甘薯G病毒基因克隆及組培快繁苗病毒檢測(cè)

蔣素華 白冰洋 牛蘇燕 邰作峰 梁芳 袁秀云 崔波

摘要：為了脫除甘薯G病毒，獲得優(yōu)良的脫毒甘薯種苗，提高甘薯的質(zhì)量和產(chǎn)量，根據(jù)NCBI上已報(bào)道的甘薯G病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR克隆了商薯19葉片G病毒外殼蛋白基因序列。測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的G病毒外殼蛋白基因?yàn)?00 bp，與報(bào)道的基因序列同源性達(dá)99%。經(jīng)過莖尖脫除病毒和組織快繁技術(shù)發(fā)現(xiàn)，商薯19芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;苗增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 g/L 椰汁水;根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA。經(jīng)過PCR檢測(cè)，商薯19中確實(shí)存在G病毒，經(jīng)過莖尖脫除病毒后，G病毒的脫毒率達(dá)到83%。這為獲得甘薯脫毒苗及甘薯病毒檢測(cè)提供了實(shí)踐操作的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甘薯;G病毒;基因克隆;病毒檢測(cè);組培快繁苗

中圖分類號(hào)：S531.01;S531.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0060-04

收稿日期：2021-04-23

基金項(xiàng)目：河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（編號(hào)：21B210011、21A210029）;河南省科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：202102110167）;河南省科技特派員經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：蔣素華（1983—），女，河南漯河人，碩士，副教授，主要從事花卉分子生物學(xué)研究。E-mail：jiangsuhua2006@163.com。

通信作者：崔 波，博士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。 E-mail：laocuibo@163.com。

甘薯種植作為我國(guó)覆蓋范圍較為廣泛的農(nóng)作物生產(chǎn)類型，在我國(guó)南北地區(qū)均有發(fā)展，病毒病在我國(guó)各個(gè)甘薯種植區(qū)快速大范圍的蔓延，對(duì)甘薯質(zhì)量和產(chǎn)量造成了巨大的損失[1-4]。在傳統(tǒng)種植模式中，由于缺乏對(duì)種薯塊根內(nèi)病毒的有效處理技術(shù)，導(dǎo)致我國(guó)甘薯生產(chǎn)效益不同程度地降低，近幾年甘薯脫毒技術(shù)雖不斷改進(jìn)和發(fā)展，但是真正能用于實(shí)際生產(chǎn)并且大面積使用的脫毒技術(shù)還未見報(bào)道。因缺乏可大范圍推廣的脫毒技術(shù)，故甘薯脫毒技術(shù)及脫毒甘薯種植仍處于初步發(fā)展階段，還無法在全國(guó)推廣。

甘薯G病毒（SPVG）屬于馬鈴薯Y病毒屬病毒，是單鏈的RNA病毒，對(duì)主要侵染的甘薯病毒SPFMV和SPCSV有很重要的協(xié)同作用[5-6]。馬鈴薯Y病毒屬基本都有一個(gè)高度保守的區(qū)域，即DAG（Asp-Ala-Gly）三聯(lián)體，它在病毒外殼蛋白（CP）的 N-末端[7]。甘薯G病毒序列保守性特點(diǎn)為采用RT-PCR的方法檢測(cè)G病毒提供了方便。甘薯是通過營(yíng)養(yǎng)體繁殖的，病毒極易傳遞給后代[8]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未培育出高抗病毒的實(shí)用甘薯品種或者能抵抗病毒侵染的高效農(nóng)藥[9]。多年來，海內(nèi)外的專家學(xué)者都致力于探討高效的甘薯脫毒方法[10-13]。伴隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，利用莖尖進(jìn)行甘薯脫毒，為甘薯植株脫毒提供了一條新途徑，成為無毒甘薯生產(chǎn)的首要方法[14-16]。但莖尖組培快繁技術(shù)要求高，難度較大，再生植株的分化受甘薯品種、培養(yǎng)基成分等因素的影響，導(dǎo)致成苗率不高，于是探究最高效的甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)方法很有必要。本研究采用RT-PCR的方法從商薯19葉片中克隆出G病毒外殼蛋白基因，建立了一套甘薯G病毒檢測(cè)體系，并利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，探討不同植物生長(zhǎng)激素組合對(duì)商薯19莖尖的誘導(dǎo)、分化、增殖以及生根的影響，為推廣商薯19脫毒苗和高效病毒檢測(cè)方法提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甘薯樣品、菌株和載體

商薯19于2020年8月取自鄭州師范學(xué)院新溝村試驗(yàn)田。菌株DH5α（大腸桿菌），克隆載體pMD19-T Vector，均購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2 試劑

dNTP、DNA marker均購(gòu)自TIANGEN公司;反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、rTaq酶購(gòu)自TaKaRa公司;其他為國(guó)產(chǎn)純化試劑。

1. 3 引物的設(shè)計(jì)與合成

從NCBI下載G病毒基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0生物軟件以及DNAMAN軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物：GCPF，GCAGGAAAAACAGGAAACAC;GCPR，TGTAGACCATACCTCGGCAT。

1.4 商薯19葉片總RNA提取及目的基因克隆

取0.1 g商薯19葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，提取總RNA，鑒定完整性。

以商薯19葉片總RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA。

以單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，回收甘薯G病毒目的片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用DNA回收試劑盒獲取G病毒目的基因。

1.5 目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆測(cè)序

將所獲取的目的基因與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α，PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)確定為陽性的單克隆，送到上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并與數(shù)據(jù)庫(kù)核酸序列進(jìn)行比較。

1.6 脫毒苗快繁體系的建立

1.6.1 無菌芽的獲得 以健壯、無病斑商薯19薯塊為材料，用1%高錳酸鉀處理15 min，再用0.5%多菌靈浸泡1 h，撈出晾干后置于滅菌水（0.1%多菌靈）中在恒溫（28 ℃）和相對(duì)濕度80%～85%條件下進(jìn)行催芽。待薯芽萌發(fā)后，在35～40 ℃（8 h/d）下培養(yǎng)30 d。當(dāng)薯芽長(zhǎng)至10 cm左右時(shí)，用無菌解剖刀切下頂部約3 cm芽段，剪去多余的葉片，放入燒杯滅菌消毒后，利用3種不同消毒方法（表1）進(jìn)行處理，進(jìn)行無菌播種。

1.6.2 莖尖培養(yǎng) 切取莖尖頂端（約1 cm），用已消毒的解剖刀在40倍解剖鏡下切除較大的葉原基，用解剖針切下位于莖尖頂端的生長(zhǎng)點(diǎn)。每個(gè)培養(yǎng)皿中分別接種3～4個(gè)。分別用3種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，編號(hào)A1、A2、A3，所用培養(yǎng)基及生長(zhǎng)狀況見表2。

1.6.3 苗的增殖 莖尖30 d后可分化出苗，然后進(jìn)行增殖培養(yǎng)，分別采用3種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，編號(hào)B4、B5、B6，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種3～5個(gè)，所用培養(yǎng)基及增殖狀況見表3。

1.6.4 脫毒苗根的誘導(dǎo) 在無菌條件下，將無菌苗剪切成帶有1葉1節(jié)的小段，誘導(dǎo)生根。采用3種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，編號(hào)C7、C8、C9，每組所用培養(yǎng)基配比不同，所用培養(yǎng)基及根的誘導(dǎo)情況見表4。

1.7 病毒檢測(cè)

當(dāng)莖尖幼苗長(zhǎng)至6～7張葉片時(shí)，進(jìn)行 RT-PCR 病毒檢測(cè)， 挑取6株長(zhǎng)勢(shì)較好的商薯19幼苗，編號(hào)為1、2、3、4、5、6，分別提取總RNA，檢驗(yàn)完整性，以總RNA為模板合成單鏈cDNA，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)目的條帶。已經(jīng)成功脫毒的幼苗可進(jìn)行快速繁殖生產(chǎn)，將未脫毒的幼苗淘汰或進(jìn)行莖尖分生組織培養(yǎng)再次脫毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 G病毒基因的克隆

2.1.1 提取總RNA RNA檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。28S、18S、5S條帶均存在，28S約為18S亮度的2倍，說明商薯19葉片中RNA完整性很好，能夠滿足基因克隆的要求。

2.1.2 目的基因克隆及檢測(cè) 利用RT-PCR從商薯19葉片總RNA中擴(kuò)增出目的片段（圖2）。對(duì)其進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、PCR檢測(cè)、測(cè)序，得到800 bp的DNA序列，與NCBI發(fā)表的序列相似度達(dá)到99%，說明已經(jīng)獲得G病毒基因序列。

2.2 甘薯脫毒苗組培快繁

2.2.1 不同表面消毒方法對(duì)莖尖成活率的影響 由表1得出，外植體以處理A效果最佳，處理B的效果次之，處理C的效果最差?？梢姡然臏缇Ч却温人徕c較好，將處理A和處理B對(duì)比發(fā)現(xiàn)，0.1%氯化汞滅菌時(shí)間對(duì)莖尖成活率也有一定的影響。綜合不同的滅菌方法的結(jié)果來看，最佳選擇是處理A。

2.2.2 莖尖誘導(dǎo) 外植體莖尖接種25 d后觀察其誘導(dǎo)情況，在加入6-BA和NAA組合的培養(yǎng)基中，無菌芽尖形成綠色緊實(shí)的愈傷組織，容易分化出芽（圖3）;在加入激素KT的培養(yǎng)基中，無菌芽尖形成黃綠色松散的愈傷組織，不容易分化出芽，說明KT的莖尖誘導(dǎo)效果不好;在不加激素的MS培養(yǎng)基中，無菌芽尖形成少量的愈傷組織，且需要的時(shí)間長(zhǎng)，說明莖尖誘導(dǎo)需要加入一定量的激素，莖尖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為1號(hào)。

2.2.3 苗的增殖 莖尖愈傷組織15 d后即可分化出成苗（圖4），30 d后長(zhǎng)出6～7張葉片（圖5） 。從3種培養(yǎng)基的增殖情況可知，6-BA可有效誘導(dǎo)苗的增殖，但較低濃度的效果不佳，6-BA與CW的組合效果最佳，6-BA與NAA的組合不利于葉的生長(zhǎng)，綜合3種培養(yǎng)基中苗的長(zhǎng)勢(shì)來看，適宜增殖的最佳培養(yǎng)基為4號(hào)培養(yǎng)基，苗生長(zhǎng)快，健壯，葉綠。

2.2.4 生根培養(yǎng) 試驗(yàn)表明，NAA有利于單莖苗的誘導(dǎo)生根，濃度稍高的NAA效果更好。綜合3種不同培養(yǎng)基中多數(shù)幼苗的生根情況來看，誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的最佳選擇為7號(hào)，生根多而且健壯，有利于后期整棵植株的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)（圖6）。

2.3 病毒檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示， 6株商薯19幼苗葉片的總RNA完整性很好。單鏈cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)結(jié)果見圖8，編號(hào)為1、2、3、4、5的植株均無目的基因條帶，說明均已脫毒成功，6號(hào)有明顯的G基因條帶，說明脫毒未成功，G病毒脫毒率達(dá)到83%。已經(jīng)脫毒的商薯19幼苗可以進(jìn)行脫毒苗快速繁殖培養(yǎng)，將未脫毒的幼苗淘汰或繼續(xù)脫毒。

3 討論與結(jié)論

莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)前獲取和培養(yǎng)脫毒苗的主要手段[17-18]。本研究以商薯19的莖尖為外植體，通過建立RT-PCR病毒檢測(cè)體系，篩選出成功脫毒的幼苗，并初步建立了甘薯的脫毒苗組培快繁體系。本試驗(yàn)選取的研究對(duì)象是商薯19，建立了G檢測(cè)方法和脫毒苗快繁體系。試驗(yàn)表明，在商薯19莖尖表面消毒過程中發(fā)現(xiàn)，以0.1%氯化汞滅菌6～7 min為宜，低于6 min外植體容易發(fā)生不同程度的污染，高于7 min外植體容易死亡，且0.1%氯化汞滅菌效果好于10%次氯酸鈉。由于氯化汞屬于重金屬，使用過的氯化汞應(yīng)做特殊處理[19]。

脫毒苗快繁技術(shù)的關(guān)鍵在于剝離的莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在培養(yǎng)基中加入適量的6-BA和NAA有利于芽的誘導(dǎo)分化，但要注意濃度應(yīng)適中，過高或過低都不利于甘薯莖尖的誘導(dǎo)分化[19]。

在病毒檢測(cè)過程中，應(yīng)選取長(zhǎng)勢(shì)較好的商薯19幼苗來檢測(cè)其脫毒是否成功，因?yàn)槊摱境晒Φ挠酌缫M(jìn)行脫毒苗快速繁殖，所以要選取長(zhǎng)勢(shì)較好的幼苗，以便后代能遺傳得到優(yōu)良的性狀，達(dá)到提高產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。

脫毒苗快速繁殖利用單莖苗來進(jìn)行，MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基是適合商薯19生根的基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入適量的NAA有利于單莖苗誘導(dǎo)生根，并且生出的根粗壯，有利于后期成苗的營(yíng)養(yǎng)吸收[19]。

在將莖尖分化出的苗從培養(yǎng)皿移植到培養(yǎng)瓶中時(shí)，要注意輕輕夾取，避免用力過猛而損傷莖和葉[20-21]。同時(shí)試驗(yàn)要在乙醇燈旁操作，避免空氣中的細(xì)菌污染培養(yǎng)基及莖尖分化組織，此外，操作時(shí)動(dòng)作要快，避免乙醇燈熱量灼傷莖尖分化組織。

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