候文靜　王旺　方銳　沃思宇　張捷　丁亦男

摘 要 目的：克隆紅花低分子量油體蛋白基因L-Oleosin，并進行測序和序列比較分析。方法：參考已完成的紅花轉(zhuǎn)錄組測序結果，設計特異性引物，從野生型紅花種子中提取RNA，以 RT-PCR方法擴增L-Oleosin全長基因，測序之后，進行不同物種同源基因間的系統(tǒng)發(fā)生分析，應用Phylip軟件繪制分子進化樹。 結果：克隆了紅花低分子量油體蛋白基因，系統(tǒng)發(fā)生分析表明，L-Oleosin基因的變異很大，物種間差異明顯。 結論 進行油體蛋白基因相關功能研究和建立油體蛋白表達系統(tǒng)等方面的研究應該以同種屬植物或親緣關系較近的植物之間應用為主，基因工程改造和功能驗證應在本物種上進行，然后拓展至近緣物種。

關鍵詞 紅花油體蛋白；基因克??；系統(tǒng)發(fā)生分析

中圖分類號：R284.2；R285 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）03-00-02

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科紅花屬的植物，含油率高、產(chǎn)量也高，因此成為新興的油料作物，其含亞油酸高達70%～80%[1]。紅花種子油在醫(yī)藥上常用作抗氧化劑和維生素A和D的穩(wěn)定劑[2]。用紅花油體系統(tǒng)作為生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白具有生產(chǎn)成本低、易于分離純化、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)附加值等優(yōu)點[3]。

Oleosin是與油體特異性結合的一種堿性蛋白質(zhì)，也是油體中發(fā)現(xiàn)最早且含量最高的蛋白質(zhì)，只存在于植物中[4]。Oleosin在被子植物主要存在高分子量和低分子量兩種同型體[5]，為了探索油體蛋白與紅花含油量的關系，便于利用基因工程改造提高紅花的含油量，以及利用油體表達系統(tǒng)表達外源蛋白，本研究通過提取野生紅花種子總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，設計特異引物克隆了紅花低分子量（L-Oleosin）油體蛋白基因，測序之后，進行了系統(tǒng)發(fā)生分析，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 種子與植株

野生紅花種子，來源于新疆塔城，本實驗室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，T載體試劑盒，T4 DNA連接酶，核酸內(nèi)切酶等為大連寶生物公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 紅花種子總RNA提取

取野生型紅花種子置于液氮中，利用RNAiso Plus（大連寶生物工程有限公司）提取紅花種子RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為PCR模板，應用自行設計的Oleosin基因特異性引物建立反應條件進行目的基因克隆，提取的RNA-80冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 紅花L-Oleosin基因PCR擴增的引物設計

引物序列設計參考課題組紅花種子轉(zhuǎn)錄組測序結果的參考序列設計如下：

Fol上游 5- CCCTTCAAATCCATCGCACCTTCTTCC -3

Rol下游 5- AACGGAGCCTTTATTCACATTCATTAT -3

參照RT-PCR試劑盒說明書，將提取的紅花種子總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)優(yōu)化后的PCR擴增程序為：94℃，40 s，55℃，40 s，72℃ 50 s，共30個循環(huán)，最后72℃再延伸6 min。

1.5 紅花L-Oleosin基因測序與系統(tǒng)發(fā)生分析 PCR擴增的目的基因產(chǎn)物回收并純化之后，克隆入pMD18-T載體中。酶切鑒定陽性的克隆委托上海英駿測序公司（Invitrogen）進行測序。

獲得測序結果之后，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫已公開資料，以BLAST檢索比對L-Oleosin基因在不同物種間的全長編碼序列，下載處理之后，利用phylip軟件（3.695）采取鄰接分析的最大似然距離（Maximum Likelihood，ML）法建立系統(tǒng)進化樹，進而分析紅花L-Oleosin基因的系統(tǒng)進化關系。

2 結果與分析

2.1 紅花L-Oleosin基因的PCR擴增與測序

以紅花種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行 PCR擴增，擴增片段大小約750 bp。測序報告結果表明，成功克隆了紅花L-Oleosin基因的全長編碼序列，基因編碼序列長度為488 bp，編碼161個氨基酸。其蛋白一級結構序列中含有的不同植物油體蛋白均具備的經(jīng)典“脯氨酸結”一級結構序列，即PLLVIFSPVLVP，共12個氨基酸，位于紅花L-Oleosin蛋白氨基酸的第66-77位。

2.2 Phylip軟件繪制的系統(tǒng)發(fā)生分析進化樹

在Phylip軟件包中，依次做SEQBOOT、DNADIST、NEIGHBOR計算，生成的進化樹結果見圖1，其中Olesin488為本研究克隆的紅花L-Oleosin基因的全長編碼序列。

圖1 L-Oleosin基因的系統(tǒng)發(fā)生進化樹

3 討論

試驗結果表明，進行油體蛋白基因相關的功能研究和建立油體蛋白表達系統(tǒng)等研究應該以同種屬植物或親緣關系較近的植物之間互相應用為主，本研究發(fā)現(xiàn)，紅花油體蛋白的系統(tǒng)發(fā)生與擬南芥等模式植物的親緣關系較近，因此可以在擬南芥中對紅花油體蛋白基因進行相關表達和機制探索。若對油體蛋白進行基因工程改造和功能驗證應首先在本物種上進行，然后拓展至近緣物種。

參考文獻

[1]楊玉霞，吳衛(wèi)，鄭有良.紅花研究進展[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報，2004，32（4）： 365–369.

[2]扈曉佳，殷莎，袁婷婷，等.紅花的化學成分及其藥理活性研究進展[J].藥學實踐雜志，2013，31（3）： 161-168.

[3]趙鋼，王安虎.紅花的資源及藥用價值[J].中國野生植物資源，2004，23（3）：24-25.

[4]仇鍵，譚曉風.植物種子油體及相關蛋白研究綜述[J].中南林學院學報，2005，25（4）：96-100.

[5]TAISS，CHEN MC，PENG C-C，et al. Gene Family of Oleosin Isoforms and Their Structural Stabilization in Sesame Seed 0il Bodies[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66（10）： 2146-2153.

（責任編輯：劉昀）