梅建剛 綜述 余剛 審校

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科，重慶 400016

卒中是我國疾病負擔最高的疾病之一，約1/3的卒中患者在發(fā)病3個月或1年內死亡或仍遺留殘疾[1]。缺血性卒中(ischemic stroke)是主要的卒中類型，有限時間窗內的靜脈溶栓及機械取栓等血管內再通治療是改善預后的關鍵。溶栓或取栓并非總是可及；并且接受溶栓的患者中不到一半可實現(xiàn)早期再通[2]。開發(fā)新的治療手段，以改善缺血性卒中患者預后，任重道遠。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是有獨特抗微生物作用的中性粒細胞胞外結構，近些年NETs 相關的文獻報道數(shù)量幾乎呈爆炸式增長[3]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)NETs除了在感染性疾病中的作用，還與自身免疫疾病、動脈粥樣硬化、血栓形成、腫瘤等密切相關[4-5]。而NETs 與缺血性卒中的關系也得到了廣泛的研究；特別是NETs 形成并穩(wěn)定血栓的作用，以及降解NETs 以實現(xiàn)血栓溶解的治療潛能，已成為新興的研究熱點，可能成為新的治療靶點。故現(xiàn)就NETs與急性缺血性卒中相關研究綜述如下：

1 NETs概述

2004 年，BRINKMANN 等[6]發(fā)現(xiàn)并命名了NETs。它是由激活的中性粒細胞釋放到胞外的網(wǎng)狀復合體，其骨架為染色質纖維，并被球形蛋白顆粒修飾。NETs骨架亦可源于線粒體DNA；蛋白顆粒含有組蛋白、多種蛋白酶及抗菌肽[5]。在不同研究中已經發(fā)現(xiàn)約27種NETs 相關蛋白，其中主要有中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、瓜氨酸化組蛋白3 (citrullinated histone 3，H3Cit)、H4Cit 和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等[7]。同時，這些蛋白、胞外DNA、核小體也成為檢測NETs 的標志物。觸發(fā)NETs 形成的物質包括細菌、真菌等微生物，免疫復合物以及活化的血小板、某些細胞因子等[3，8]。NETs 的形成過程復雜，涉及染色質解聚、核膜和質膜的破裂、MPO 與NE 介導的組蛋白裂解、組蛋白的瓜氨酸化修飾等步驟[9]。NETs 的網(wǎng)狀結構可誘捕、固定病原體，顆粒中的分子則有抗微生物作用；而NETs 相關的組蛋白、NE、MPO、DNA等具有細胞毒性或免疫原性，當NETs過度積聚時，可引發(fā)宿主局部或全身病理改變[10]。

2 NETs在缺血性卒中中的作用

2.1 動脈粥樣硬化疾病及動脈血栓形成中的NETs頭頸部動脈粥樣硬化和動脈血栓形成是急性缺血性卒中的重要病因。從人頸動脈內膜切除術得到的粥樣斑塊經組織免疫染色顯示，NETs標志物包括胞外DNA、NE、H4Cit 與中性粒細胞標記物CD66b 共同定位于斑塊中，證實NETs 存在于人頸動脈粥樣斑塊內[11-12]。動物實驗顯示，在動脈粥樣硬化病變中，膽固醇晶體和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是誘導NETs形成的關鍵[13]。NETs通過多種途徑促進動脈粥樣硬化。其一，NETs能激活巨噬細胞釋放多種細胞因子，導致免疫細胞的募集增加，從而加重動脈壁炎癥反應[14]，促進動脈粥樣硬化形成與進展。其二，中性粒細胞可被粥樣硬化病變中活化的平滑肌細胞吸引、誘導釋放NETs；而NETs 中的組蛋白H4 (H4Cit)則引起組織損傷，結合并溶解平滑肌細胞，從而導致動脈斑塊不穩(wěn)定[15]。其三，在富含平滑肌細胞的斑塊中，NETs 還可以通過Toll 樣受體-2 及補體依賴途徑誘導氧化應激和內皮細胞凋亡，使斑塊遭到侵蝕，出現(xiàn)糜爛[12]。同時，對人頸動脈組織的研究也發(fā)現(xiàn)，NETs 主要出現(xiàn)在淺表糜爛的斑塊中，而不是富含脂質的斑塊或易破裂的斑塊中[11-12]。其四，NETs 中的組織蛋白酶G 還可協(xié)同IL-1α促進內皮細胞活化，增加組織因子的表達及其活性[16]。NETs 導致斑塊的失穩(wěn)以及內皮功能改變，不僅促進了動脈粥樣硬化進展，而且增加了斑塊并發(fā)血栓的風險[11，16]。 除了對斑塊及內皮的作用，NETs 還可以通過其他途徑促進血栓形成。首先，NETs 的染色質骨架為多種血栓前成分，如血小板、紅細胞、纖維蛋白、von Willebrand因子，提供了附著與相互作用的平臺，從而促進血栓形成[8]。其次，一方面，NETs 通過自身復雜的組分直接或間接激活并聚集血小板；另一方面，激活的血小板還刺激中性粒細胞釋放NETs，從而形成促凝血循環(huán)[13]。而NETs 的促凝作用最終可以導致動脈閉塞。對頸內動脈急性閉塞的患者研究也提示，病變部位高凝環(huán)境形成與NETs 密切相關[17]；在小鼠頸動脈閉塞的模型中，予以組蛋白-DNA抗體拮抗NETs，還可以延遲頸動脈閉塞和需要血流重建時間[18]。

2.2 NETs與繼發(fā)性微血管血栓形成在短暫性大腦中動脈閉塞的小鼠模型中[19]，動脈閉塞即刻引起了下游微血管白細胞相關血栓形成和血腦屏障破壞，進而引發(fā)微血管血栓炎癥反應，導致再通后不完全再灌注。而使用能夠降解NETs 骨架的DNase1 (脫氧核糖核酸酶1)能顯著改善模型預后；輸注NETs的組分-組蛋白則有相反作用[20]。據(jù)此，有學者推測，NETs 形成導致了大動脈閉塞后繼發(fā)性微血栓形成[21]，進而出現(xiàn)缺血組織再灌注延遲和無復流[22]。

2.3 NETs 在卒中后神經炎癥中的作用NETs還影響了卒中后的免疫細胞浸潤、血腦屏障受損及神經元死亡等神經炎癥環(huán)節(jié)。

2.3.1 NETs與免疫細胞浸潤動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，對不同NETs形成環(huán)節(jié)的抑制，可減輕缺血損傷后的炎癥反應。如使用全反式維甲酸抑制STAT1 信號通路，可減少NETs 形成，下調病灶中性粒細胞的積聚，并減少梗死體積，改善功能預后[24]。 使用Cl-amidine 抑制NETs 形成關鍵酶肽基精氨酸脫亞胺酶4，可以延遲免疫細胞浸潤，并顯著減輕血管損傷[25]，有助于新生血管生成及血管重塑，進而促進功能恢復[26]。

2.3.2 NETs 與血腦屏障受損人體尸檢發(fā)現(xiàn)，NETs 標志物MPO 和NE 陽性細胞共同存于急性腦梗死患者缺血腦組織及血管周圍間隙[22]。在急性缺血性卒中小鼠中，可見梗死半球從毛細血管管腔、血管周圍間隙及腦實質的中性粒細胞浸潤，伴有CitH3陽性、染色質解聚以及DNA和組蛋白的胞外投射等NETs形成特征；同時，在維持血腦屏障完整性的周細胞[23]周圍觀察到了NETs樣結構，從而提示NETs可能參與了血腦屏障的損傷。

2.3.3 NETs與神經元死亡體外實驗則發(fā)現(xiàn)，神經元遭到缺血損傷或死亡可促進NETs 形成，而NETs又能增加神經元的死亡，從而形成惡性循環(huán)[25，27]；在這一循環(huán)中，超急性期受損腦組織釋放到胞外的細胞因子——高遷移率族蛋白1 (HMGB1)不僅可以觸發(fā)NETs形成，還可作為NETs的一部分，介導神經元死亡[25]。

2.4 NETs與中風后免疫抑制卒中后出現(xiàn)了全身的免疫抑制，這被認為是減輕神經炎癥以保護大腦的反應，但也增加了卒中后的感染風險[28]。而中性粒細胞釋放NETs 能力的減弱，也可能是導致卒中后免疫抑制的原因之一[29]。卒中后升高的應激激素—兒茶酚胺和糖皮質激素介導了卒中后的免疫改變[30]。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺和地塞米松抑制了健康受試者來源的中性粒細胞釋放NETs，并且NETs 釋放的減少可能與胞內參與形成NETs 的MPO 水平降低相關[31]。RUHNAU 等[29]則證實，與健康組相比，卒中患者外周血中性粒細胞在受刺激后產生的NETs水平在發(fā)病后第一天存在短暫的下降，在第5 天恢復正常。然而需要注意的是，雖然卒中后血漿NETs標志物，如血漿MPO、NE、DNA等顯著升高，但循環(huán)中的NETs水平的升高并不能直接降低感染的風險。因為NETs利用帶有高濃度抗菌分子的網(wǎng)狀結構局限并殺滅病原體，是在局部組織其起用的[6]。再者，血漿NETs 標志物水平升高還可能由中性粒細胞數(shù)量增加及NETs降解增多引起[31]。

3 NETs的潛在臨床價值

3.1 NETs與再通治療抵抗再通治療包括靜脈溶栓及機械血栓等動脈內介入治療。既往研究發(fā)現(xiàn)，血栓中高白細胞比例與大血管閉塞的卒中患者機械取栓更長的再通時間、更低的TICI 評分(thrombolysis in cerebral infarction score)和臨床預后密切相關[32]。而其實，中性粒細胞是血栓成分中最大的白細胞亞群[33]。最近的三項研究[5，33-34]分析了接受血管內治療卒中患者的血栓。組織學研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞和NETs 標志物廣泛存在于所有血栓中，而NETs標志物H3Cit陽性面積最高可占血栓截面總面積的13.45%[5]。其中兩項研究[33-34]分別以血栓組織切片中單位面積H3Cit 染色陽性的數(shù)量及血栓溶解后NETs標志物NE的濃度計算NETs含量；二者均發(fā)現(xiàn)，血栓中NETs含量與再通所需時間和取栓設備通過次數(shù)呈正相關。這表明NETs作為血栓的重要組成增加了取栓治療的抵抗。DNase1可溶解NETs 的DNA 骨架。PE?A-MAR-TíNEZ 等[2]發(fā)現(xiàn)，在富血小板血栓致小鼠卒中模型中，血栓形成后3 h分別予以賦形劑、tPA、DNase1，僅DNase1可有效促進血栓溶解，使閉塞血管再通，改善卒中預后。這提示NETs是富血小板血栓對tPA的抵抗原因，而DNase1能解除這類溶栓抵抗。體外實驗也證實，無論梗死類型如何，DNase1都能獨立顯著地溶解卒中患者新鮮血栓，比tPA 更加有效(兩者溶解比例75% vs 25%)；除此之外，DNase1還能加速tPA對卒中患者體外血栓的溶解[5，34]。而關于NETs 導致溶栓抵抗的機制研究如下：首先，此前的研究顯示，組蛋白-DNA復合物還會導致纖維蛋白變粗，改善其穩(wěn)定性和剛度，從而穩(wěn)定形成的血栓，使血栓對機械和酶的破壞更具抵抗力[35]。再者，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)腦動脈血栓具有一層厚而致密的外殼[36]；而相應的，組織學染色顯示，NETs在血栓外層尤為集中[34]；相對陳舊的血栓含有更多的中性粒細胞和NETs[5]。據(jù)此可推測，NETs 可能與血管壁相互作用進而導致取栓或溶栓抵抗。

3.2 循環(huán)NETs標志物的臨床相關性多項研究提示，與對照組相比，急性缺血性卒中患者的血液循環(huán)中NETs 標志物明顯升高，包括循環(huán)游離DNA(cf-DNA)、雙鏈DNA (DsDNA)、核小體和CitH3、DNA-組蛋白復合物[37-39]。另有研究顯示，出入院時的循環(huán)中NETs 標志物升高與卒中嚴重程度呈正相關；并且急性期citH3水平升高與一年內全因死亡率增加獨立相關[37，39]。但是這些標志物的臨床相關性研究尚存在矛盾，有待進一步研究。例如，在急性缺血性卒中患者中，JUANA 等[37]發(fā)現(xiàn)cfDNA、CitH3 等在年齡更高，伴有房顫、高血糖水平患者中顯著升高；而王歡[39]發(fā)現(xiàn)cf-DNA水平升高水平與年齡、血糖及房顫病史等因素無明顯相關性。

3.3 NETs 標志物與腫瘤相關缺血性卒中罹患腫瘤可導致全身高凝狀態(tài)，增加缺血性卒中風險，而這種風險在腫瘤得到有效診治前更高[40]。多項研究提示，NETs 對腫瘤相關缺血性卒的血栓形成有重要貢獻。對8 例惡性腫瘤伴轉移的卒中患者尸檢發(fā)現(xiàn)，H3Cit陽性微血栓廣泛存在于心、腦、肺的小動脈[41]，其中3 例腫瘤相關卒中患者為尸檢后診斷；尚有個案報道稱，H3Cit及上皮腫瘤標志物CK18共同存在于一例晚期前列腺癌的卒中患者腦小動脈微血栓中[42]。并且腫瘤相關缺血性卒中患者血漿H3Cit 水平顯著升高，并與凝血酶-抗凝血酶復合物和可溶性P-選擇素呈正相關[41]。類似的，另一研究則發(fā)現(xiàn)，NETs 標志物血漿DNA、核小體與D-二聚體水平獨立正相關，顯著高于健康對照組、腫瘤組對照組、卒中對照組；并且，血漿DNA水平升高還與腫瘤相關卒中獨立相關[43]。然而，PARK 等[44]分別研究了16 例活動性癌癥患者、16 例非活動性癌癥患者、16例無任何癌癥病史患者顱內血栓中的組織學特點，數(shù)據(jù)顯示，80%的血栓H3Cit 陽性，但并未發(fā)現(xiàn)H3Cit陽性分數(shù)的組間差異。出現(xiàn)組織學及血漿NETs 標志物臨床相關性研究矛盾的原因，或與腫瘤導致卒中的不同機制及各研究樣本量較小等因素相關[44]。故血漿NETs 標志物水平可能對腫瘤相關卒中具有鑒別意義，尚需進一步研究。

4 展望

綜上所述，NETs是缺血性卒中相關的動脈粥樣硬化、血栓形成、再通治療抵抗及卒中后神經炎癥等環(huán)節(jié)的重要參與者。其中，鑒于DNase1 溶解血栓的能力，可考慮將DNase1 作為急性缺血性卒中再通治療的藥物，做進一步研究；而針對不同NETs形成途徑的抑制劑或中和NETs 毒性成分的藥物，可作為潛在神經保護劑；NETs標志物對缺血性卒中患者臨床預后判斷也具有一定的潛能。同時，也需要注意目前研究的局限性，如大量研究為體外或動物模型實驗，不同的NETs 量化方式影響了不同研究的可比性。這些問題不僅為未來的研究提供了廣闊的空間，更提出了不小的挑戰(zhàn)。