(diào)(P<0.001)，其診斷效能評估,曲線下面積( AUC)值 0.746 (95%CI=0.677～0.806), 敏感度70.0%，特異度82.2%。外泌體miR-17-5p聯(lián)合3種腫瘤標(biāo)志物(癌胚抗原，CEA；細(xì)胞角蛋白片段19，CYFRA21-1；鱗狀細(xì)胞癌抗原，SCCA)診斷效能明顯高于單個(gè)miR-17-5p診斷結(jié)果，其AUC為0.860 (95%CI=0.802～0.906), 敏感度63.0% ，特異度93.3%，同時(shí)觀察到高水平的miR-17-5p與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，因此miR-17-5p可用于肺癌輔助診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。有學(xué)者在外泌體促進(jìn)塵肺患者癌變的研究中納入了54例塵肺患者和100例健康個(gè)體，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析(RT-qPCR)方法檢測塵肺血清中外泌體，發(fā)現(xiàn)塵肺患者組外泌體let-7a-5p表達(dá)水平比健康對照組降低了21.67%，并在let-7a-5p中檢測到BCL2L1、IGF1R基因在肺癌中表達(dá)上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。BCL2L1基因高表達(dá)降低患者生存率HR (95%CI)=1.75(1.33～2.30)，而IGF1R基因表達(dá)對生存期無明顯影響 HR (95%CI) =0.79(0.62～1.02)。因而認(rèn)為外泌體let-7a-5p通過調(diào)控BCL2L1靶基因促進(jìn)塵肺患者的癌變。let-7a-5p、BCL2L1基因表達(dá)水平可用于肺癌早期診斷和預(yù)后監(jiān)測[14]。此外，Kanaoka等[15]采用miRNA微陣列法分析6例NSCLC患者中復(fù)發(fā)者的血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)miR-451a表達(dá)量顯著高于無復(fù)發(fā)及健康對照組。分析另外285例NSCLC患者(178例Ⅰ期、59例Ⅱ期、48例Ⅲ期肺癌患者)血漿中miR-451a表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-451a表達(dá)水平隨疾病進(jìn)展而增加，且與疾病分期、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。miR-451a的上調(diào)可降低肺癌患者總生存率及無病生存率，表明外泌體miR-451a在肺癌發(fā)展中起著促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)質(zhì)粒將miR-451a載入NSCLC細(xì)胞系中可通過下調(diào)RAS相關(guān)蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此深入探究外泌體miRNA在肺癌中的差異表達(dá)及其作用機(jī)制，有利于肺癌早期診斷、預(yù)后監(jiān)測生物標(biāo)志物的開發(fā)和應(yīng)用。

二、外泌體蛋白

外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)含量最為豐富，在外泌體生物合成及細(xì)胞間信息傳遞中起著關(guān)鍵作用。在肺癌細(xì)胞來源外泌體蛋白質(zhì)，如表皮生長因子、脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)化生長因子-β、整合素(α6β4 、α6β1)、四跨膜蛋白(TSPAN8)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)(GRB2 、SRC)等，在肺癌中的差異表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤微環(huán)境形成、促血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等作用，在NSCLC診斷生物標(biāo)志物開發(fā)有重要的臨床意義。Sandfeld-Paulsen 等[16]分析431例肺癌患者和150例對照者血漿外泌體中的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)CD151、CD171和TSPAN8蛋白在肺癌患者中表達(dá)顯著高于正常對照組(P<0.001)，且能區(qū)分肺癌組織類型：CD151、CD171在肺腺癌中上調(diào)明顯，而CD151、TSPAN8蛋白在肺鱗癌中表達(dá)明顯，而在小細(xì)胞肺癌中CD151是唯一表達(dá)水平升高的蛋白標(biāo)志物。進(jìn)一步采用多種標(biāo)志物組合模型評估診斷肺癌的效能，結(jié)果顯示多種組合模型標(biāo)志物診斷肺癌的準(zhǔn)確率明顯優(yōu)于單一外泌體蛋白質(zhì)的診斷結(jié)果。Wang等[17]研究中納入89例轉(zhuǎn)移性NSCLC患者和94例NSCLC患者，分析肺癌細(xì)胞來源外泌體蛋白質(zhì)的診斷作用，首先從部分非轉(zhuǎn)移性NSCLC患者、轉(zhuǎn)移性NSCLC患者及健康個(gè)體中鑒定出628種蛋白質(zhì)，其中522種蛋白質(zhì)被量化，發(fā)現(xiàn)43種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)(34種上調(diào)，9種下調(diào))在NSCLC中具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能和轉(zhuǎn)移作用。其中脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)(lipopolysaccharidebind-ing proteins LBP)，在轉(zhuǎn)移性NSCLC患者外泌體中上調(diào)水平最明顯，是非轉(zhuǎn)移性肺癌外泌體中的含量高1.845倍，其診斷效能：曲線下面積(AUC):0.803，靈敏度為：83.1%，特異度為：67.9%。推測LBP是NSLCL轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因子。另外，有研究分析NSCLC患者和慢性肺炎患者外泌體，發(fā)現(xiàn)NSCLC組外泌體中表皮生長因子受體(EGFR)表達(dá)量是慢性肺炎組的4倍，進(jìn)一步研究肺癌來源外泌體攜帶的EGFR對樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)的影響，結(jié)果顯示，外泌體EGFR可誘導(dǎo)腫瘤特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)，抑制腫瘤抗原特異性CD8T細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[18]。EGFR也可激活腫瘤細(xì)胞MAPK和 Akt 信號通路，促進(jìn)腫瘤血管形成、促進(jìn)發(fā)生發(fā)展，為肺癌診斷及靶向治療提供可靠依據(jù)[19]。

綜上研究顯示外泌體miRNA、蛋白質(zhì)在肺癌的診斷、預(yù)后監(jiān)測等方面有巨大應(yīng)用價(jià)值，有望成為有效的肺癌診斷生物標(biāo)志物。

外泌體在肺癌的治療中的雙向作用

一、外泌體可引起腫瘤細(xì)胞耐藥性，促進(jìn)腫瘤發(fā)展

目前晚期肺癌的治療以化學(xué)、放射、分子靶向及免疫治療的綜合治療為主，但患者預(yù)后普遍較差，而治療中產(chǎn)生耐藥是治療失敗的重要原因之一。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Xiao等[20]研究發(fā)現(xiàn)順鉑(cisplatin，DDP)處理肺癌細(xì)胞(A549)后，富含miR-21的外泌體分泌量增加，將DDP處理的A549細(xì)胞與野生型細(xì)胞共同孵育，引起野生型細(xì)胞miR-21表達(dá)水平上調(diào)，并對DDP產(chǎn)生耐藥。NSCLC細(xì)胞miR-425-3p靶向作用于AKT1,上調(diào)腫瘤細(xì)胞自噬水平,降低NSCLC細(xì)胞對鉑類藥物的反應(yīng)性，而導(dǎo)致耐藥[21]。另有研究表明吉西他濱耐藥NSCLC細(xì)胞(A549-GR)分泌的外泌體攜帶miRNA-222-3p(GR-Exo)經(jīng)胞吞作用進(jìn)入吉西他濱敏感細(xì)胞(A549-P)，從而引起A549-P的耐藥。miRNA-222-3p通過直接靶向細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SCSO3)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[22]。外泌體還可以通過排除腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物引起腫瘤細(xì)胞的耐藥性。Luciani等[23]在研究質(zhì)子泵抑制劑對腫瘤細(xì)胞耐藥性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞通過分泌外泌體排除化療藥物(鉑類、阿霉素類)，而產(chǎn)生耐藥。腫瘤細(xì)胞來源外泌體可以改變腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。研究證實(shí)經(jīng)放療治療的NSCLC患者血清外泌體中miR-208a明顯上調(diào)，通過靶向P21基因和激活A(yù)KT/mTOR信號通路，降低NSCLC細(xì)胞對放射的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的G1期停滯[24]。有研究報(bào)道，吉非替尼耐藥的肺癌細(xì)胞分泌的外泌體富含miR-21，可引起吉非替尼敏感的細(xì)胞耐藥，認(rèn)為miR-21是引起耐藥的關(guān)鍵分子[25]?？梢妋iR-21不僅能引起常規(guī)化療藥物順鉑耐藥[26]，還能降低靶向藥物的治療效果。外泌體miRNA可通過多種方式介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

二、外泌體抑制腫瘤作用

近年來外泌體在肺癌治療方面的研究越來越多，認(rèn)為外泌體在肺癌的治療領(lǐng)域中有望為新的治療靶點(diǎn)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)可通過減少外泌體含量、調(diào)控特異性miRNA的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對藥物敏感性、提高抗腫瘤免疫等途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。以外泌體為靶點(diǎn)抑制腫瘤方式大致概括如下：①減少外泌體含量。有學(xué)者報(bào)道經(jīng)血液透析減少循環(huán)系統(tǒng)中外泌體含量，為抗腫瘤治療提供輔助作用[27]。Fabbri等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)給予肺癌小鼠注射外泌體抑制劑(GW4869)后，可抑制肺癌細(xì)胞增殖。②調(diào)控特異性外泌體的表達(dá)：Li等[29]證實(shí)耐紫杉醇肺腺癌細(xì)胞(A549/PTX)、順鉑耐藥肺癌細(xì)胞(A549/PTX)中mi R-181a過度表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞(A549)細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而抑制miR-181a表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)A549/PTX和A549/PTX細(xì)胞EMT表型，并增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對紫杉醇和鉑類化療敏感性。上調(diào)外泌體miR-630在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)，通過靶向LM03蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖及轉(zhuǎn)移[26]。③外泌體提高抗腫瘤免疫。樹突狀細(xì)胞來源外泌體，具有激活免疫細(xì)胞、殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)瘤細(xì)胞調(diào)亡作用。在一項(xiàng)Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中觀察到，22例對鉑類不敏感晚期NSCLC患者接受口服環(huán)磷酰胺聯(lián)合樹突狀細(xì)胞來源外泌體(皮下注射)，發(fā)現(xiàn)部分患者病情無進(jìn)展，且體內(nèi)NK細(xì)胞明顯被活化[30]。④增強(qiáng)藥物敏感性。Adi Harel等[31]研究證實(shí)，通過表觀修飾(DNA甲基化或組蛋白去乙酰化)激活miR-512和miR-373，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖遷移。外泌體miRNA也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對放射敏感，增強(qiáng)放射治療效果。外泌體miR-1246通過靶向死亡受體 5(DR5)來調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞對放射治療的敏感性[32]。⑤外泌體制劑，靶向腫瘤組織作用。Kim等[33]將紫杉醇(PTX)載入外泌體中制成外泌體紫杉醇制劑(exoPTX)，研究NSCLC中抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠?qū)⑺幬镒懔坑行У倪\(yùn)送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，并且對耐藥肺腫瘤有顯著治療效果。另有研究發(fā)現(xiàn),在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中載有雷公藤的外泌體制劑，對肺癌腫瘤的抑制作用明顯高于游離雷公藤的治療效果，且血液學(xué)及肝腎功能檢測表明無明顯毒副作用[34]。因此，肺癌相關(guān)外泌體的研究,將為肺癌精準(zhǔn)有效的治療方面提供新的思路。

小結(jié)和展望

目前肺癌篩查相關(guān)輔助檢查(低劑量胸部CT、腫瘤標(biāo)志物等)效率較低，而活組織檢查為侵入性檢查，風(fēng)險(xiǎn)高、并發(fā)癥多、無法進(jìn)行多次活檢，難以了解腫瘤動態(tài)變化。外泌體內(nèi)富含多種生物活性物質(zhì)，能確切反應(yīng)親代細(xì)胞特征，作為細(xì)胞間交流的重要媒介，可將其攜帶的生物活性物質(zhì)傳遞給受體細(xì)胞，改變受體細(xì)胞的生物學(xué)行為，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中有重要意義。肺癌細(xì)胞源外泌體所含特異性成分，在肺癌的診斷及治療中顯示出重要的臨床價(jià)值。外泌體存在于機(jī)體多種體液中，作為潛在的新型腫瘤標(biāo)志物，相對于傳統(tǒng)肺癌相關(guān)檢查，外泌體具有微創(chuàng)、取材方便、低風(fēng)險(xiǎn)、低成本，且能反復(fù)取樣，實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤動態(tài)等優(yōu)勢。外泌體為脂質(zhì)雙膜層結(jié)構(gòu)分子，作為潛在的新型藥物載體，具有低免疫原性、高生物相容性、低毒性等優(yōu)勢，直接靶向腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤治療?？傊?，肺癌細(xì)胞來源的外泌體在肺癌的診斷及治療中，有巨大的臨床價(jià)值。隨著對外泌體發(fā)生、細(xì)胞間信息傳遞機(jī)制的深入探究，相信外泌體將會在肺癌診斷及治療領(lǐng)域帶來良好的臨床應(yīng)用前景。

表1 外泌體在肺癌中的作用