謝彤彤，付博凡，姚鑫鑫，盛熙暉，郭 勇，肖龍菲，倪和民，王相國

(北京農(nóng)學院動物科學技術學院，北京 102206)

奶牛子宮內膜炎(Cow endometritis)是影響奶牛群體繁殖性能的一種主要疾病。奶牛子宮內膜炎會造成母牛子宮的組織損傷、胚胎的死亡、早期流產(chǎn)、卵巢周期推遲、黃體期延長、胎間距增大等一系列的不良后果[1-3]，同時也是引起母牛不孕和胎兒死亡的重要原因之一[4]。母?；甲訉m內膜炎后，通常會導致生產(chǎn)性能降低，進而降低泌乳量和懷孕率，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。這些問題在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中大量存在，并且已經(jīng)嚴重損害奶牛的繁殖性能，阻礙奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，同時，奶牛子宮內膜炎的中西藥治療使得養(yǎng)殖成本增加，給養(yǎng)殖戶造成額外的經(jīng)濟負擔。急需一種有效且廉價的方法治療奶牛子宮內膜炎癥。

北京農(nóng)學院動物育種與輔助生殖實驗室前期已從奶牛子宮腔液中分離并鑒定外泌體內miRNA，發(fā)現(xiàn)miR218在患子宮內膜炎奶牛子宮組織中的表達量顯著低于健康牛子宮組織的表達量[5]。該試驗擬通過大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激奶牛子宮內膜上皮細胞(Endometrial epithelial cells，EEC)構建奶牛子宮內膜炎體外模型，從培養(yǎng)的子宮內膜上皮細胞和脂多糖刺激的子宮內膜上皮細胞內分離鑒定外泌體及其中miR218的表達。通過外泌體融合和mimics 218轉染檢測奶牛子宮內膜上皮細胞來源外泌體及其miRNA對減輕脂多糖誘發(fā)免疫因子釋放的作用。探究奶牛子宮內膜炎診斷新的標識因子，進而為從基因水平治療奶牛子宮內膜炎提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其培養(yǎng)

奶牛子宮內膜上皮細胞系購自國家實驗室細胞平臺。放置在培養(yǎng)基(minimum essential medium，MEM)(含10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)中，在37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

基礎培養(yǎng)液MEM(賽默飛公司)、無外泌體胎牛血清(Exosomes-depleted FBS Media Supplement，安諾論公司)、脂多糖(西格瑪公司)、牛腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(江萊生物)、牛白細胞介素-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(江萊生物)、外泌體提取試劑盒(貝博公司)和PKH26(西格瑪公司)。

1.3 檢測細胞增殖

細胞生長速率達到80%后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液洗滌，依次加入0、5、10、50、100 μg/mL(n=6)脂多糖(培養(yǎng)基0%FBS配置)，24 h后向每孔加入10 μL CCK-8，在37 ℃下孵育2 h，用酶標儀測量每個孔在450 nm的吸光度(OD)。

1.4 測定IL-1β和TNF-α

待細胞生長率達90%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，其中一板加入100 μg/mL脂多糖(此為試驗組)，另一組繼續(xù)培養(yǎng)(此為對照組)，收集24 h后的細胞培養(yǎng)基，依照江萊生物牛IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒操作，測得OD值，根據(jù)標準曲線，將OD值換算成pg/mL。

1.5 外泌體形態(tài)觀察及檢測

待細胞生長率達90%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，其中一板加入100 μg/mL脂多糖(此為試驗組)，另一組繼續(xù)培養(yǎng)(此為對照組)，采集24 h后的細胞培養(yǎng)基，依照貝博公司外泌體(Exosomes，exo)提取試劑盒操作，分別獲得脂多糖處理后外泌體和正常外泌體備用。外泌體使用負染色法，并用透射電子顯微鏡形態(tài)學染色。將脂多糖處理后外泌體和正常外泌體分別提取蛋白用Western Blot檢測外泌體標志蛋白CD63；并且分別提取mRNA，測定其OD值。

1.6 熒光定量PCR檢測基因表達

將1.5中得到的mRNA進行熒光定量PCR測定，檢測子宮內膜上皮細胞來源外泌體與脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞來源外泌體中miR218的表達量。

定量PCR引物，設計并合成由吉馬基因完成，持家基因GAPDH的引物由上海生物合成，使用primer5.0軟件設計，引物序列見表1。

表1 miR-218，GAPDH基因引物Tab.1 miR-218, GAPDH gene primers

1.7 細胞觀察

細胞生長速率達到80%后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液洗滌，加入100 μg/mL脂多糖培養(yǎng)24 h，加入熒光標記試劑盒(Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit，PKH26)染色的脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞來源外泌體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用DAPI進行核染色，共聚焦顯微鏡觀察。

待細胞生長速率達80%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，同時加入100 μg/mL脂多糖培養(yǎng)24 h，試驗組加入子宮內膜上皮細胞來源外泌體，對照組不做操作繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細胞培養(yǎng)基，依照江萊生物牛IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒操作，測得OD值。并檢測miR218在細胞中的表達。

1.8 轉染細胞

待細胞生長速率達80%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，轉染mimics 218和mimics NC到細胞中培養(yǎng)24 h，加入100 μg/mL脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用共聚焦顯微鏡觀察轉染mimics 218的子宮內膜上皮細胞。

我們應該認識到的是，目前肥料染色問題已經(jīng)從行業(yè)自律，上升到法律的約束。非有效染色劑的運用，可能涉嫌違法，并需要承擔相應的法律責任，這一定不是化肥生產(chǎn)者愿意面對的，也是我們必須要引起重視的。如果要改變這一局面，我們需要的是依靠技術的進步。我國化肥工業(yè)界一定有能力作出改變。

待細胞生長速率達80%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，同時加入100 μg/mL脂多糖培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)基，依照江萊生物牛IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒操作，測得OD值。根據(jù)標準曲線，將OD值換算成pg/mL。

1.9 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計并分析數(shù)據(jù)。結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示，*代表P<0.05，表示差異顯著，**代表P<0.01，表示差異極顯著。應用Graphpad prism7.0統(tǒng)計軟件生成柱狀圖。

2 結 果

2.1 脂多糖對子宮內膜上皮細胞增殖的影響

脂多糖0、5、10、50和100 μg/mL，處理24 h，對子宮內膜上皮細胞增殖影響顯著，見圖1。脂多糖100 μg/mL，處理24 h，對奶牛子宮內膜上皮細胞增殖呈現(xiàn)顯著抑制(P<0.05)。

2.2 脂多糖對子宮內膜上皮細胞IL-1β和TNF-α釋放的影響

使用100 μg/mL脂多糖處理子宮內膜上皮細胞24 h，細胞培養(yǎng)上清中的IL-1β、TNF-α含量均顯著高于對照組(P<0.05)，見圖2。說明脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞誘發(fā)炎癥因子的釋放。

2.3 子宮內膜上皮細胞來源外泌體分離與鑒定

采用透射電鏡對兩組提取的外泌體(子宮內膜上皮細胞來源外泌體和脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞來源外泌體)形態(tài)進行檢測，見圖3。提取的外泌體大小均一，直徑均在30～150 nm之間，外形呈圓形或橢圓形的茶托樣結構，可見明顯的膜性結構，形態(tài)無較大差異(圖3A，箭頭所指為外泌體)，且均表達外泌體標識蛋白CD63(圖3B)，子宮內膜上皮細胞來源外泌體和脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞來源外泌體的mRNA的OD值無明顯差異(圖3C)。說明從培養(yǎng)的子宮內膜上皮細胞和脂多糖刺激的子宮內膜上皮細胞內能夠分離出外泌體，并且外泌體內RNA成分含量無差異。

2.4 脂多糖對外泌體中miR218表達影響

脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞來源外泌體中miR218的表達量顯著低于正常培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞來源外泌體中miR218的表達量(P<0.01)，見圖4。說明分離的子宮內膜上皮細胞來源外泌體與脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞來源外泌體內miR218表達出現(xiàn)顯著差異。

2.5 正常培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞來源外泌體對脂多糖誘發(fā)免疫因子釋放的影響

正常培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞來源外泌體(PKH26著色)能夠與脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞融合，并與調節(jié)炎性因子釋放相關的NF-Κb(p65)蛋白共定位于細胞質中(圖5A)。與此同時，正常培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞來源外泌體顯著抑制100 μg/mL脂多糖處理誘發(fā)的子宮內膜上皮細胞中的IL-1β和TNF-α釋放(P<0.05)，見圖5B。此外，正常培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞來源外泌體隨著與子宮內膜上皮細胞的融合顯著增加脂多糖處理子宮內膜上皮細胞內miR218的含量(P<0.05)，見圖5C。

2.6 MiR218對脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞中IL-1β和TNF-α釋放的影響

Mimics 218進入到被轉染的脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞細胞質中，主要與磷酸化的p65(p-p65)蛋白細胞核外部分共定位(圖6A)。與此同時，轉染mimics 218顯著抑制脂多糖刺激子宮內膜上皮細胞中TNF-α的釋放(P<0.05)，而對IL-1β釋放無明顯影響(圖6B)。

3 討 論

3.1 脂多糖對子宮內膜上皮細胞影響

大腸桿菌所產(chǎn)生的脂多糖是引發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應的重要因素，所以脂多糖是與子宮內膜炎相關的典型的病原分子形式[6]。有關病原學研究表明，革蘭氏陰性菌感染雌性生殖道是引起不孕、早期流產(chǎn)及子宮感染的重要病原之一[7]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，使用革蘭氏陰性菌來源的內毒素-脂多糖作為病原相關分子模式可以很好模擬細菌感染而引發(fā)炎癥反應。將脂多糖作為病原相關分子形式模擬細菌感染、制作體內和體外炎癥模型，已經(jīng)成為子宮內膜炎相關研究中普遍利用的技術方法。大腸桿菌利用特殊的毒力因子脂多糖導致組織損傷并促進疾病，從而導致宿主對內源性免疫系統(tǒng)指導的細菌反應[8]。大量研究證明，動物機體以及多種細胞在體外可以被脂多糖誘導產(chǎn)生炎癥反應[9]。研究報道，在未患有疾病的奶牛子宮內膜中，IL-1α、IL-6、TNF-α的mRNA水平顯著低于臨床型子宮內膜炎的奶牛，隱性奶牛子宮中IL-1α、IL-6、TNF-α的mRNA表達與臨床型無明顯區(qū)別[10]。該試驗中，脂多糖為100 μg/mL，作用24 h時，可誘導奶牛子宮內膜上皮細胞的免疫應答，并且在細胞培養(yǎng)上清中的IL-1α、TNF-α分泌均有大幅提高。

3.2 子宮內膜上皮細胞來源外泌體提取可用于后續(xù)研究

外泌體是通過身體的大部分細胞分泌的30～150 nm的直膜囊泡。外泌體擁有脂質雙層結構層，它主要由蛋白，脂質，核酸構成[11]。外泌體可以攜帶DNA，編碼RNA和非編碼RNA和蛋白。外泌體可以作為疾病的生物標志物。一直以來人們認為，細胞之間的交流都是通過細胞間接觸或者分子實現(xiàn)，如激素，如神經(jīng)遞質等。自從外泌體被發(fā)現(xiàn)以來，人們發(fā)現(xiàn)它是細胞間信息傳遞的方式之一，它作為細胞間交流的媒介，參與細胞間物質傳遞與信息傳遞。外泌體可以直接或者間接與靶細胞接觸，進行信號傳遞。Rao等[12]和Khan等[13]研究表明，外泌體在腫瘤診斷、細胞遷移生長、組織修復、和其他抗原呈遞外來體的免疫中起著非常重要的作用。該研究中采用的外泌體提取試劑盒分離獲得外泌體，操作簡單，純度高，經(jīng)過透射電子顯微鏡和Western Blot兩種方法對外泌體的結構大小進行驗證和表面蛋白驗證。外泌體提取試劑盒獲得的外泌體能夠應用于后續(xù)試驗。

3.3 MiR218調節(jié)脂多糖刺激的子宮內膜上皮細胞免疫因子釋放

miRNA是一類非編碼RNA分子，長度為22～25個核苷酸。它們通過抑制mRNA的翻譯或促進mRNA的降解而起作用。越來越多的證據(jù)顯示miRNA具有多種生物學功能，如調節(jié)細胞活力、細胞死亡和細胞遷移[14-15]。Asangani等[16]、Prasad等[17]和Tavazoie[18]目前研究證明，miR218可能參與調節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，例如口腔癌，急性淋巴細胞白血病，肺癌，結腸癌，胃癌和宮頸癌。外泌體中的miRNA在疾病中發(fā)生和發(fā)展情況之間的聯(lián)系越來越受到研究者的關注[19-20]。外泌體作為miRNA表達時的載體是最近研究的方向之一[21]。在腫瘤領域中，miR218已被證明可通過靶向Bmi-1或ROBO等蛋白的表達抑制各種腫瘤細胞的增殖和侵襲[22]。該研究中發(fā)現(xiàn)轉染miR218的模擬物顯著抑制脂多糖刺激的子宮內膜上皮細胞內TNF-α的釋放，對IL-1β的釋放沒有影響。然而，正常培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞來源外泌體能夠同時抑制脂多糖刺激的子宮內膜上皮細胞內TNF-α和IL-1β的釋放。說明外泌體內不同成分共同調節(jié)脂多糖誘發(fā)的子宮內膜上皮細胞免疫因子的釋放。MiR218僅僅可以作為其中的一個調控因子，調節(jié)脂多糖刺激的子宮內膜上皮細胞免疫因子的釋放。

4 結 論

正常情況下，miR-218能夠隨著健康子宮內膜上皮細胞分泌外泌體進入到鄰近細胞或其自身內，并與磷酸化p65核外部分共定位并抑制自身免疫因子的釋放。當子宮內膜上皮細胞受到脂多糖刺激后，包裹進外泌體內miR218減少，從而解除其對周圍子宮內膜上皮細胞免疫因子的抑制，進而加重免疫反應。