Graves病動(dòng)物模型構(gòu)建的研究進(jìn)展

冒婧敬, 相萍萍, 2, 劉 超, 2

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝病中心, 江蘇 南京, 210028;2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 江蘇 南京, 210028)

Graves病(GD)是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，典型臨床表現(xiàn)為高代謝癥候群，甲狀腺彌漫性腫大，部分患者可伴有Graves眼病或局限性脛前黏液性水腫[1]。GD的發(fā)病機(jī)制主要是促甲狀腺激素受體(TSHR)與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)結(jié)合，刺激甲狀腺激素大量釋放，甲狀腺濾泡增生，從而導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)[2]。其中TRAb是一種自身免疫性抗體，分為刺激性抗體(TSAb)以及阻斷性抗體(TBAb)。在GD患者中，以刺激性抗體TSAb表達(dá)為主[3]。鑒于TSHR與GD發(fā)病相關(guān)，目前GD造模多以此為切入點(diǎn)。本文就GD模型構(gòu)建造模材料、造模方法、造模成功指標(biāo)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 改進(jìn)造模材料構(gòu)建GD模型

TSHR可在體內(nèi)產(chǎn)生抗原性抗體與抗原表位相結(jié)合，導(dǎo)致GD發(fā)生，故GD模型的構(gòu)建多基于表達(dá)TSHR的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的造模方法主要包括采用表達(dá)TSHR的細(xì)胞、表達(dá)TSHR的質(zhì)粒DNA以及表達(dá)TSHR的重組腺病毒。

1.1 表達(dá)TSHR的細(xì)胞免疫

1996年SHIMOJO N等[4]首次成功建立GD模型，研究者以攜帶人TSHR基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RT4.15HP后的細(xì)胞為載體，免疫AKR/N(H-2K)小鼠，每2周免疫1次，共計(jì)6次，最終約25%的模型小鼠出現(xiàn)總甲狀腺素(T4)水平增高、TSAb陽性及甲狀腺彌漫性腫大，提示造模成功。此后，有學(xué)者[5]采用表達(dá)人TSHR和小鼠TSHR的M12(hM12、mM12)細(xì)胞免疫BALB/c小鼠，最終成功誘導(dǎo)TSAb、T4水平升高并出現(xiàn)典型甲亢癥狀; 而后應(yīng)用表達(dá)TSHR的重組腺病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞并注射免疫BALB/c小鼠，亦成功誘導(dǎo)約25%的小鼠出現(xiàn)甲亢[1]。但以上造模方式繁瑣，均需使用其他載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再免疫小鼠，且成模率較低、穩(wěn)定性差等，逐漸淡出研究者視線。

1.2 表達(dá)TSHR的質(zhì)粒DNA

表達(dá)TSHR的質(zhì)粒DNA也可有效誘導(dǎo)GD發(fā)生。既往研究[3]發(fā)現(xiàn)，將表達(dá)TSHR的質(zhì)粒DNA(pc DNA 3.1-TSHR)在小鼠雙側(cè)股四頭肌注射，結(jié)果小鼠體內(nèi)血清TRAb濃度增高, T4、TSAb水平均增高，而TBAb水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 甲狀腺組織呈現(xiàn)甲狀腺濾泡增生、膠質(zhì)濃縮等GD的病理表現(xiàn)，提示該質(zhì)?？捎行ЫD小鼠模型。同樣, XIA N等[6]采用pcDNA3.1質(zhì)粒載體構(gòu)建pcDNA3.1-T289重組質(zhì)粒DNA, 使90%小鼠出現(xiàn)明顯的甲狀腺腫大和甲亢表現(xiàn), 80%實(shí)驗(yàn)小鼠血清T4、TRAb水平顯著升高合并甲狀腺濾泡肥大和增生，同時(shí)MRI顯像能明顯觀察到小鼠眼眶肌肉成纖維細(xì)胞增大，提示應(yīng)用質(zhì)粒DNA可成功構(gòu)建GD小鼠模型。此外, pcDNA3.1-TSHR268 重組質(zhì)粒也可顯著提高小鼠模型的TSHR水平[7], 但重組質(zhì)粒免疫的小鼠常會(huì)出現(xiàn)甲減而非甲亢[8]。質(zhì)粒DNA重組方式多樣，一部分如pBacMam-2或pTriEx-1.1構(gòu)建的質(zhì)粒DNA, 具有更高的穩(wěn)定性，但代價(jià)較高[9]。部分質(zhì)粒DNA在短期實(shí)驗(yàn)中無法有效誘導(dǎo)小鼠發(fā)生GD[6]。上述不足限制了質(zhì)粒DNA的應(yīng)用，仍有待進(jìn)一步完善。

1.3 表達(dá)TSHR的重組腺病毒

相對(duì)于質(zhì)粒DNA載體，采用表達(dá)TSHR全長或TSHR A亞單位的重組腺病毒造模重復(fù)性更好，成模率更高。GD 的發(fā)病是由于TSHR結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，在二硫鍵異構(gòu)酶以及蛋白酶酶解作用下，連接A、B 2個(gè)亞單位的二硫鍵發(fā)生溶解斷裂, TSHR-A亞單位脫落表達(dá)于細(xì)胞表面，誘發(fā)并增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)[10]。脫落出來的A亞單位三聚體結(jié)構(gòu)與致病性TSAb的抗體具有更高的親和力[11]。

CHEN C R等[12]在2003年構(gòu)建重組腺病毒Ad-TSHR289, 造模成功率高達(dá)86%, 并具有高度可重復(fù)性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用表達(dá)TSHR-A亞單位的腺病毒比表達(dá)TSHR全長者具有更高的造模成功率, TSAb活性也更高。此后，研究者多采用表達(dá)TSHR-A亞單位的重組腺病毒進(jìn)行造模。伍麗萍等[13]為比較表達(dá)TSHR的質(zhì)粒DNA和腺病毒的造模效果，分別建立質(zhì)粒組和病毒組小鼠模型，質(zhì)粒造模組予pcDNA3.1-TSHR 50μg皮內(nèi)注射，造模組予肌肉注射Ad-TSHR289, 重組腺病毒造模組中所有小鼠的TRAb和T4水平均升高, 8只小鼠中6只出現(xiàn)甲狀腺增大、甲狀腺濾泡組織增生等甲亢癥狀，而質(zhì)粒造模組僅2只小鼠出現(xiàn)較弱TSHR抗體反應(yīng)且總T4水平?jīng)]有升高，甲狀腺組織未發(fā)生增生性改變。另一研究[14]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用TSHR重組腺病毒A亞單位長時(shí)間(3～4周)免疫BALB/c小鼠可以顯著增加小鼠抗TSHR抗體滴度，促進(jìn)TSHR依賴性cAMP水平提高; 同時(shí)能夠促使小鼠出現(xiàn)典型甲狀腺腫、甲狀腺濾泡組織明顯增大，且上述作用可維持長達(dá)9個(gè)月，此外，模型小鼠還出現(xiàn)了心臟肥大、心臟重量增加以及心動(dòng)過速現(xiàn)象。以上研究表明重組腺病毒建立GD模型更穩(wěn)定、成功率更高。盡管該法還需進(jìn)一步改進(jìn)，但仍是目前GD造模材料的最佳選擇[15]。

2 改進(jìn)造模方法構(gòu)建GD模型

2.1 改進(jìn)給藥途徑

目前GD模型的制備可采用多種給藥途徑，主要包括腹腔注射、股四頭肌肌肉注射、尾靜脈注射以及電穿孔注射等方法。

早期采用表達(dá)TSHR的細(xì)胞免疫小鼠時(shí)，多采取腹腔注射細(xì)胞，但該法成模率低，逐漸被淘汰。肌肉注射是目前應(yīng)用最廣泛的給藥方式，無論是采用表達(dá)TSHR A亞單位的腺病毒還是質(zhì)粒DNA都可采用肌肉注射且效果較好。趙紫琴等[3]對(duì)BALB/c小鼠雙側(cè)股四頭肌注射pcDNA3.1/hTSHR(188～403 bp)質(zhì)粒DNA, 每3周1次，共免疫5次，在第2次免疫后發(fā)現(xiàn)小鼠T4、TRAb以及TSAb水平顯著升高，病理顯示甲狀腺濾泡增生，提示成功建立了GD模型。

電穿孔(EP)載藥也是造模的有效方法之一。電穿孔介導(dǎo)pC1-hTSHR289His-IRES-CD4 載體免疫小鼠，可使其發(fā)生甲亢并可檢測出高滴度TSAb抗體，且該抗體活性明顯高于多數(shù)模型[16-17]。與構(gòu)建病毒載體相比，電穿孔表達(dá)載體快捷、方便，無需建立表達(dá)或突變體的細(xì)胞系。重組質(zhì)粒pcDNA3.1/TSHR268加電穿孔方法也可成功構(gòu)建GD動(dòng)物模型[18], 在造模第4周時(shí)，小鼠血清中T4、TRAb羧基端抗體和氨基端抗體水平均達(dá)到最高值，停止免疫后18周仍明顯高于免疫前水平，提示電穿孔法或可延長GD的成模時(shí)間。不僅如此，電穿孔法還有助于誘發(fā)甲亢突眼，產(chǎn)生顯著的眼眶腫大、肉眼可見的眼結(jié)膜水腫、眼眶血管擴(kuò)張和堵塞[19]。故利用肌肉注射與電穿孔技術(shù)，通過表達(dá)載體重復(fù)免疫后，均可成功造模GD小鼠模型，成功率較高。目前，比較肌肉注射與電穿孔免疫的造模效果的研究較少，但有研究發(fā)現(xiàn)，通過電穿孔方法傳導(dǎo)腺病毒會(huì)導(dǎo)致小鼠在最后1次免疫的4月后死亡[20], 故仍需更多研究證明兩者的優(yōu)劣性。

2.2 改變給藥時(shí)間及免疫次數(shù)

GD小鼠免疫周期不完全一致，從2次免疫后2周到3次免疫后8周不等，但多集中在2次免疫后2周及3次免疫后4周。

研究[21]發(fā)現(xiàn)，每3周1次，共3次，末次免疫后4周造模為GD小鼠模型的最佳免疫周期，該免疫周期下，實(shí)驗(yàn)小鼠血清TRAb水平能達(dá)到最高水平, T4水平升高，并能持續(xù)8周。葉楓等[22]比較第2次免疫后2周與第3次免疫后4周的造模效果, 2組小鼠TRAb水平均明顯升高，而其中3次免疫4周造模組的成模率(75%)最高，且其甲狀腺組織改變與 T4 水平變化吻合度為100%。同樣, CHEN C R等[11]選用重組腺病毒A亞單位免疫BABL/c小鼠，分別比較2次免疫后1周(5周造模)，末次免疫后4 周(10周造模)及8周(14周造模)小鼠的TRAb及T4水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5周造模組TRAb滴度及甲亢發(fā)生率與10周造模相似，而14周造模組的抗體水平及T4升高的陽性率略低于10周造模組，表明造模時(shí)間并非越長越好。HOLTHOFF H P等[14]發(fā)現(xiàn)利用重組腺病毒每3～4周進(jìn)行一次免疫，連續(xù)免疫9次，可使模型維持時(shí)間延長至9個(gè)月，是迄今為止最長維持時(shí)間，提示造模時(shí)間及免疫次數(shù)對(duì)GD模型有重要影響。

2.3 調(diào)整動(dòng)物品系

不同小鼠品系對(duì)相同抗體會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng), SAITOH O等[23]發(fā)現(xiàn)，使用AdTSHR289抗體免疫C57BL6以及BALB/c雌性小鼠時(shí)，小鼠體內(nèi)均可產(chǎn)生TSAb抗體，但只有BALB/c小鼠會(huì)出現(xiàn)甲亢病征。與C57BL6小鼠相比, BALB/c小鼠能夠產(chǎn)生更多的TSAb, 且能產(chǎn)生甲狀腺組織的生理變化和眼眶組織的改變[24], 故BALB/c小鼠是目前研究GD造模的主要小鼠品系。此外，一種NOD. H2h4小鼠可自發(fā)產(chǎn)生免疫性甲狀腺炎，甲狀腺球蛋白抗體、以及甲狀腺過氧化物酶抗體，但不能產(chǎn)生TSHR抗體，通過將人TSHR A 亞單位轉(zhuǎn)移至NOD. H2h4小鼠后，該轉(zhuǎn)基因小鼠可自發(fā)產(chǎn)生TSAb[25-26], 為GD提供了新模型，但該小鼠模型研究較少，無法保證其可重復(fù)。通常情況下，雌性小鼠本身更容易出現(xiàn)自身免疫性疾病，但有研究[27]發(fā)現(xiàn)在相同的GD模型實(shí)驗(yàn)條件下，雄性小鼠TSH、FT4的表達(dá)水平會(huì)比雌性小鼠更高，但性別對(duì)于小鼠GD造模的具體影響尚不明確。此外，王悅等[28]通過肌肉注射重組腺病毒，將獼猴與小鼠進(jìn)行GD造模對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與獼猴相比，小鼠模型GD甲亢的誘導(dǎo)時(shí)間更短，發(fā)生率更高，同時(shí)GD獼猴基礎(chǔ)生理生化指標(biāo)和免疫相關(guān)指標(biāo)中顯示出更多與人類GD患者類似的表現(xiàn)及機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)可為日后探索GD發(fā)病機(jī)制及評(píng)估新治療方案研究提供新的造模動(dòng)物類型，可以根據(jù)2種動(dòng)物GD模型的不同特點(diǎn)選擇更合適的研究工具。

3 鑒定造模成功的指標(biāo)

檢測GD造模成功的指標(biāo)有很多種，臨床上GD主要以甲狀腺毒癥所致高代謝癥狀和體征、甲狀腺彌漫性腫大、TRAb陽性，以及T3、T4水平增高和TSH水平降低為主。若癥狀不明確，可進(jìn)一步測定放射性碘(RAIU)攝取率(增高)或進(jìn)行甲狀腺B超確診[2]。

對(duì)于GD小鼠造模病理和指標(biāo)變化可分為以下幾個(gè)方面。① 臨床癥狀: 出現(xiàn)一系列甲亢臨床表現(xiàn)如體質(zhì)量減輕等; ② 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo): 甲狀腺素水平增高或促甲狀腺素水平降低; 血清TRAb陽性，尤其是TSAb水平; ③ 形態(tài)學(xué)變化: 甲狀腺增大，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生，濾泡膠質(zhì)濃縮或乳頭狀增生等甲亢表現(xiàn)[29-30]。理想的GD小鼠模型需要同時(shí)具有生化指標(biāo)變化和甲狀腺病理變化。

4 小 結(jié)

GD的造模始終是當(dāng)前疾病研究中的難點(diǎn)。近年來，經(jīng)過多方面的探索，目前已能夠成功建立一個(gè)長期并且穩(wěn)定的GD小鼠模型。上述研究提示，經(jīng)3次應(yīng)用表達(dá)促TSHR-A亞單位腺病毒免疫BALB/c小鼠，免疫后4周造模效果最佳, TSHR抗體水平明顯增高，血清T4水平升高，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生肥大，濾泡腔中膠質(zhì)含量減少或缺失等一系GD體征出現(xiàn)，為目前較為理想小鼠GD模型。

然而，不同研究者采取的終點(diǎn)時(shí)間并不一致，同類別小鼠以及相同免疫時(shí)間中免疫周期亦不相同，從2 次免疫后2周到3次免疫后8周不等，部分實(shí)驗(yàn)免疫時(shí)間不足導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠精準(zhǔn)，缺乏可比性，故不同免疫時(shí)間及周期對(duì)于GD小鼠造模的影響并不全面，需要更多免疫時(shí)間和周期不同的GD小鼠造模實(shí)驗(yàn)以及同類型條件的對(duì)比，以提供更加合理且有效的模型。從給藥途徑來看，目前電穿孔造模成功率較高，但其操作難度較大且耗費(fèi)較高，并有小鼠死亡個(gè)例，故肌肉注射可能更為經(jīng)濟(jì)且常用。此外，更多類別人工合成質(zhì)粒DNA及重組腺病毒等造模材料有待發(fā)掘，為GD小鼠模型的構(gòu)建提供更加高效、便捷的造模條件。目前對(duì)于小鼠品系的研究較少，常用小鼠仍為BALB/c小鼠，對(duì)于其他品系如NOD. H2h4等新型鼠種以及獼猴等其他動(dòng)物種類，需進(jìn)一步研究其可行性。轉(zhuǎn)基因模型作為自發(fā)性的GD模型似乎具有更加廣闊的前景，該模型可傳代，可供深入研究母體及子代GD的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，目前現(xiàn)有GD模型各有特點(diǎn)，但仍非理想的GD模型，例如伴有Graves眼病的模型仍不穩(wěn)定，或者無法展現(xiàn)GD的多系統(tǒng)損害等表現(xiàn)。未來仍需更深入的研究以優(yōu)化GD的造模方式，提高造模效率，為加深GD的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供依據(jù)。