閆江濤，高立偉，左一凡

（平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南 平頂山 467000）

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤，研究表明我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在結(jié)腸癌治療中有明顯的增效減毒的優(yōu)勢(shì)，具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系體外生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[1]。麥冬皂苷B是從中藥麥冬中分離出的一種單體，研究表明其具有抗腫瘤作用，如麥冬皂苷B可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬[2]。麥冬皂苷B可能通過上調(diào)miR-34a的達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖[3]。麥冬皂苷B可能通過激活JNK/c-Jun信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而抑制結(jié)腸癌的生長[4]。然而麥冬皂苷B影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制尚未完全清楚。有研究報(bào)道結(jié)腸癌組織中的微小RNA（miRNA）miR-142-3p的表達(dá)下調(diào)[5]。miR-142-3p高表達(dá)可在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[6]。本研究旨在研究麥冬皂苷B是否通過調(diào)控miR-142-3p影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取本院2017年1月～2019年1月經(jīng)病理檢測為結(jié)腸癌且具有完整臨床病理資料的25例患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織，患者術(shù)前未進(jìn)行過手術(shù)及放化療，所有患者均知情且同意。

1.2 儀器

FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Thermo FC酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.3 材料

結(jié)腸癌細(xì)胞HT29（上海圻明）；胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基（上海羽朵）；麥冬皂苷B（純度≥97 %，上海谷研）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8，杭州仟諾）；凋亡檢測試劑盒（上海經(jīng)科）；RIPA蛋白裂解液（北京百奧萊博）；熒光定量PCR試劑盒（上海滬震）；cyclin D1抗體，cleaved-caspase-3抗體（美國Abbiotec公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體（IgG-HRP）（美國AAT Bioquest公司）。

1.4 細(xì)胞處理與分組

結(jié)腸癌細(xì)胞HT29用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將其分別用10，20，40 μmol/L的麥冬皂苷B處理，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照（NC）組。

將miR-142-3p模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-142-3p模擬物、miR-142-3p抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-142-3p抑制劑（anti-miR-142-3p）轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞中，分別記為miR-NC組、miR-142-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-142-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-142-3p轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞后再用40 μmol/L的麥冬皂苷B處理，記為麥冬皂苷B+anti-miR-NC組、麥冬皂苷B+anti-miR-142-3p組。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力

選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞450 nm波長處的吸光度（OD）值。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測cyclin D1、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉90 min，加入cyclin D1和cleaved-caspase-3一抗，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG-HRP室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，測定蛋白條帶灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，先加入10 μl 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexin V-FITC），再加入5 μl 碘化丙啶（PI），混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-142-3p表達(dá)水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-142-3p以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-142-3p上游引物序列：5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACT-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6上游引物序列：5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度麥冬皂苷B組結(jié)腸癌細(xì)胞HT29活性降低，cyclin D1相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖1、表1。

圖1 Western Blot檢測cyclin D1蛋白的相對(duì)表達(dá)

表1 不同濃度麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖的影響（ ±s，n=9）

表1 不同濃度麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖的影響（ ±s，n=9）

注：與NC比較，*P＜0.05

組別 OD450 cyclin D1相對(duì)表達(dá)量NC 0.869±0.10 0.83±0.08 10 μmol/L 麥冬皂苷B 0.690±0.08* 0.72±0.07*20 μmol/L 麥冬皂苷B 0.513±0.04* 0.57±0.05*40 μmol/L 麥冬皂苷B 0.431±0.03* 0.38±0.04*F 72.342 88.909 P 0.000 0.000

2.2 麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響

與對(duì)照組相比，麥冬皂苷B（40 μmol/L）組結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響

表2 麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響（ ±s，n=9）

表2 麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響（ ±s，n=9）

注：與NC比較，*P＜0.05

NC 0.45±0.04 8.12±0.81麥冬皂苷B 0.93±0.09* 27.61±2.53*t 14.621 22.010 P 0.000 0.000

2.3 麥冬皂苷B對(duì)miR-142-3p表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，麥冬皂苷B組結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中miR-142-3p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 麥冬皂苷B對(duì)miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量的影響（ ±s，n=9）

表3 麥冬皂苷B對(duì)miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量的影響（ ±s，n=9）

注：與NC比較，*P＜0.05

組別 miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量NC 1.00±0.12麥冬皂苷B 3.27±0.30*t 21.076 P 0.000

2.4 miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中表達(dá)情況

與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中miR-142-3p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量情況（ ±s，n=25）

表4 miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量情況（ ±s，n=25）

注：與癌旁組織比較，*P＜0.05

癌旁組織 1.00±0.11結(jié)腸癌組織 0.38±0.03*t 27.189 P 0.000

2.5 miR-142-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖、凋亡的影響

與miR-NC組相比，miR-142-3p組miR-142-3p表達(dá)水平顯著升高，cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-142-3p組miR-142-3p表達(dá)水平顯著降低，cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖活性升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖3，表5。

2.6 miR-142-3p低表達(dá)對(duì)麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和凋亡的影響

與麥冬皂苷B+anti-miR-NC組相比，麥冬皂苷B+anti-miR-142-3p組miR-142-3p表達(dá)水平顯著降低，cyclin D1表達(dá)水平顯著升高，cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖活性升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖4，表6。

圖3 Western Blot檢測cyclin D1、cleavedcaspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)

圖4 Western Blot檢測cyclin D1、cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)

表5 miR-142-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖、凋亡的影響（ ±s，n=9）

表5 miR-142-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖、凋亡的影響（ ±s，n=9）

注：與miR-NC比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC比較，#P＜0.05

組別 miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量cyclin D1相對(duì)表達(dá)量cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)量 OD450 凋亡率/%miR-NC 1.00±0.11 0.85±0.08 0.46±0.05 0.857±0.12 8.09±0.81 miR-142-3p 3.28±0.30* 0.40±0.04* 0.95±0.09* 0.526±0.08* 21.49±2.01*anti-miR-NC 1.03±0.11 0.82±0.07 0.44±0.04 0.866±0.10 7.98±0.72 anti-miR-142-3p 0.48±0.04# 1.17±0.12# 0.15±0.02# 0.937±0.14# 3.23±0.27#t 483.801 131.604 314.476 24.143 420.824 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 miR-142-3p低表達(dá)對(duì)麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和凋亡作用的影響（ ±s，n=9）

表6 miR-142-3p低表達(dá)對(duì)麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和凋亡作用的影響（ ±s，n=9）

注：與麥冬皂苷B+anti-miR-NC比較，*P＜0.05

組別 miR-142-3p相對(duì)表達(dá)量cyclin D1相對(duì)表達(dá)量cleaved-caspase-3相對(duì)表達(dá)量 OD450 凋亡率/%麥冬皂苷B+anti-miR-NC 1.00±0.08 0.34±0.03 0.90±0.08 0.428±0.05 26.76±2.49麥冬皂苷B+anti-miR-142-3p 0.42±0.04* 0.72±0.07* 0.55±0.04* 0.715±0.09* 9.68±0.83*t 19.454 14.969 11.739 8.363 19.522 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

目前的化學(xué)藥物治療結(jié)腸癌仍具有嚴(yán)重的毒、副作用，開發(fā)毒性低、副作用小的抗結(jié)腸癌藥物是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，而中草藥的有效活性成分是篩選抗癌藥物的重要來源，中藥治療結(jié)腸癌也逐漸成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)[7-8]。研究報(bào)道麥冬皂苷B通過LINC00668/miR-432-5p上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）軸抑制A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9]。麥冬B素可在體內(nèi)和體外抑制A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成[10]。麥冬皂苷B抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，麥冬皂苷B處理的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29活性降低，cyclin D1表達(dá)水平顯著降低，cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高；cyclin D1是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，可影響細(xì)胞增殖；且研究報(bào)道cyclin D1在結(jié)腸癌中過度表達(dá)，與結(jié)腸癌的臨床病理特征緊密相關(guān)[12]。表明麥冬皂苷B可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道m(xù)iR-142-3p過表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。miR-142-3p高表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞系的生長和轉(zhuǎn)移[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-142-3p在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，miR-142-3p高表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-142-3p低表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。說明miR-142-3p在結(jié)腸癌中起抑癌作用。研究報(bào)道，通過上調(diào)miR-142-3p增強(qiáng)了結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）的敏感性[15]。本研究結(jié)果表明，麥冬皂苷B處理的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中miR-142-3p表達(dá)水平顯著升高，而miR-142-3p低表達(dá)可抑制麥冬皂苷B對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和凋亡的影響。說明麥冬皂苷B可能通過調(diào)控miR-142-3p影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡。

綜上所述，麥冬皂苷B可通過上調(diào)miR-142-3p的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為結(jié)腸癌的中藥治療提供新思路和理論依據(jù)。