李紫陽 楊克彬 高志民

(國際竹藤中心 北京 100102)

隨著城市化、工業(yè)化和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對(duì)不可再生化石材料的需求不斷增加，開發(fā)利用非木材生物質(zhì)資源成為必然。竹子因其產(chǎn)量高、生長周期短而成為一種具有應(yīng)用前途的木質(zhì)纖維素原料，同時(shí)優(yōu)異的機(jī)械和拉伸強(qiáng)度以及彈性，使其成為木材的良好替代品。竹材的力學(xué)性能在很大程度上取決于纖維細(xì)胞壁的木質(zhì)化程度，而木質(zhì)素的合成和沉積則伴隨著次生細(xì)胞壁(SCW)的形成。木質(zhì)素的含量和分布是竹材具有優(yōu)異力學(xué)性能的基礎(chǔ)，也是竹材加工工藝的重要基礎(chǔ)。因此，全面解析竹材木質(zhì)素生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，制定切實(shí)可行的策略調(diào)控竹材木質(zhì)素組成，不僅有助于提高竹材的力學(xué)性能，而且對(duì)竹材資源的開發(fā)利用有重要意義。

木質(zhì)素是一種芳香族細(xì)胞壁聚合物，其含量在維管植物中僅次于纖維素，它主要沉積在加厚的次生細(xì)胞壁中，對(duì)于機(jī)械支持、脅迫響應(yīng)和木材的形成是不可或缺的。木質(zhì)素的生物合成是通過苯丙氨酸解氨酶(PAL) 將苯丙氨酸脫氨形成肉桂酸，經(jīng)過各種酶的催化，最終由漆酶(LAC)和過氧化物酶氧化形成木質(zhì)素聚合物。目前，在木質(zhì)素生物合成的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中鑒定出大量NAC、MYB 和其他轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，它們進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游的酶基因。此外，在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中這些遺傳因子還受到許多miRNA 的靶向調(diào)控。研究表明，水稻木質(zhì)素生物合成的多個(gè)遺傳因子(miRNA 和轉(zhuǎn)錄因子) 調(diào)控木質(zhì)素生物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)。然而，單子葉植物中涉及miRNA、轉(zhuǎn)錄因子和酶基因的完整分級(jí)調(diào)控木質(zhì)素合成的網(wǎng)絡(luò)仍處于空白。目前，在竹種Boniaamplexicaulis、Guadua angustifolia、Olyra latifolia和Raddia guianensis中，參與竹木質(zhì)素生物合成途徑的酶基因分別有54、39、26 和33 個(gè)，然而對(duì)于毛竹木質(zhì)素生物合成的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然缺乏全面了解。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2018 年4 月，于江西南昌野外毛竹竹林中取樣。取5 個(gè)不同高度 (1.0、2.0、4.0、6.0 和8.0 m) 筍的第13 節(jié)間的上、中、下部為實(shí)驗(yàn)材料。樣品立即冷凍于液氮中，－80 ℃保存，用于RNA 提取和酶活性測定。同時(shí)，相同的2 份樣品分別用FAA 固定液固定和烘箱干燥后用于切片觀察和木質(zhì)素含量測定。樣品名稱被定義為‘筍－高度－部位’，例如，S－2－T、S－2－M 和S－2－L 分別代表2.0 m 筍的第13 節(jié)間的上部、中部和下部。此外，S－1 代表1.0 m 筍的上中下3 部分的混合樣本。

1.2 木質(zhì)素含量的組織化學(xué)染色和酶活性測量

參照文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法，將存放于FAA 固定液中的筍樣品進(jìn)行切片并用甲苯胺藍(lán)染色觀察。干燥的筍樣品充分研磨并過40 目篩后使用乙酰溴法進(jìn)行木質(zhì)素含量測定。此外，取存放于－80 ℃冰箱的筍樣品(0.1 g) 與緩沖液中充分研磨至勻漿，在4 ℃條件下13 000 rpm 離心15 min 后，收集上清液，并使用試劑盒進(jìn)行酶活性測定。

1.3 RNA 提取、文庫構(gòu)建、RNA-seq、miRNA和降解組測序

使用TRIzol 法提取13 個(gè)樣品的總RNA 用于轉(zhuǎn)錄組、miRNA 和降解組測序，進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，使用Agilent 2100 分析儀和NanoDrop 2000檢查總RNA 的質(zhì)量和純度，在BGISEQ-500 平臺(tái)上對(duì)文庫進(jìn)行測序。運(yùn)用NOISeq 軟件包鑒定篩選DEG，標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)≥2 和偏離概率值≥0.8。利用基于R 語言的GOseq 包進(jìn)行GO 富集分析，識(shí)別GO 功能類別。利用KOBAS 軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.4 qPCR 驗(yàn)證差異基因和差異miRNA

為了驗(yàn)證測序得到的miRNA 和基因的表達(dá)趨勢，使用Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)候選基因和miRNA 序列設(shè)計(jì)特異性引物，使用SYBR Green Master Mix 在qTOWER 熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。分別使用PeNTB和U6snRNA 作為基因和miRNAs 的內(nèi)參基因。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃10 min，95 ℃10 s，62 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)，采用2－ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 酵母單雜測定

將PeMYB20/85.2、PeMYB103.3和PeMYB4.1的編碼序列(CDS) 重組到pGADT7-Rec2 載體中，并將3 個(gè)AC 元件、3 個(gè)SMRE 元件以及PeLAC20啟動(dòng)子序列構(gòu)建到pHIS2 載體中。將重組載體共轉(zhuǎn)化Y187 菌株，轉(zhuǎn)基因植株在添加20 mM 3-AT的缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d。

1.6 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)

使用化學(xué)發(fā)光EMSA 試劑盒(Beyotime，中國) 進(jìn)行EMSA 實(shí)驗(yàn)。在探針兩端用生物素標(biāo)記含有AC 元件的PeLAC20啟動(dòng)子片段作為探針，標(biāo)記探針與純化的PeMYB4.1 和PeMYB20/85.2蛋白在25 ℃孵育1.0 h，在0.25×Tris/Borate/EDTA 緩沖液中用6%天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 分離，以未用生物素標(biāo)記的作為競爭探針。

1.7 PeLAC20 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以毛竹基因組DNA 和cDNA 為模板，從毛竹中擴(kuò)增出PeLAC20的CDS 序列和2 000 bp 的啟動(dòng)子序列，將PeLAC20的CDS 重組到pCAMBIA1301載體上。利用GV3101 菌株介導(dǎo)的花浸漬法將重組載體轉(zhuǎn)化到擬南芥(Col-0) 植株中。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選及功能驗(yàn)證

用含50 mg/L 潮霉素的MS 培養(yǎng)基篩選PeLAC20的轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行RT-PCR 驗(yàn)證。分別用乙酰溴化法和1% (v/v) 的間苯三酚對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥6 周齡幼苗的莖進(jìn)行了木質(zhì)素含量分析和組織學(xué)染色，使用光學(xué)顯微鏡(Olympus CX31，日本東京) 拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹筍快速生長過程中的形態(tài)和理化變化

對(duì)不同高度毛竹筍的代表性節(jié)第13 節(jié)間進(jìn)行組織化學(xué)染色分析表明，隨著竹筍高度增加，維管束染色細(xì)胞數(shù)量增加且染色加深，表明竹筍的生長木質(zhì)化程度逐漸增加。筍的木質(zhì)化程度在1.0 m 和2.0 m 之間幾乎不變，但在2.0 m 到4.0 m 之間木質(zhì)化程度急劇加深，之后其木質(zhì)化程度持續(xù)加深。在較成熟筍的上部、中部和下部木質(zhì)素含量分別顯著高于較幼嫩筍的相應(yīng)部分(p<0.01)。1.0 m 到4.0 m 筍上部木質(zhì)素含量高于中部和下部，而6.0 m 筍的上部、中部和下部的木質(zhì)素含量基本相同，各部位的木質(zhì)素含量差異不顯著，然而快速生長后期的筍即8.0 m 筍，其木質(zhì)素含量最高的是下部(122.67 mg/g)，其次是中部和上部(99.40 和90.78 mg/g)，這與組織化學(xué)染色的結(jié)果相一致。

PAL 和LAC 是木質(zhì)素合成和聚合的2 個(gè)關(guān)鍵酶，因此對(duì)不同高度筍中PAL 和LAC 的酶活性進(jìn)行檢測。1.0 m 和2.0 m 筍相較于較高筍中的PAL 活性較低，而4.0 m 筍的PAL 活性顯著高于2.0 m 筍，提高了2 倍。與6.0 m 筍相比，8.0 m筍中3 個(gè)部位的PAL 活性均呈下降趨勢，且在上部下降幅度的最大。與1.0 m 筍相比，2.0 m 筍的LAC 活性急劇上升，6.0 和8.0 m 筍LAC 活性基本相同，但8.0 m 筍LAC 活性相較于6.0 m 筍略有下降。這些結(jié)果表明，同一節(jié)間3 個(gè)部位的木質(zhì)化程度不一致，但隨著筍高度的增加，木質(zhì)化程度均逐漸加深。

2.2 參與到筍木質(zhì)化過程中的DEG 的鑒定

通過測序，13 個(gè)樣本共產(chǎn)生441 803 萬raw reads，其中96.28% (425 387 萬)為高質(zhì)量reads，在質(zhì)控后與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，平均94.84%的clean reads 被定位到毛竹的基因組上。一個(gè)基因的FPKM (每千堿基百萬個(gè)片段)≥1，則認(rèn)為該基因在該樣本中表達(dá)。在檢測到的44 970 個(gè)基因中，31 516 個(gè)基因至少在一個(gè)樣本中檢測到表達(dá)，且隨著筍高度的增加，表達(dá)基因數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

共鑒定出25 655 個(gè)基因至少在一個(gè)組合中的表達(dá)有顯著差異。各個(gè)組合的DEG 的數(shù)量從113(S-8-MVSS-8-L，52 個(gè)上調(diào)和61 個(gè)下調(diào)) 至17 584 (S-2-MVSS-4-M，6 641 個(gè)上調(diào)和10 943個(gè)下調(diào)) 不等。不同高度筍第13 節(jié)節(jié)間的同一部位相比，DEG 的數(shù)量呈先增加后減少的趨勢，且峰值在S-2VSS-4，不同高度筍上部的DEG 數(shù)量的差異比其他部位小。此外，上、下2 部分之間的DEG 均高于其他組合，同一節(jié)間不同部位的DEG 差異隨著筍高度的增加而逐漸縮小。與前一高度筍相比，各組合共檢測到13 924 個(gè)DEG；通過比較同一節(jié)間的不同部分，各組合共發(fā)現(xiàn)17 487個(gè)DEG。綜上，共鑒定了11 504 個(gè)DEG，表明在筍的快速生長過程中轉(zhuǎn)錄水平存在活躍的動(dòng)態(tài)變化機(jī)制。

2.3 DEG 的功能富集分析

在11 504 個(gè)DEG 中，8 381 個(gè)具有GO 注釋，共注釋獲得5 610 個(gè)GO terms，其中生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分分別具有3 389、1 582 和639個(gè)GO terms。具有高基因數(shù)量的生物學(xué)過程是細(xì)胞過程(Cellular process，GO ∶0009987)、代謝過程(Metabolic process，GO ∶0008152)、單一生物過程 (Single-organism process，GO ∶ 0044699)、生物調(diào)控(Biological regulation，GO ∶0065007)、生物過程調(diào)控 (Regulation of biological process，GO ∶ 0050789)。在分子功能類別中，結(jié)合(Binding，GO ∶0005488)、催化活性 (Catalytic activity，GO ∶0003824)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性 (Transporter activity，GO ∶ 0005215)、結(jié)構(gòu)分子活性(Structural molecule activity，GO ∶0005198) 最具代表性。在細(xì)胞成分范疇內(nèi)，大量的基因被分配到細(xì)胞(Cell，GO ∶0005623)、細(xì)胞部位(Cell part，GO ∶0044464)、細(xì)胞器(Organelle，GO ∶0043226)、細(xì)胞膜(Membrane，GO ∶0016020)。對(duì)DEG 進(jìn)行KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)它們共富集到123 個(gè)通路中。除核糖體途徑 (ko03010)外，苯丙氨酸生物合成途徑(ko00940) 是最富集途徑之一，其中大部分基因參與了木質(zhì)素的生物合成。此外，許多DEG 被富集到次生代謝產(chǎn)物的合成(ko01110) 和代謝途徑(ko01100)，其中大部分基因參與了生長發(fā)育所必需的次生代謝產(chǎn)物的合成。與碳水化合物和纖維素生物合成相關(guān)的DEG 顯著富集到類黃酮生物合成(ko00941)和淀粉以及蔗糖代謝(ko00500)。

2.4 DEG 在木質(zhì)化過程中的表達(dá)模式

通過聚類分析，11 504 個(gè)DEG 被分為4 個(gè)主要的Cluster。隨著筍高度的增加，Cluster I 中DEG 呈下調(diào)趨勢，它們參與細(xì)胞組織、細(xì)胞分裂、有絲分裂的細(xì)胞周期等細(xì)胞周期過程以及細(xì)胞發(fā)育等生物學(xué)過程，其中包括著絲粒蛋白E、DNA 結(jié)合蛋白和細(xì)胞分裂控制蛋白45 等。Cluster II 中DEG 的表達(dá)呈增加趨勢，它們與SCW 的沉積和形成、次生代謝物的生物合成、各種運(yùn)輸途徑和信號(hào)途徑相關(guān)，包括木質(zhì)素生物合成、氮化合物的運(yùn)輸、氨基酸的跨膜運(yùn)輸?shù)?，如PAL 基因和LAC 基因。Cluster III 中的DEG 呈現(xiàn)先增加后減少的表達(dá)趨勢，它們參與細(xì)胞壁組織或生物合成，細(xì)胞壁大分子生物合成過程，該Cluster 中的大量DEG 與木質(zhì)部生物合成、分解代謝和代謝過程以及半纖維素和纖維素代謝過程相關(guān)。Cluster IV 中的DEG 的表達(dá)模式復(fù)雜多樣。此外，KEGG與GO 富集分析結(jié)果一致，苯丙氨酸生物合成是Cluster II 中顯著富集的KEGG 途徑之一。

2.5 參與木質(zhì)素生物合成調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子

研究中發(fā)現(xiàn)，59 個(gè)家族的3 823 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因至少在一個(gè)組合中差異表達(dá)，MYB (483)、MYB-related (377)、AP2-EREBP (303)、NAC(275) 等家族成員數(shù)目最多。篩除低豐度轉(zhuǎn)錄因子基因后，在毛竹中發(fā)現(xiàn)了30 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥木質(zhì)素合成調(diào)控的同源。幾乎所有的轉(zhuǎn)錄因子基因都有相似的上調(diào)趨勢(先增加后減少)，只有少數(shù)隨筍高度的增加而持續(xù)增加。4 個(gè)NST/SND 轉(zhuǎn)錄因子被鑒定為主要調(diào)節(jié)因子，它們在較高的筍中高表達(dá)，而作為次級(jí)調(diào)控因子的MYB4s與NST/SND表現(xiàn)出相似的表達(dá)趨勢。4 個(gè)MYB4在木質(zhì)素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的第2 層，其表達(dá)從嫩筍到老筍逐漸增加，在1.0 和2.0 m 筍中表達(dá)量較低；但在同一節(jié)間內(nèi)卻由上至下逐漸增加。

2.6 參與木質(zhì)素生物合成的酶基因

研究中共鑒定了毛竹木質(zhì)素生物合成相關(guān)12個(gè)家族280 個(gè)酶基因，其中153 個(gè)為DEG，其中48 個(gè)基因與擬南芥中已鑒定的基因同源。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，幾乎所有基因在S-1 樣品中的表達(dá)量極低，尤其是參與木質(zhì)素生物合成最后階段的LAC和PRX，幾乎沒有檢測到表達(dá)，之后這些基因被激活，特別是在4.0 m 筍中，其表達(dá)量急劇增加。在8.0 m 筍中，43 個(gè)DEG 的表達(dá)在所有部位都大幅下降。另外發(fā)現(xiàn)，在毛竹木質(zhì)素生物合成途徑中，上游基因的表達(dá)比下游基因的表達(dá)更早、更強(qiáng)。

2.7 miRNA 測序數(shù)據(jù)整體分析

為了鑒定毛竹快速生長過程中與木質(zhì)化相關(guān)的miRNAs，構(gòu)建了13 個(gè)miRNA 文庫并進(jìn)行了測序，在過濾低質(zhì)量reads 之后，總共獲得了58 871萬個(gè)clean reads。，21 nt (46.94%) 的miRNA 是最豐富的一類，其次是24 nt (20.51%)、22 nt(15.85%) 和23 nt (9.92%) 的miRNA。總共獲得了1 502 個(gè)miRNAs，其中已知的1 223 個(gè)，新的279 個(gè)，被聚類為237 個(gè)家族，且每個(gè)家族的成員存在明顯差異。237 個(gè)家族中只有25 個(gè)家族的成員超過10 個(gè)，其中最多的是Ped-MiR166家族，有59 個(gè)成員，其次是Ped-miR159(58 個(gè))和Ped-miR369(46 個(gè))。160 個(gè)家族只有1 或2 個(gè)成員，如Ped-miR161、Ped-miR173、Ped-miR1023和Ped-miR1024。

2.8 木質(zhì)化過程中差異表達(dá)的miRNAs(DEM)

結(jié)果表明，大多數(shù)已鑒定的miRNA 在多個(gè)樣本中均有表達(dá)，在所有樣本中共發(fā)現(xiàn)687 個(gè)DEM，其中441 個(gè)是已知的、246 個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的，這些DEM 的表達(dá)趨勢與DEG 具有相似的趨勢。根據(jù)DEM 的TPM (transcript per million)，將相同高度的DEM 合并進(jìn)行聚類分析，表達(dá)模式被聚為4 大類。隨著筍高度的增加，Cluster I 的DEM 呈下降趨勢，Cluster II 的DEM 呈上升趨勢，而Cluster III 的DEM 呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，與DEGs 相似，表達(dá)譜復(fù)雜的DEM 聚集在Cluster IV中。此外，有些DEM 的表達(dá)趨勢與DEG 完全相反，這表明它們之間可能存在潛在的負(fù)調(diào)控靶向關(guān)系。

2.9 通過生信分析和降解組分析預(yù)測的miRNA 靶基因

根據(jù)已鑒定的miRNA 和毛竹已注釋mRNA 序列，使用TargetFinder軟件識(shí)別到1 430 個(gè)miRNAs 靶向于25 350 個(gè)基因，存在30 378 個(gè)miRNA-mRNA 對(duì)，包括610 個(gè)miRNAs 和7 940 個(gè)基因。此外，從降解組測序共識(shí)別了262 個(gè)已知的miRNAs 靶向135個(gè)基因，構(gòu)成1 216 個(gè)miRNA-mRNA 對(duì)。通過生信預(yù)測和降解組分析，共鑒定出718 個(gè)(532 個(gè)為已知的、186 個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的) DEM 靶向7 972 個(gè)基因。miRNA 與其靶基因共同參與多種生物過程，如氮化合物代謝過程的調(diào)控和有機(jī)循環(huán)化合物代謝過程的調(diào)控。生信預(yù)測和降解組測序均檢測到的miRNA 共有103個(gè)，這為研究毛竹筍快速生長過程中miRNA 對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控提供可靠信息。

2.10 木質(zhì)素生物合成相關(guān)基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

在30 378 對(duì)miRNA-mRNA 對(duì)中，有16 467對(duì)(由5 756 個(gè)基因和691 個(gè)miRNA 組成) 耦合。通過降解組測序驗(yàn)證了一些miRNA-mRNA對(duì)，如PH02Gene04996和PH02Gene45333，它們被Ped-miR397a.1識(shí)別和切割。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA) 結(jié)果表明:DEG 聚集到14個(gè)主要分枝，每個(gè)分支代表1 個(gè)模塊。進(jìn)一步分析表明green、bisque4、maroon、darkgrey 和coral1等5 個(gè)模塊與木質(zhì)化程度呈高度正相關(guān)，表明這些模塊中的基因可能在筍木質(zhì)素生物合成中起重要作用。

結(jié)合木質(zhì)素生物合成途徑、WGCNA 和相關(guān)的miRNA-mRNA 對(duì)的分析，構(gòu)建了一個(gè)包含11個(gè)miRNA、22 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和36 個(gè)酶基因的木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步分析表明，在4 個(gè)MYB103和36 個(gè)關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了SCW NAC結(jié)合元件(SNBE)、AC 元件和SCW MYB 反應(yīng)元件(SMRE)。3 個(gè)NST/SND 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控PeMYB103的表達(dá)來參與該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而下游的17 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控來自36 個(gè)酶基因。此外，相關(guān)性分析可知所有22 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子至少與1 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因具有極強(qiáng)的相關(guān)性。

2.11 木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中遺傳因子的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，采用RT-qPCR檢測了網(wǎng)絡(luò)中11 對(duì)miRNA-mRNA 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA 與相對(duì)應(yīng)的mRNA 呈相反的表達(dá)趨勢，這與高通量測序的結(jié)果相似。部分miRNAmRNA 對(duì)，如Ped-miR397b.1/Ped-miR397b.3-PeLAC35(PH02Gene45333) 和Ped-miR397b.1/Ped-miR397b.3-PeLAC10(PH02Gene04996) 通過降解組測序得到了證明。此外，大多數(shù)miRNAmRNA 對(duì)在快速生長后期(6.0 和8.0 m) 相耦合，這與降解組測序結(jié)果一致。一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的RT-qPCR 結(jié)果表明，它們的表達(dá)模式與其靶向木質(zhì)素生物合成相關(guān)酶基因相似，而酶基因啟動(dòng)子序列中調(diào)控元件的分析和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了酶基因受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

在毛竹基因組中共鑒定出43 個(gè)LAC 基因(PeLAC1～ PeLAC43)。PeLAC20 與AtLAC4 有較高的氨基酸序列相似性，AtLAC4參與到擬南芥莖的木質(zhì)化過程，本研究利用在擬南芥中過表達(dá)PeLAC20的來研究其功能。獲得了4 個(gè)PeLAC20的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，對(duì)2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(L1 和L3) 進(jìn)行了木質(zhì)素的分析，結(jié)果表明L1 和L3 的莖部維管束比Col-0 染色更深，木質(zhì)素含量更高，表明過表達(dá)PeLAC20可以促進(jìn)擬南芥的木質(zhì)化。此外，過表達(dá)PeLAC20的酵母細(xì)胞在含有ABTS的底物上呈現(xiàn)深綠色，證明該蛋白是銅離子結(jié)合蛋白，其酶活性最高為2.031 U/mL。

為了證實(shí)PeMYB4.1 和PeMYB20/85.2 與PeLAC20啟動(dòng)子的相互作用，進(jìn)行酵母單雜和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)。酵母單雜證實(shí)PeMYB4.1和PeMYB20/85.2 能夠與PeLAC20啟動(dòng)子結(jié)合。EMSA 結(jié)果表明，隨著未生物素標(biāo)記的探針(冷探針) 的增加，生物素探針與蛋白的結(jié)合效率逐漸降低。因此，提出了一個(gè)可靠的miRNA 介導(dǎo)的‘MYB-PeLAC20’ 的木質(zhì)素單體聚合模型。

3 討論

竹稈是竹子的主要利用部位，其形態(tài)建成經(jīng)歷了地下筍生長、地上筍(未成熟莖) 快速生長和竹稈纖維細(xì)胞壁連續(xù)木質(zhì)化3 個(gè)重要時(shí)期，竹筍的快速生長伴隨著纖維束的木質(zhì)化。竹纖維具有強(qiáng)度高、韌性好、剛性大、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，體現(xiàn)了竹稈優(yōu)良的物理力學(xué)性能。一般認(rèn)為，竹的木質(zhì)化過程是竹初生細(xì)胞壁形成后木質(zhì)素動(dòng)態(tài)沉積的過程。竹子的快速生長主要是通過每一個(gè)節(jié)間來實(shí)現(xiàn)的，其中木質(zhì)化程度對(duì)竹子性能發(fā)揮著重要作用。因此，系統(tǒng)研究快速生長過程中具有代表性的筍單個(gè)節(jié)間的木質(zhì)化現(xiàn)象，將有助于闡明整個(gè)毛竹木質(zhì)化的調(diào)控機(jī)制。

3.1 竹筍木質(zhì)化過程中的動(dòng)態(tài)變化

基于形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和組學(xué)的分析，將竹筍快速生長期的木質(zhì)化過程分為3 個(gè)階段，并且在單個(gè)節(jié)間不同部位在3 階段存在一個(gè)特殊的木質(zhì)化程度的轉(zhuǎn)變過程。在第I 階段是從筍1.0 m 到2.0 m，期間筍的木質(zhì)化進(jìn)程非常緩慢，因?yàn)榇藭r(shí)大部分細(xì)胞處于分裂伸長階段，同樣參與木質(zhì)素合成的酶活性均處于較低水平。第II 階段是從筍2.0 m 到6.0 m，該過程筍的木質(zhì)化速度較快，此時(shí)細(xì)胞分裂和伸長趨于結(jié)束，隨之木質(zhì)素合成的酶活性提高，木質(zhì)素加速合成和沉積，細(xì)胞以細(xì)胞壁的增厚為主要生物學(xué)過程。在第III 階段，筍進(jìn)一步木質(zhì)化，但是其速度明顯減慢，筍逐步生長成為木質(zhì)素含量較高的新竹，在這個(gè)階段筍細(xì)胞的伸長已完成且木質(zhì)素生物合成相關(guān)的酶活性依然保持在高水平。

筍的木質(zhì)化速率在快速增長期間經(jīng)歷了一個(gè)先上升后下降的過程，同時(shí)組織化學(xué)分析和木質(zhì)素含量也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。雖然在細(xì)胞伸長完成和木質(zhì)化開始這3 個(gè)階段之間沒有明確的界限，但我們認(rèn)為它們是同時(shí)發(fā)生的。此外，同一節(jié)間的3 個(gè)部分在時(shí)間和空間上經(jīng)歷了類似的生物過程但并不同步，這就導(dǎo)致不同程度的木質(zhì)化同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)節(jié)間。在第I 階段和第II 階段，木質(zhì)化程度從上至下依次降低，這與同一節(jié)間中細(xì)胞伸長從上至下依次發(fā)生并完成的結(jié)果相一致。然而，在8.0 m 筍節(jié)間不同部位的木質(zhì)化程度發(fā)生了一個(gè)相反的變化，變?yōu)橄虏?中部>上部，該結(jié)果與木質(zhì)素含量以及組織化學(xué)染色的結(jié)果相一致。這可能與筍籜的衰老和脫落有關(guān)，籜起初承擔(dān)著竹筍的保護(hù)者和碳水化合物供給者的角色，然后隨著節(jié)間木質(zhì)化程度的增加，尤其是單個(gè)節(jié)間下部，這使得節(jié)間有足夠的力量支撐整個(gè)竹稈，此時(shí)籜完成其使命逐漸老化直至最后脫落。但是，木質(zhì)化與籜衰老之間的關(guān)系尚無實(shí)驗(yàn)證明，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

3.2 木質(zhì)素生物合成酶基因的時(shí)空表達(dá)變化

生物過程的動(dòng)態(tài)變化依賴于基因的時(shí)空表達(dá)。本研究中與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因的表達(dá)隨著筍的生長持續(xù)下降，但與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的基因的表達(dá)量從第I 階段到第III 階段呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，這與先前孝順竹的單節(jié)間的研究結(jié)果一致。木質(zhì)化依賴于木質(zhì)素的生物合成，涉及多種代謝途徑，其中最重要的是苯丙烷代謝途徑 (ko00360 和ko00940)，該結(jié)果與我們的GO 和KEGG 通路分析一致。本研究中，毛竹中共鑒定出280 個(gè)參與木質(zhì)素生物合成的基因，超過擬南芥(112)、毛白楊(193) 和水稻(126)，表明部分基因家族可能會(huì)發(fā)生基因加倍事件，而這些基因加倍可能是其木質(zhì)化速度快和機(jī)械性能優(yōu)良的原因。

此外，本研究中發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素生物合成途徑中的48 個(gè)DEG 表達(dá)量較高，它們的表達(dá)模式與筍的木質(zhì)化的動(dòng)態(tài)變化趨勢基本一致，表明它們是毛竹木質(zhì)素生物合成的主要候選基因。PAL 催化L-苯丙氨酸脫氨轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，并使碳通量從初級(jí)代謝轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸代謝。PePAL在筍木質(zhì)化過程中表達(dá)量上調(diào)，這與楊樹的研究結(jié)果一致。5 個(gè)PePAL在筍發(fā)育的早期階段在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)高于其他DEGs，原因可能是它們的激活為下游木質(zhì)素生物合成提供大量的肉桂酸進(jìn)入苯丙氨酸通路。酶基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)具有高度的時(shí)空特異性，酶活性隨之發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，導(dǎo)致竹筍單個(gè)節(jié)間木質(zhì)化的時(shí)空差異。

3.3 竹子木質(zhì)化調(diào)控過程中轉(zhuǎn)錄因子與miRNAs 的普遍性與特殊性

目前，擬南芥的次生細(xì)胞壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已較為完善，該網(wǎng)絡(luò)是由不同的miRNAs 和轉(zhuǎn)錄因子組成，它們可以激活或抑制12 個(gè)家族的木質(zhì)素生物合成相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，導(dǎo)致木質(zhì)化的動(dòng)態(tài)變化。NST/SND 轉(zhuǎn)錄因子是通過調(diào)控MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因從而啟動(dòng)木質(zhì)素生物合成的主控開關(guān)。本研究中6 個(gè)NACs 和13 個(gè)MYB 與酶基因發(fā)生互作，大多數(shù)上游調(diào)控因子與其推測的靶基因的表達(dá)呈現(xiàn)很強(qiáng)相關(guān)性。下游轉(zhuǎn)錄因子和酶基因與上游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式相似，RT-qPCR和酵母單雜實(shí)驗(yàn)間接驗(yàn)證了這一點(diǎn)。此外，降解組測序和RT-qPCR 對(duì)miRNAs 靶向的酶基因的驗(yàn)證也支持了它們之間的調(diào)控關(guān)系。

本研究鑒定了9 個(gè)與竹筍木質(zhì)化相關(guān)的MYB，直接正向調(diào)控酶基因的時(shí)空表達(dá)。同時(shí)，還有4 個(gè)PeMYB4作為負(fù)向調(diào)控因子在竹筍中高表達(dá)，它們與反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，這與之前擬南芥中的研究一致。AtMYB26 作為NAC 的上游調(diào)控因子，在調(diào)控次生細(xì)胞壁的形成中起著至關(guān)重要的作用。AtMYB26 和AtVND6/7 與毛竹中同源基因間的序列相似性很低(<40%)，且編碼這些蛋白的基因在筍中的表達(dá)水平極低，原因可能是這些基因主要不是在筍中表達(dá)，水稻和擬南芥的相關(guān)研究結(jié)果也支持這樣的假設(shè)，即AtMYB26和AtVND6/7在花藥和其他花組織中特異表達(dá)。由此表明，NAC 和MYB 在毛竹筍中的調(diào)控關(guān)系尚不明確。

多種miRNA 通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和木質(zhì)素生物合成基因，在木質(zhì)化過程的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮多種重要作用。本研究中也證明PeLAC35是PedmiR397a.1 的靶向基因，該結(jié)果表明miR397 在不同物種間的木質(zhì)素生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中功能是保守的。miR164 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在木質(zhì)化形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究中同樣PedmiR164a.1 被鑒定為木質(zhì)化過程中調(diào)控LAC的抑制因子。然而，在本研究中沒有檢測到與miR397和miR164 等保守miRNA 特異靶向的轉(zhuǎn)錄因子。相反，在PeNST/SND1.2和PeMYB20/85.2中被鑒定為Ped-miR528-3p 和Ped-miR399j-5p 的靶基因，在PeSND2/3.1和PeSND2/3.4中發(fā)現(xiàn)了unkown_ Ped-miR_ 44的切割靶點(diǎn)，這為竹子木質(zhì)化過程中遺傳調(diào)控研究提供了新的思路。

3.4 竹子木質(zhì)化調(diào)控模型

本研究通過整合mRNA 和miRNA 的聯(lián)合分析，結(jié)合降解組測序，確定了竹筍木質(zhì)化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為其他單子葉植物木質(zhì)素調(diào)控的研究提供了參考。在綜合分析的基礎(chǔ)上，成功地建立了一個(gè)復(fù)雜的竹筍木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括11 個(gè)miRNA、22 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和36 個(gè)關(guān)鍵酶基因，提出了miRNA 介導(dǎo)的‘MYB-PeLAC20’ 的木質(zhì)素單體聚合的調(diào)控模型。研究結(jié)果為全面理解毛竹木質(zhì)素生物合成途徑中miRNA、轉(zhuǎn)錄因子和酶基因的協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要參考價(jià)值，有助于通過基因工程來實(shí)現(xiàn)提高竹子的產(chǎn)量和品質(zhì)。

原文出處

Yang K B，Li L，Lou Y F，Zhu C L，Li X，Gao Z M.A regulatory network driving shoot lignification in rapidly growing bamboo.Plant Physiology，Published:19 June 2021.DOI:https://doi.org/10.1093/plphys/kiab289.