甜菜夜蛾SeKr-h1基因分子表達特性及其對保幼激素類似物的響應(yīng)

趙靜 譚永安 房菊 朱友雯 姜義平 肖留斌

摘要：Krüppel homolog 1（Kr-h1）是保幼激素（JH）的早期響應(yīng)基因，在JH抑制幼蟲或若蟲變態(tài)及促進成蟲生殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用 RT-PCR技術(shù)克隆甜菜夜蛾SeKr-h1α基因，并進行了生物信息學(xué)分析，序列分析結(jié)果顯示，SeKr-h1α開放閱讀框長度1 068 bp，編碼355個氨基酸。與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上已有的甜菜夜蛾Kr-h1β序列相比，SeKr-h1α N端缺少12個氨基酸。通過熒光定量qPCR研究甜菜夜蛾不同發(fā)育時期SeKr-h1α/β的表達水平，結(jié)果顯示，SeKr-h1α/β表達趨勢一致，SeKr-h1α為主要表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。SeKr-h1α/β在幼蟲末期、預(yù)蛹和成蟲期高表達，1～4齡幼蟲和蛹期維持低表達。在幼蟲和蛹末期施用JH類似物Methoprene，qPCR檢測SeKr-h1對JH的誘導(dǎo)響應(yīng)表達，結(jié)果顯示Methoprene處理5齡幼蟲2、6、24 h都可誘導(dǎo)SeKr-h1表達，并且在處理6 h時的誘導(dǎo)效果最為明顯，為對照的8.76倍;Methoprene處理化蛹末期的雌蛹，試驗組羽化12 h雌蟲SeKr-h1表達量為對照組的3.34倍。本研究克隆得到SeKr-h1α完整編碼序列，并明確SeKr-h1的表達特性及其對JH類似物存在誘導(dǎo)響應(yīng)，為進一步深入研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因功能以及開發(fā)防控新策略奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜菜夜蛾;SeKr-h1;基因克隆;表達特性;JH類似物

中圖分類號：S433.4 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0114-07

收稿日期：2021-04-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31901889）;國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YDF0201900）;國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-15-19）。

作者簡介：趙 靜（1989—），女，江蘇宜興人，博士，助理研究員，主要從事經(jīng)作蟲害防控研究工作。E-mail：jingzhao0126@126.com。

通信作者：肖留斌，碩士，研究員，主要從事經(jīng)濟作物害蟲防控研究工作。E-mail：xlbwll@sohu.com。

甜菜夜蛾[Spodoptera exigua （Hǜbner）]是一種世界性分布、間歇性發(fā)生的雜食性害蟲，危害棉花、蔬菜等多種作物[1-2]。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因棉種植面積擴大，棉田生物群落結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生了相應(yīng)的變化。原本為次要害蟲的甜菜夜蛾在棉花上的發(fā)生日益嚴(yán)重，逐漸成為危害棉花生產(chǎn)的主要鱗翅目害蟲[3-4]。同時，甜菜夜蛾已對氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威等多種殺蟲劑產(chǎn)生較高的抗藥性，亟需開拓新的防控靶標(biāo)[5]。甜菜夜蛾一生經(jīng)歷卵—幼蟲—蛹—成蟲的變化過程，開展影響甜菜夜蛾變態(tài)發(fā)育關(guān)鍵基因的研究，對于發(fā)展甜菜夜蛾新的防控手段具有重要意義。

保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（ecdysteroids，20E）是參與調(diào)控昆蟲蛻皮和變態(tài)發(fā)育最重要的2種激素[6-7]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，保幼激素調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育的分子機制取得了較大的進展，JH主要受體蛋白met及多個下游響應(yīng)基因相繼被鑒定[8]。Krüppel homolog 1（Kr-h1）是一種含有8個鋅指結(jié)構(gòu)（C2—H2）的轉(zhuǎn)錄因子，在家蠶（Bombyx mori）、麥紅吸漿蟲（Sitodiplosis mosellana）等昆蟲中，Kr-h1被證實是保幼激素早期響應(yīng)基因[9-11]。用JH類似物Methoprene點滴或注射家蠶4、5齡幼蟲，發(fā)現(xiàn)JH能誘導(dǎo)家蠶體內(nèi)BmKr-h1的表達上調(diào)[9-10]。JHⅢ對麥紅吸漿蟲滯育幼蟲有劑量依賴性的誘導(dǎo)作用。用0.1～0.3 pg/nL Methoprene注射滯育幼蟲6 h，Kr-h1表達量隨著濃度升高而增加[11]。目前，NCBI上已登錄有20多種昆蟲的Kr-h1基因序列，大多數(shù)昆蟲的Kr-h1只有1個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但是在果蠅（Drosophila melanogaster）和家蠶中除外，果蠅存在3種可變剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分別為Kr-h1α、Kr-h1β、Kr-hλ;而家蠶BmKr-h1有BmKr-h1α和BmKr-h1β共2種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，BmKr-h1α蛋白比BmKr-h1β蛋白在N端多了十幾個氨基酸[9，12]。

在不同昆蟲中，Kr-h1被證實參與變態(tài)發(fā)育、生殖生理等過程[13]。赤擬谷盜（Tribolium castaneum）幼蟲末期TcKr-h1短暫高表達對蛹的形成非常重要。干擾幼蟲末期TcKr-h1瞬時高表達，會引起E93的表達上調(diào)，從而引起蟲體直接跳過蛹期到達成蟲期[14]。在飛蝗（Locusta migratoria）、大猿葉甲（Colaphellus bowringi）等昆蟲中，施用JH類似物促進Met及Kr-h1的轉(zhuǎn)錄，進而促進與生殖相關(guān)的卵黃原蛋白Vg/卵黃原蛋白受體VgR基因表達，最終影響卵巢發(fā)育與成熟[15-16]。除了調(diào)控昆蟲生長發(fā)育與生殖，在蜜蜂（Apis mellifera）及果蠅中，Kr-h1還能影響覓食行為以及神經(jīng)元細胞形成[17-18]。

Kr-h1是參與昆蟲變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵基因。目前，在NCBI 上僅登錄甜菜夜蛾SeKr-h1β（S. exigua Krüppel homolog 1β）序列，但對于甜菜夜蛾SeKr-h1的分子特性、表達模式及對JH響應(yīng)機制還未有報道?；趯嶒炇仪捌跍y得的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，筆者檢測到甜菜夜蛾SeKr-h1還存在另一個轉(zhuǎn)錄本SeKr-h1α。本研究利用RT-PCR技術(shù)，對甜菜夜蛾的SeKr-h1α基因進行了克隆、測序和基本的生物信息學(xué)分析，同時通過qPCR技術(shù)明確了SeKr-h1α/β在不同發(fā)育階段的表達特性以及對JH存在誘導(dǎo)響應(yīng)表達，為進一步研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因的功能以及基于SeKr-h1基因開發(fā)害蟲防控手段奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2020 年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所完成。

1.1 試驗材料

供試甜菜夜蛾蟲源采自江蘇省南京市江寧區(qū)的郊區(qū)，于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所養(yǎng)蟲室用人工飼料對其繼代培養(yǎng)。甜菜夜蛾飼養(yǎng)條件為溫度（25.5±1） ℃，相對濕度（65±5）%，光—暗周期14 h—10 h，成蟲期補充10%蜂蜜水。

1.2 方法

1.2.1 甜菜夜蛾SeKr-h1α基因的克隆

采用Trizol法提取甜菜夜蛾雌成蟲的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將羽化1 d甜菜夜蛾蟲體放入研缽中，加入少量的液氮，將蟲體充分研磨至粉末狀，收集 0.05～0.1 g組織量至離心管并加入1 mL的Trizol試劑，按照試劑說明書提取總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶完整性，并用紫外可見分光光度計確定RNA質(zhì)量和濃度。通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶體系對樣品RNA進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA于-20 ℃冰箱中保存，備用。

基于測得的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計引物通過RT-PCR擴增SeKr-h1α的全長，引物序列見表1。通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段產(chǎn)物，回收鑒定正確的產(chǎn)物并連接pClone007載體，室溫（22～30 ℃）反應(yīng)5 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，最后通過菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并送上海生物工程有限公司測序。

1.2.2 甜菜夜蛾SeKr-h1α序列結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

為驗證克隆得到的SeKr-h1α序列的可靠性，利用NCBI的Blast工具將其與GenBank數(shù)據(jù)庫中的其他物種進行同源性序列比對。采用DNAMAN 6.0軟件預(yù)測SeKr-h1α蛋白分子量和等電點。采用 NCBI的CCD軟件進行SeKr-h1α功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。用Signal 3.0在線軟件對SeKr-h1α進行信號肽分析。利用 NetPhos及 NetGlycate在線軟件對其進行磷酸化位點預(yù)測和糖基化分析。使用Clustal W 軟件對鱗翅目Kr-h1氨基酸序列進行比對。采用MEGA 5軟件NJ法構(gòu)建昆蟲Kr-h1系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 甜菜夜蛾不同發(fā)育階段SeKr-h1α/β的表達動態(tài)

收集甜菜夜蛾1～5齡幼蟲，預(yù)蛹，化蛹1、3、7 d的雌、雄蛹，羽化1～3 d的雌、雄蛾，立即放置液氮中冷凍，-80 ℃保存以備提取RNA以及熒光定量qPCR試驗。

根據(jù)甜菜夜蛾SeKr-h1α/β基因序列分別設(shè)計qPCR引物（SeKr-h1α：Krα-Q887F，Krα-Q1081R;SeKr-h1β：Krβ-30F，Krβ-179R），進行qPCR分析。引物序列見表1，以Actin為內(nèi)參基因。用以TB Green 為染料的熒光標(biāo)記法進行qPCR定量檢測。20 μL qPCR體系：TaKaRa TB Green Premix Ex TaqTM 2 μL、引物各 0.4 μL、模板 cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，共 40個循環(huán)。不同發(fā)育時期樣品各3個生物學(xué)重復(fù)和4個技術(shù)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)取3頭試蟲。

1.2.4 SeKr-h1對保幼激素類似物誘導(dǎo)響應(yīng)表達的qPCR檢測

將保幼激素類似物Methoprene（Sigma，美國）通過丙酮稀釋成5 μg/μL的母液，封存于-20 ℃。挑選健康的、大小一致的5齡3 d幼蟲，并用無菌水清洗蟲體表面的飼料，用濾紙吸干水分，通過微量注射儀點滴1 μL于幼蟲的第2與第3胸節(jié)之間，并以丙酮作為對照。分別收集對照幼蟲以及用Methoprene處理2、6、24 h的幼蟲各4組，每組3頭，用液氮快速冷凍蟲體，保存于-80 ℃。

選取大小一致、體色發(fā)黑、化蛹7 d的甜菜夜蛾雌蛹，通過微量注射儀注射，每頭蛹施用量為1 μL，以丙酮作為對照。將注射后的蛹放入玻璃缸中，為防羽化后飛出用紗布覆蓋缸口并用橡皮筋扎緊。將玻璃缸置于恒溫箱正常飼養(yǎng)，分別收集羽化12 h的雌成蟲以及對照成蟲各4組，每組3頭。

按“1.2.1”節(jié)的方法將上述收集的樣品提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qPCR檢測JH類似物施用組和對照組SeKr-h1的表達情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基因表達相對量的變化采用2-ΔΔCT法[19]表示，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，并用Tukey’s HSD 法進行差異顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 SeKr-h1α基因克隆與序列特征

基于甜菜夜蛾的轉(zhuǎn)錄組序列，根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計引物，通過RT-PCR擴增SeKr-h1α基因。在圖1的電泳圖中顯示擴增得到1條1 000 bp左右的條帶。序列分析顯示，其完整編碼序列全長1 068 bp，GC含量達到44.5%，編碼 355個氨基酸，預(yù)測的MW分子量約為39.35 ku，等電點PI為8.93。用NetGlycate以及Signal 3.0在線軟件對SeKr-h1α進行糖基化和信號肽分析，發(fā)現(xiàn)SeKr-h1α不含糖基化修飾位點和信號肽，暗示SeKr-h1α可能為一種無糖基化修飾的非分泌型蛋白。利用 NetPhos 軟件對SeKr-h1α蛋白進行預(yù)測，結(jié)果顯示，SeKr-h1α有37個磷酸化位點，分別為19個Ser、17個Thr 和1個Tyr。

2.2 SeKr-h1α氨基酸序列結(jié)構(gòu)比對

與NCBI上已有的甜菜夜蛾Kr-h1氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)本研究克隆的SeKr-h1 N端存在差異，缺少12個氨基酸，為Kr-h1α，NCBI的Kr-h1序列為Kr-h1β（圖2-A）。鱗翅目不同物種 Kr-h1的氨基酸序列進行多序列比對結(jié)果（圖2-B）顯示，所有昆蟲都有8個典型的鋅指結(jié)構(gòu)域。與比對的鱗翅目其他昆蟲類似，SeKr-h1蛋白的C端還包含2個蛋白互作基序（LPPRKR 和SVIQFA）。對鱗翅目現(xiàn)有SeKr-h1氨基酸序列比較，除了SeKr-h1β，甜菜夜蛾SeKr-h1α與球菜夜蛾（Agrotis ispilon）最相似（92.11%），其次是棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）（89.80%），梨小食心蟲（Grapholita molesta）（86.04%）。

2.3 昆蟲Kr-h1系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了解不同昆蟲Kr-h1蛋白之間的進化關(guān)系，以人類的Kr-h1為外群，基于14種昆蟲的Kr-h1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖3可以看出，SeKr-h1與同源自鱗翅目的棉鈴蟲以及球菜夜蛾Kr-h1親緣關(guān)系最近，形成姐妹群。相比鞘翅目和膜翅目，鱗翅目與雙翅目Kr-h1親緣關(guān)系更近。

2.4 甜菜夜蛾不同發(fā)育時期SeKr-h1α/β表達趨勢

通過熒光定量qPCR分析SeKr-h1α/β在甜菜夜蛾不同發(fā)育時期的表達情況，結(jié)果（圖4）顯示，SeKr-h1α/β表達趨勢一致，SeKr-h1α為主要表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。SeKr-h1α/β在1～4齡幼蟲低表達，進入5齡后表達量上升，至預(yù)蛹階段表達量達到峰值后開始下降，在蛹期維持低表達（圖4-A）。SeKr-h1α/β在成蟲期高表達，雌成蟲表達量先上升后下降，在羽化1 d時達到峰值（圖4-A）;雄成蟲表達量穩(wěn)步上升，在羽化3 d時達到最高（圖4-B）。

2.5 甜菜夜蛾SeKr-h1對JH類似物的誘導(dǎo)響應(yīng)

為進一步探究SeKr-h1對激素的誘導(dǎo)響應(yīng)，用保幼激素類似物Methoprene點滴甜菜夜蛾5齡3 d幼蟲和注射化蛹7 d的雌蛹（5 μg/頭），于處理后不同時間取樣檢測SeKr-h1的表達水平。熒光定量qPCR 結(jié)果顯示， Methoprene處理2、 6、24 h都可誘導(dǎo)5齡幼蟲SeKr-h1的表達，并且在處理6 h時的誘導(dǎo)表達效果最好，為對照的8.76倍;處理2 h和24 h時，SeKr-h1表達量分別為對照的4.88倍和2倍（圖5-A， P<0.05）。 用Methoprene處理化蛹末期的雌蛹，試驗組羽化12 h雌蟲SeKr-h1表達量為對照組的3.34倍（圖5-B，P<0.05）。 該結(jié)果表明甜菜夜蛾SeKr-h1在幼蟲期和成蟲期受到JH的調(diào)控。

3 討論

Kr-h1是JH的早期響應(yīng)基因，近年來對昆蟲Kr-h1的研究逐漸增多，根據(jù)NCBI上提供的信息，擁有完整8個鋅指結(jié)構(gòu)（Zn1～Zn8）的Kr-h1基因已超過20個。目前，克隆的大多數(shù)昆蟲Kr-h1只有1個轉(zhuǎn)錄本，但家蠶和果蠅存在2種及以上轉(zhuǎn)錄本，其中共有的轉(zhuǎn)錄本為Kr-h1α及Kr-h1β，Kr-h1α蛋白比Kr-h1β蛋白在N端多了十幾個氨基酸，Kr-h1α被認(rèn)為參與了昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程[9，12]。依據(jù)甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，同時借助 RT-PCR 技術(shù)，克隆擴增了SeKr-h1的開放閱讀框序列，與NCBI上已有的甜菜夜蛾Kr-h1序列相比，N端氨基酸存在差異，缺少12個氨基酸，經(jīng)鑒定為α蛋白。對不同鱗翅目昆蟲Kr-h1蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)它們存在8個高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域。研究表明，Kr-h1通過保守的鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合靶基因的CACCC或GC等位點，進而調(diào)控靶基因[20]。鋅指結(jié)構(gòu)域的數(shù)量在大多數(shù)昆蟲中為8個，但是在寄生類昆蟲中存在缺失，如人頭虱（Pediculus humanus）沒有Zn7，麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的Kr-h1蛋白只有Zn4和Zn7[21]。寄生類昆蟲Kr-h1 鋅指蛋白個數(shù)的缺失推測可能與這2種昆蟲鋅指結(jié)構(gòu)功能退化以及結(jié)構(gòu)冗余性有關(guān)。

Kr-h1的表達具有發(fā)育時期特異性，在大多數(shù)昆蟲的幼蟲向蛹轉(zhuǎn)變期以及成蟲期高表達。家蠶BmKr-h1α/β在幼蟲、蛹及成蟲3個階段都有表達，表達趨勢一致，但BmKr-h1α表達豐度遠高于BmKr-hβ。BmKr-h1α/β在家蠶5齡幼蟲初期表達量極低，進入5齡末期表達量開始急劇上升然后下降，蛹期維持低表達，成蟲期高表達[9]。梨小食心蟲Kr-h1在幼蟲期低表達，在預(yù)蛹期表達量先上升后下降，成蟲期表達量穩(wěn)步上升[22]。與家蠶類似，甜菜夜蛾SeKr-h1α為主要表達的蛋白形式，在預(yù)蛹期和成蟲期高表達，可能參與幼蟲向蛹及蛹向成蟲轉(zhuǎn)變的激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在果蠅中，Kr-h1β主要在其胚胎發(fā)育時期的中樞神經(jīng)表達，而Kr-h1α的表達則貫穿了幼蟲的整個時期，在預(yù)蛹期的初期表達量較高，同時大部分缺少Kr-h1α的蟲體會在變態(tài)時期死亡[12，23];除了參與變態(tài)發(fā)育，在其他昆蟲中，Kr-h1表達模式還與幼蟲滯育、覓食行為有關(guān)。麥吸蟲Kr-h1 mRNA豐度隨著幼蟲進入3齡早期、滯育前期和維持期而增加，并在滯育后靜止期達到峰值[24]。Kr-h1在蜜蜂大腦中的表達受cGMP調(diào)控，其啟動子包含一個保守的潛在cGMP反應(yīng)元件，與覓食行為密切相關(guān)[17]。

JH在全變態(tài)或半變態(tài)昆蟲未成熟期過渡到成蟲階段的過程中發(fā)揮了重要的作用[21，25]。Kr-h1被證實參與調(diào)控昆蟲JH信號的傳導(dǎo)而發(fā)揮變態(tài)發(fā)育、生殖生理等功能。用JH類似物處理果蠅及家蠶等昆蟲，會促進Kr-h1的轉(zhuǎn)錄表達，導(dǎo)致幼蟲延遲化蛹并降低20E滴度[26-27]。在赤擬谷盜、果蠅及德國小蠊（Blattella germanica）幼蟲期干擾Kr-h1的表達，會引起蟲體的早熟[14，26-28]。對褐飛虱3齡若蟲注射kr-h1 dsRNA，會導(dǎo)致翅膀發(fā)育不良和雌雄成蟲外生殖器畸形[29]。在飛蝗、大猿葉甲等昆蟲中，JH通過其受體Met促進Kr-h1的轉(zhuǎn)錄，進而促進卵黃原蛋白Vg及其受體VgR的表達，最終影響卵巢發(fā)育[15-16]。對球菜夜蛾注射JH抑制劑以及JH類似物，證實Kr-h1受到JH的調(diào)控，并影響球菜夜蛾的性行為[30]。本研究對甜菜夜蛾幼蟲和蛹體外施用JH類似物，其試驗結(jié)果顯示，SeKr-h1在幼蟲和蛹末期都受到JH的誘導(dǎo)，但其響應(yīng)機制以及發(fā)揮的生理功能仍需進一步的研究。

本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆了SeKr-h1α的編碼序列，明確了SeKr-h1α/β在幼蟲向蛹轉(zhuǎn)變期以及成蟲期高表達，該表達特性可能與其調(diào)控變態(tài)發(fā)育、成蟲生殖等功能有關(guān)。SeKr-h1的表達在幼蟲和蛹末期都能響應(yīng)JH類似物的誘導(dǎo)。該研究結(jié)果可為以JH信號傳導(dǎo)通路基因為靶標(biāo)研發(fā)新型害蟲控制劑奠定良好的研究基礎(chǔ)。

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