凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞免疫功能的影響

申維維，吳 瓊，胡 迪，吳顯平，溫海京，胡 婷，范礦士，張永紅，崔德鳳

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物類(lèi)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京102206)

隨著人們生活質(zhì)量的提高，畜牧業(yè)產(chǎn)品的安全問(wèn)題越來(lái)越受到重視。目前中國(guó)畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中仍存在對(duì)抗生素、化學(xué)藥物、激素等超量且不合理使用現(xiàn)象，長(zhǎng)期下來(lái)致使畜禽產(chǎn)品安全性降低[1]，特別是采食抗生素的動(dòng)物體內(nèi)會(huì)形成大量抗性基因，這種基因會(huì)隨著動(dòng)物糞便污染周邊環(huán)境甚至土壤進(jìn)入生物鏈，經(jīng)過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，間接對(duì)人類(lèi)健康形成威脅，抗生素的耐藥性及其在動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留威脅人類(lèi)健康。益生菌作為一種優(yōu)勢(shì)菌，屬于對(duì)宿主有益的活性微生物，不僅可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物體系，還能保護(hù)機(jī)體腸道不受侵害[2]，在腸道中扮演十分重要的角色。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，BC)擁有乳酸菌類(lèi)益生菌與芽孢菌類(lèi)益生菌兩類(lèi)的共同優(yōu)點(diǎn)[3]，可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，在室溫且避光的環(huán)境中其有效作用可長(zhǎng)達(dá)720 d，主要具有耐熱、耐氧、耐鹽、耐酸堿等“四耐”的抗逆特性[4-5]。益生菌作為抗生素的潛在替代品已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，郭欣怡等[6]在肉仔雞飼喂中加入益生菌，益生菌組肉雞免疫器官質(zhì)量與系數(shù)增加且顯著高于空白對(duì)照組，益生菌提高肉仔雞的免疫功能。劉淑嬌等[7]在肉雞基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合益生菌，益生菌組肉雞血清中總蛋白和免疫球蛋白IGg含量顯著增加。該試驗(yàn)以肉雞為研究對(duì)象，其飼養(yǎng)過(guò)程中飼料中分別添加凝結(jié)芽孢桿菌和抗生素，以抗生素為參照，探討凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞免疫功能的影響，目的為實(shí)際養(yǎng)殖中抗生素的使用尋找替代品提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，BC)由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，3日齡健康雄性肉雞購(gòu)自北京愛(ài)拔益加家禽育種有限公司，雞IL-10和雞IgG試劑盒購(gòu)自雨桐生物公司，D-Hank's購(gòu)自Gibco公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自biowest公司，1640培養(yǎng)液購(gòu)自博爾優(yōu)生物公司，MTT購(gòu)自Millipore，刀豆蛋白(ConA)購(gòu)自索萊寶公司。

超凈工作臺(tái)(東聯(lián)哈爾制造公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器公司)、酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)分組與肉雞飼養(yǎng) 取肉雞75只經(jīng)過(guò)3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分5組，即空白對(duì)照組、抗生素組、BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組?？瞻讓?duì)照組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧加桿菌肽(4 g/10 kg)，BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧加凝結(jié)芽孢桿菌(活菌數(shù)分別為2×107、2×108、2×109CFU/mL)。每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)采用無(wú)抗生素添加的基礎(chǔ)日糧(表1)，試驗(yàn)周期為35 d，7 d為一個(gè)周期。

1.2.2 肉雞飼養(yǎng)管理 購(gòu)進(jìn)試驗(yàn)肉雞之前對(duì)雞舍進(jìn)行全面沖洗、消毒，進(jìn)雛雞前2 d對(duì)雞舍進(jìn)行照射升溫。肉雞分層飼養(yǎng)，每天人工給料1次，自由采食，自由飲水，雞舍內(nèi)照射熱燈，保障雞舍內(nèi)適宜的溫度和濕度，注意保障雞舍衛(wèi)生及合理通風(fēng)。

1.2.3 樣品采集與檢測(cè) 試驗(yàn)期第7天、第14天、第21天、第28天、第35天時(shí)對(duì)肉雞稱(chēng)量體質(zhì)量，同時(shí)每組取3只肉雞心臟采血3～4 mL分別置于一支含有抗凝劑(肝素)采血管(用于T淋巴細(xì)胞提取)和另一只不加肝素采血管，不加肝素采血管室溫

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Basic diet composition and nutrition level

斜面放置0.5 h，3 000 r/min離心10 min，吸取血清置于滅菌1.5 mL EP管內(nèi)，采用血清生理生化分析儀檢測(cè)生理生化相關(guān)指標(biāo)，按照試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)血清中IL-10和IgG含量。

剖殺肉雞取出脾臟、胸腺、法氏囊，用濾紙輕輕擦拭表面稱(chēng)量質(zhì)量，按照公式計(jì)算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/肉雞體質(zhì)量(g)。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測(cè)定 取1 mL的Hanks液于離心管中，加入1 mL全血混勻，將其緩慢加入裝有2 mL淋巴分離液離心管內(nèi)，2 000 r/min離心20 min，取出離心管用毛細(xì)管吸取中間層白色絮狀裝于有15 mL 1640培養(yǎng)液離心管中，2 000 r/min離心5 min，用1640培養(yǎng)液洗滌，離心，重復(fù)2次，棄去培養(yǎng)液，最后用1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋到2×106個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，空白對(duì)照孔加入50 μL細(xì)胞懸液+50 μL的1640培養(yǎng)液，試驗(yàn)組孔加入50 μL細(xì)胞懸液+50 μL的ConA，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，取出細(xì)胞板每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加DMSO溶液100 μL，將細(xì)胞板置于酶標(biāo)儀460 nm下檢測(cè)，記錄吸光度值。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異非常顯著，文中與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與抗生素組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)的影響

凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)的影響見(jiàn)圖1和表2。試驗(yàn)期14 d時(shí)BC高劑量組肉雞日增體質(zhì)量顯著高于抗生素組(P<0.05)，試驗(yàn)期21 d時(shí)抗生素組、BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞日增體質(zhì)量均非常顯著高于空白對(duì)照組(P<0.001)，試驗(yàn)期28 d時(shí)抗生素組和BC中劑量組肉雞日增體質(zhì)量顯著高于空白對(duì)照組，試驗(yàn)期35 d時(shí) BC中劑量組肉雞日增體質(zhì)量極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)抗生素組與BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組相比肉雞日增體質(zhì)量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)前期第14 天之后抗生素組與BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組均表現(xiàn)出顯著提高肉雞平均日增體質(zhì)量的作用，且隨著試驗(yàn)期延長(zhǎng)BC中劑量組肉雞日增體質(zhì)量提高顯著，BC中劑量促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)效果顯著。

試驗(yàn)期21 d和28 d時(shí)，BC中劑量組肉雞法氏囊指數(shù)與空白對(duì)照組存在顯著差異，試驗(yàn)期BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞法氏囊指數(shù)均高于抗生素組；試驗(yàn)期14、21、28 d時(shí)BC中劑量組肉雞脾臟指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組，且在試驗(yàn)期BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞脾臟指數(shù)均高于空白對(duì)照組；試驗(yàn)期7、14、21、28 d時(shí)BC中劑量組胸腺指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組，在試驗(yàn)期BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組胸腺指數(shù)均高于空白對(duì)照組。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響Tab.2 Effects of Bacillus coagulans on immune organ index of broilers

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

試驗(yàn)期第7天、第14天時(shí)BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞血液T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著提高(圖2A、圖2B)；試驗(yàn)期14 d時(shí)BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞血液T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)96 h時(shí)，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率繼續(xù)提高，且BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均顯著高于空白對(duì)照組和抗生素組(圖2B)，隨著肉雞飼喂凝結(jié)芽孢桿菌時(shí)間延長(zhǎng)，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用提高；試驗(yàn)28 d時(shí)的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)化增加(圖2D)；試驗(yàn)期21 d、35 d時(shí)，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有提高，其中BC低劑量組、BC高劑量組肉雞血液T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高效果更顯著，BC中劑量同樣也有促進(jìn)作用(圖2C、圖2E)。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞血液生化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間，肉雞血液生化指標(biāo)空白對(duì)照組與抗生素組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，BC低劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶活性顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，BC高劑量組尿素含量極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)見(jiàn)表3。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)肉雞血液細(xì)胞因子IL-10及抗體IgG水平的影響

試驗(yàn)期14 d時(shí)BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組肉雞血清中IL-10含量達(dá)到最高值，且BC高劑量組IL-10含量最高，與空白對(duì)照組與抗生素組差異非常顯著(圖3)。試驗(yàn)期14 d時(shí)BC高劑量組肉雞血清中IgG含量最高，與空白對(duì)照組差異顯著，隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，組間血清中IgG含量差異逐漸縮小(圖4)。

血液生化指標(biāo)Blood biochemical index空白對(duì)照組Blank control group抗生素組Antibiotic groupBC低劑量組BC low dose groupBC中劑量組BC medium dose groupBC高劑量組BC high dose group丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶ALT/(U/L)5.00±2.004.00±2.287.60±0.49*5.80±1.334.80±1.47谷草轉(zhuǎn)氨酶AST/(U/L)145.40±46.06153.40±19.20148.20±50.53148.40±52.10177.60±49.42堿性磷酸酶ALP/(U/L)1244.20±438.36941.40±167.171657.40±258.92892.00±323.03984.80±502.76總蛋白TP/(g/L)13.20±5.069.84±4.8313.34±4.6110.76±4.0614.56±7.88白蛋白ALB/(g/L)10.16±1.679.40±0.709.48±2.149.20±1.019.44±1.73尿素Urea/(mmol/L)0.80±0.130.90±0.061.00±0.140.94±0.191.38±0.21肌酐Crea(mmol/L)5.74±4.372.30±2.054.96±4.103.72±1.506.36±0.88**

3 討 論

無(wú)菌動(dòng)物體內(nèi)的淋巴器官發(fā)育遲緩，將其置于有菌環(huán)境中淋巴器官發(fā)育狀況有所好轉(zhuǎn)，體內(nèi)正常的菌群結(jié)構(gòu)有助于機(jī)體內(nèi)免疫器官的發(fā)育[8]。該試驗(yàn)期14、21、28 d時(shí)BC中劑量組肉雞免疫器官指數(shù)顯著增加，凝結(jié)芽孢桿菌可以提高肉雞免疫器官的發(fā)育，而試驗(yàn)期35 d時(shí)BC中劑量組胸腺指數(shù)逐漸下降，這可能由于凝結(jié)芽孢桿菌在腸道中大量繁殖，肉雞前期飼養(yǎng)過(guò)程中凝結(jié)芽孢桿菌刺激免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，但隨著肉雞機(jī)體的發(fā)育成熟，免疫器官和消化器官的發(fā)育趨于穩(wěn)定，凝結(jié)芽孢桿菌刺激其生長(zhǎng)發(fā)育的作用逐漸降低，與前人報(bào)道一致[9]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的淋巴細(xì)胞受到抗原等因素刺激，其會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變成一種母細(xì)胞，這是淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要途徑[10]。淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率是機(jī)體免疫水平的一把標(biāo)尺，當(dāng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)時(shí)，免疫細(xì)胞活性也會(huì)隨之增強(qiáng)，共同達(dá)到提高機(jī)體免疫水平的作用[11-12]。該試驗(yàn)肉雞養(yǎng)殖過(guò)程中飼料中加入2×107CFU/mL和2×109CFU/mL凝結(jié)芽孢桿菌時(shí)，BC低劑量組、BC高劑量組肉雞T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高，凝結(jié)芽孢桿菌提高肉雞免疫水平。IL-10屬于一種來(lái)源廣且功能多的細(xì)胞因子，IL-10是淋巴結(jié)、脾臟細(xì)胞生長(zhǎng)的復(fù)合因子，其可有效抑制促炎因子的產(chǎn)生而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖分化[13]。機(jī)體血清中主要由免疫球蛋白IgG占比最多，這種免疫球蛋白占總含量的70%左右，通過(guò)檢測(cè)免疫球蛋白IgG的含量可以反映出機(jī)體免疫能力的強(qiáng)弱。該試驗(yàn)中BC低劑量組、BC中劑量組、BC高劑量組14 d肉雞血清中IL-10含量高且免疫球蛋白IgG含量最高，凝結(jié)芽孢桿菌可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白抗體的分泌，從而提高肉雞機(jī)體的免疫能力。

肝臟和腎臟分別是異源物質(zhì)在機(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和代謝的主要場(chǎng)所。血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶和堿性磷酸酶等酶類(lèi)活性能反映肝臟細(xì)胞受損情況及嚴(yán)重程度。谷草轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶主要位于肝細(xì)胞胞漿水溶性部分或線(xiàn)粒體中，活性增高常提示肝細(xì)胞破壞、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)或線(xiàn)粒體損傷。堿性磷酸酶是一種去磷酸化酶，與磷酸化的激酶作用相反，其可阻止核酸、蛋白等的磷酸化，進(jìn)而影響DNA合成和細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。一定范圍內(nèi)的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶活性表示肝細(xì)胞代謝的活躍程度，該試驗(yàn)中BC低劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶活性顯著高于空白對(duì)照組，說(shuō)明該劑量在一定程度上對(duì)肝臟功能產(chǎn)生不利影響，損傷機(jī)制尚需進(jìn)一步研究；堿性磷酸酶主要來(lái)源肝臟和骨骼，因此檢測(cè)堿性磷酸酶的含量可以反映出肝臟和骨骼的狀態(tài)[14]。除此之外，堿性磷酸酶還能保護(hù)腸黏膜的完整性，抵御病原菌對(duì)腸道的損害[15]，各組之間谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性與總蛋白、白蛋白、尿素含量無(wú)顯著差異，且在正常范圍值之內(nèi)，說(shuō)明該試驗(yàn)采用的凝結(jié)芽孢桿菌具有一定的可飼喂安全性。林麗花等[16]試驗(yàn)證明，凝結(jié)芽孢桿菌顯著提高黃羽雞血清中堿性磷酸酶的活性。總蛋白是檢測(cè)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)[17]。肌酐是肌肉中磷酸肌酸的終末代謝產(chǎn)物，不能被重吸收，經(jīng)腎小球過(guò)濾后排出體外。血漿肌酐的濃度變化反映腎小球的濾過(guò)能力。通過(guò)測(cè)定尿素，可以了解腎小球的濾過(guò)功能。它主要是經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)，并隨尿液排出體外。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受損害時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，血液中血清尿素氮的濃度就會(huì)增加。該試驗(yàn)中BC高劑量組肌酐含量極顯著高于空白對(duì)照組，丁金雪等[13]試驗(yàn)表明空白對(duì)照組肉雞肌酐在27.82 mmol/L±2.46 mmol/L時(shí)，仍處于正常范圍內(nèi)，因此該試驗(yàn)各個(gè)試驗(yàn)組肉雞肌酐處于正常范圍內(nèi)。

凝結(jié)芽孢桿菌通過(guò)增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌及免疫抗體產(chǎn)生，提高免疫器官指數(shù)來(lái)提高肉雞的免疫功能，其中以凝結(jié)芽孢桿菌2×108CFU/mL時(shí)提高機(jī)體免疫作用最顯著且效果優(yōu)于桿菌肽。