呼寧寧,安瑞華

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，哈爾濱 150001)

膀胱癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，病死率較高，發(fā)病率逐年上升，根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的報(bào)告顯示，2018年全世界新發(fā)膀胱癌549 393例，死亡199 922例[1]，新發(fā)病例中70%～80%被診斷為非肌肉浸潤性膀胱癌[2-4]。盡管膀胱癌的治療經(jīng)歷了外科手術(shù)聯(lián)合術(shù)后膀胱灌注化療，但仍有高達(dá)50%的非肌肉浸潤性膀胱癌患者復(fù)發(fā)，而20%的患者在5年內(nèi)病情繼續(xù)進(jìn)展[5]。因此，迫切需要開發(fā)新的療法。自噬是一種基本的分解代謝過程，可以通過各種細(xì)胞應(yīng)激來激活該過程，包括營養(yǎng)剝奪、細(xì)胞器損傷、放化療等[6]。在癌癥發(fā)展的初始階段，自噬通過維持基因組完整性并防止癌細(xì)胞增殖，在抑制腫瘤方面發(fā)揮重要作用[7]。但在癌癥確定后，癌細(xì)胞可能會利用自噬在不利的微環(huán)境中抵抗細(xì)胞應(yīng)激[8]。此外，自噬被認(rèn)為是治療癌癥的“雙刃劍”?？拱┲委熣T導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)性自噬在癌細(xì)胞的耐藥過程中起重要作用。因此，自噬抑制可以增加癌細(xì)胞對抗癌治療的敏感性。相反，自噬促進(jìn)可能誘導(dǎo)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，稱為自噬細(xì)胞死亡[9]?，F(xiàn)就自噬調(diào)節(jié)在膀胱癌發(fā)展和治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 自噬調(diào)節(jié)與膀胱癌

目前，已有30多種自噬相關(guān)基因和同源蛋白被確定為自噬所必需的[10]。因此，響應(yīng)各種壓力的自噬激活會導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白[包括微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、Beclin1等]表達(dá)水平發(fā)生變化。LC3是自噬體形成的特定蛋白質(zhì)標(biāo)記。在類自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)8泛素結(jié)合系統(tǒng)中，LC3首先被ATG4(一種特定的半胱氨酸蛋白酶)裂解，從而暴露出C端半胱氨酸。隨后，LC3通過ATG7、ATG3與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，從而促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)LC3-Ⅰ向膜結(jié)合型LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化[11]。Ojha等[12]比較非肌肉浸潤膀胱癌患者的組織樣本與正常膀胱尿路上皮組織樣本發(fā)現(xiàn)，在高級別和低級別尿路上皮癌標(biāo)本中,作為自噬誘導(dǎo)標(biāo)志物的LC3均顯著升高,且在高級別尿路上皮癌標(biāo)本中升高更顯著。與正常的尿路上皮細(xì)胞相比,饑餓誘導(dǎo)的自噬在高級別和低級別尿路上皮癌中均更容易發(fā)生。當(dāng)膀胱癌組織暴露于自噬抑制劑,如磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3-kinase,PI3K)抑制劑、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或氯喹時(shí),在類似的饑餓條件下,高級別膀胱癌的細(xì)胞死亡率明顯高于低級別膀胱癌，表明在外部有害因素作用下,自噬對膀胱癌細(xì)胞起保護(hù)作用,且在高級別膀胱癌細(xì)胞中作用更加明顯。Beclin1是一種多域蛋白，可調(diào)節(jié)自噬和凋亡之間的相互干擾。Ⅲ類PI3K復(fù)合體已被確認(rèn)為調(diào)節(jié)自噬通量并平衡自噬和凋亡過程的重要信號樞紐。一方面,Beclin1依賴于Beclin1-PI3K催化亞基3型復(fù)合體促進(jìn)吞噬泡的聚集與組裝而參與自噬體的形成,另一方面,Beclin1與其他相關(guān)蛋白共同作用而調(diào)節(jié)自噬體的成熟。因此，Beclin1作為Ⅲ類PI3K調(diào)節(jié)亞基，在通過磷酸化和泛素化作用調(diào)節(jié)自噬中起重要作用[13]。王振龍等[14]采用分支DNA-液相芯片法檢測53例膀胱癌組織標(biāo)本和20例癌旁組織標(biāo)本中 Beclin1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，膀胱癌組織中Beclin1 mRNA的高表達(dá)率低于癌旁正常組織。提示在膀胱癌發(fā)生早期，細(xì)胞自噬可能被抑制，Beclin1 mRNA的高表達(dá)率與膀胱癌病理分級、生長方式、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后因素有關(guān)，腫瘤分化程度越低，Beclin1 mRNA高表達(dá)率越低。在惡性程度更高的膀胱癌(T2～4期)中，Beclin1 mRNA高表達(dá)率更低。李飛[15]采用免疫組織化學(xué)法研究Beclin1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)，表明在膀胱癌發(fā)展惡化過程中Beclin1基因表達(dá)起重要作用。可見,自噬調(diào)節(jié)與膀胱癌密切相關(guān)。因此,利用細(xì)胞自噬研發(fā)新型藥物將極大地促進(jìn)膀胱癌預(yù)防與治療策略的改進(jìn)與發(fā)展。

2 自噬調(diào)節(jié)在膀胱癌治療中的作用

在腫瘤形成過程中，自噬通過維持基因組完整性并防止癌細(xì)胞增殖而在抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用[7]。Zhu等[16]研究證明,ATG7在侵襲性膀胱癌中明顯過表達(dá)，這種蛋白的敲低能夠顯著抑制膀胱癌的侵襲，提示ATG7可能參與膀胱癌的發(fā)育調(diào)控。自噬在癌癥治療中具有雙重作用：一方面，抑制自噬可以增加化療和放療等治療的細(xì)胞毒性作用[17-19]；另一方面，自噬的過度激活可能導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡，也稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，與細(xì)胞凋亡相似，被定義為在溶酶體存在下的細(xì)胞死亡[19-24]。因此，為了開發(fā)新的治療藥物，確定自噬在癌細(xì)胞中的作用至關(guān)重要。

2.1抑制膀胱癌的保護(hù)性自噬 外科手術(shù)結(jié)合膀胱灌注化療藥物是降低膀胱癌患者腫瘤復(fù)發(fā)率的常規(guī)治療。然而，盡管進(jìn)行了有效的治療，大多數(shù)患者仍然經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)并最終因腫瘤轉(zhuǎn)移而死亡[25]。預(yù)后不良通常歸因于對各種治療干預(yù)措施的抵抗力。研究表明，癌細(xì)胞可以通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗藥性，包括細(xì)胞內(nèi)在和外在因素，如遺傳異質(zhì)性[26]、自噬[27]、腫瘤微環(huán)境[27]和癌癥干細(xì)胞因子[28]。此外，自噬可以通過提供細(xì)胞能量需求并在低氧、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞因子釋放等應(yīng)激條件下防止細(xì)胞毒性來影響腫瘤的微環(huán)境。此外，自噬可能通過促進(jìn)干細(xì)胞的維持而影響腫瘤干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[29]。大量研究表明，通過多種途徑抑制保護(hù)性自噬的方法包括藥物抑制劑[17，19，30-31]、RNA干擾劑[30，32]和天然生物活性化合物[33-34](表1)，能夠提高膀胱癌對治療干預(yù)措施的敏感性。

2.1.1自噬抑制劑氯喹 氯喹是一種抗瘧疾藥物，是抑制自噬的最常用和最有效的藥物。目前氯喹及其衍生物羥氯喹是美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的唯一臨床可用的自噬抑制劑[35]。氯喹及其衍生物羥氯喹是弱親脂性堿基，具有在溶酶體中積累的能力，從而增加了溶酶體的pH值。隨后，溶酶體的堿化作用阻止其與自噬體融合，并使溶酶體酸性蛋白酶失活，從而防止自身溶酶體中的貨物降解。研究表明，氯喹介導(dǎo)的溶酶體功能障礙可使癌細(xì)胞對化療和放療敏感，從而增強(qiáng)這種治療方法的抗癌作用。一項(xiàng)氯喹聯(lián)合順鉑處理膀胱癌細(xì)胞的研究表明，自噬的抑制作用增強(qiáng)了順鉑的細(xì)胞毒性[19]。另一項(xiàng)研究揭示了相同的結(jié)果，即使用氯喹抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬可顯著增加膀胱癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，從而增強(qiáng)其細(xì)胞毒性[30]。上述研究表明，順鉑可誘導(dǎo)自噬作為膀胱癌細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制，而抑制自噬可顯著增強(qiáng)順鉑耐藥細(xì)胞的化學(xué)敏感性。

2.1.2自噬抑制劑3-MA 3-MA是Ⅲ類PI3K抑制劑。PI3K是脂質(zhì)激酶的多樣化家族，在細(xì)胞過程中起重要作用，包括細(xì)胞增殖、代謝和自噬調(diào)節(jié)[36-37]。Ⅲ類PI3K是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中三類PI3K之一，是自噬的激活劑，在自噬體形成早期階段起重要作用。Fan等[31]進(jìn)行了一項(xiàng)研究，旨在評估防己堿(一種在Stephania tetrandra中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物)對膀胱癌的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示，防己堿能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞自噬和凋亡，3-MA抑制自噬可導(dǎo)致防己堿誘導(dǎo)的凋亡增強(qiáng)，胱天蛋白酶(caspase)-3的分裂增加是明顯的證據(jù)[31]。上述研究表明，保護(hù)性自噬的抑制可以增強(qiáng)抗癌藥物的凋亡率。

2.1.3針對RNA干擾 近年來已經(jīng)進(jìn)行了越來越多的針對RNA干擾的研究，以進(jìn)一步探索保護(hù)性自噬抑制作用對抗癌治療的影響。Kang等[32]證明通過禁用ATG12(自噬體形成和完成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄基因之一)對自噬的遺傳抑制能夠增強(qiáng)表皮生長因子受體抑制劑對膀胱癌細(xì)胞的抗癌作用。將siRNA轉(zhuǎn)染到膀胱癌細(xì)胞中通過阻斷ATG12抑制自噬。隨后，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用表皮生長因子受體抑制劑拉帕替尼或吉非替尼處理，流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，與表皮生長因子受體抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，ATG12-siRNA抑制自噬協(xié)同增加凋亡細(xì)胞死亡，表明自噬是膀胱癌細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制[32]。此外，Lin等[30]將自噬抑制劑短發(fā)夾RNA為基礎(chǔ)的慢病毒與順鉑結(jié)合，證明利用短發(fā)夾RNA通過敲除ATG7/ATG12或Beclin1來抑制自噬，能夠協(xié)同增強(qiáng)順鉑對膀胱癌5637和T24細(xì)胞的抗癌能力。結(jié)果表明，短發(fā)夾RNA抑制自噬可增加順鉑誘導(dǎo)的凋亡，這可通過caspase-3裂解的增強(qiáng)來證明，表明順鉑與自噬抑制劑的組合能夠增加膀胱癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，從而增強(qiáng)這種化療藥物的細(xì)胞毒性[30]?？傊?，自噬已被確定為導(dǎo)致癌癥治療耐藥性的關(guān)鍵機(jī)制。此外，自噬被認(rèn)為是與常規(guī)療法結(jié)合的涉及自噬抑制劑療法的潛在靶標(biāo)。保護(hù)性自噬的抑制可能增加膀胱癌對化療或放療的敏感性，為癌癥治療過程中自噬的有效調(diào)節(jié)提供重要信息。

2.2膀胱癌自噬細(xì)胞死亡的激活 自噬在癌癥治療中起雙重作用，除細(xì)胞保護(hù)性自噬外，細(xì)胞毒性自噬是細(xì)胞自噬的另一種主要形式，可單獨(dú)或與凋亡相關(guān)聯(lián)地促進(jìn)細(xì)胞死亡。從功能上分析，細(xì)胞毒性自噬能夠減少活細(xì)胞的數(shù)量和(或)降低治療后的克隆形成存活率[38]。Gewirtz[38]推測自噬在癌癥治療中的雙重作用可能與自噬機(jī)制的特定信號通路和(或)底物有關(guān)。此外，高自噬水平可能會誘發(fā)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，這也稱為自噬細(xì)胞死亡[20]?；谶@一概念進(jìn)行了多項(xiàng)研究，以探討自噬細(xì)胞死亡在不同癌癥治療領(lǐng)域的治療潛力。在膀胱癌中，帕唑帕尼的化學(xué)療法[21]、氟利昂堿氟化物的生物療法[22]和替代療法[23-24,39]均發(fā)現(xiàn)自噬細(xì)胞死亡(表2)。

2.2.1血管內(nèi)皮生長因子 在抗血管生成劑中，我國自主研發(fā)的靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2的抑制劑阿帕替尼可競爭性結(jié)合該受體胞內(nèi)酪氨酸ATP結(jié)合位點(diǎn)，高度選擇地抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2酪氨酸激酶活性，阻斷血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤血管生成[40]。靶向血管內(nèi)皮生長因子受體的口服酪氨酸激酶抑制劑帕唑帕尼已被批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和軟組織肉瘤的治療[21]。但帕唑帕尼用于膀胱癌的開發(fā)仍處于臨床研究的初始階段。先前的研究(其中用帕唑帕尼處理膀胱癌細(xì)胞)表明，這種抗血管生成劑能夠通過增加胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2磷酸化來誘導(dǎo)自噬，如LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加，酸性泡狀細(xì)胞器的形成，p62蛋白降解和自噬通量[21]，表明帕唑帕尼誘導(dǎo)的自噬細(xì)胞死亡與組織蛋白酶B活性增加有關(guān)。在分子水平上對膀胱癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行比較分析表明，帕唑帕尼通過影響自噬基因的表達(dá)(如ATG9B的上調(diào)和腫瘤蛋白p73基因的下調(diào))誘導(dǎo)細(xì)胞毒性自噬[21]。

表2 自噬細(xì)胞死亡的激活劑

2.2.2紅景天苷 紅景天苷是從玫瑰紅景天中分離出來的一種生物活性酪氨酸衍生的酚類化合物，具有抗疲勞、缺氧、心血管疾病和癌癥的特性[41]。此外，紅景天苷已被證明能誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡以及膀胱癌細(xì)胞凋亡[23]。研究證實(shí)紅景天苷通過自噬/PI3K/蛋白激酶B和基質(zhì)金屬蛋白酶9信號通路引起細(xì)胞凋亡[23]。Kou等[24]指出，粉防己堿誘導(dǎo)的自噬可能通過調(diào)節(jié)AMP活化蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號通路協(xié)同增強(qiáng)人膀胱癌細(xì)胞的凋亡。

2.2.3氨基肽酶N 氨基肽酶N被稱為細(xì)胞表面分子CD13，參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，包括細(xì)胞存活、血壓調(diào)節(jié)、血管生成、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[42]。有研究顯示，氨基肽酶N通過下調(diào)氨基肽酶N表達(dá)抑制蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)自噬，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[39]。相反，3-MA的自噬抑制逆轉(zhuǎn)了烏苯美司的抗增殖特性，表明烏苯美司能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞自噬細(xì)胞死亡[39]。

3 結(jié) 語

盡管在過去的幾十年進(jìn)行了大量的研究來證實(shí)膀胱癌的新治療方法，但是膀胱癌患者的治療和長期存活率仍然相對停滯，臨床結(jié)果沒有顯著改善。自噬已被證明是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞過程，在治療膀胱癌中具有不同的作用。自噬激活劑和抑制劑的應(yīng)用為開發(fā)針對人膀胱癌新型治療的選擇提供了進(jìn)一步認(rèn)識。自噬抑制劑(包括氯喹和3-MA)可能更有利于膀胱癌治療，因?yàn)樗鼈兡茉黾影┘?xì)胞對化療或放療的敏感性。因此，更好地了解自噬在膀胱癌發(fā)生發(fā)展各個(gè)階段的機(jī)制及其在膀胱癌治療中的作用對于選擇靶向自噬途徑的有效藥物至關(guān)重要。