雄性榧樹天然居群表型多樣性及優(yōu)株初選

詹利云，劉 璉，曾燕如，喻衛(wèi)武，戴文圣

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

榧樹Torreyagrandis是紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya中國特有的植物，呈片狀分布于浙江、福建、江西、湖南、安徽等省的丘陵地帶[1]。榧樹雌雄異株，稀同株，種內變異十分豐富[2]。香榧T.grandis‘Merrillii’是雌性榧樹的一個優(yōu)良栽培類型，其結實所需花粉來自雄性榧樹天然居群。然而雄株因不結實而往往遭受隨意砍伐，數量大幅度減少[3]。近年來隨著香榧產業(yè)的發(fā)展，人們認識到充分優(yōu)質的授粉對雌株種實產量及品質影響極大，日益重視在香榧豐產造林中配置授粉雄株的作用。因此，對榧樹雄株開展調查與選優(yōu)是提高香榧產量及質量的重要因素之一。表型性狀多樣性是植物多樣性最直觀的反映，是衡量生物多樣性的重要指標，也是了解遺傳變異的重要線索[4]。在板栗Castaneamollissima[5]、櫻桃Cerasuspseudocerasus[6]、椰棗Phoenixdactylifera[7]、李Prunusdivaricata[8]、玉米Zeamays[9]等物種中都開展了表型性狀多樣性研究。榧樹雌雄異株，天然雜交，且生長地理環(huán)境存在差異，使得天然群體內榧樹變異十分豐富[10]。近年來對榧樹的研究主要集中在病害[11]、生物學特性[12]、栽培管理技術[13]、分子標記[14]等方面。由于香榧具有極高的經濟價值，研究多集中在雌性香榧上，而雄性榧樹的研究鮮見報道。董雷鳴等[15]探討榧樹雄株若干性狀的變異發(fā)現：葉片與雄球花各指標均有較大的變異系數，且不同來源的花粉對香榧幼果坐果率有顯著影響，表明榧樹雄株具有很大的選育潛力。本研究以來自5個雄性榧樹天然居群的121個單株為研究材料，對葉片、雄球花等10個表型性狀指標進行多樣性分析，并在此基礎上初選雄性榧樹優(yōu)株，為今后雄性榧樹資源保護、授粉樹配置及新品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江省與安徽省是榧樹主要的天然分布區(qū)。榧樹目前主要生產與利用的是其種子，野生雄株天然居群除采種外受到的人為干擾較少。本研究在基本呈野生狀態(tài)的雄性榧樹天然居群開展，分布點分別為浙江省淳安縣半夏村(淳安)、杭州市臨安區(qū)洪嶺村(臨安)、杭州市富陽區(qū)洞橋村(富陽)、浙江嵊州市榆樹村(嵊州)及安徽省黃山市呈坎村(黃山)開展。在分布點的雄性榧樹林中各選取10～30株生長旺盛，彼此間距不小于50 m，無病蟲害，樹齡50～200 a的實生雄性榧樹作為研究對象，用于試驗觀測與采樣，同時利用全球衛(wèi)星定位系統(tǒng)(GPS)定位采樣點(表1)。各單株采集新鮮葉片即時裝入加硅膠的自封袋中，帶回實驗室置于?80 ℃冰箱保存。各單株采集20個帶雄球花的1年生幼枝，枝條底部用濕紙巾包裹后置于采樣袋，帶回實驗室進行水培。

表 1 5 個雄性榧樹天然居群的地理位置及采樣數 Table 1 Geographic locations of five natural populations in T.grandis

1.2 方法

1.2.1 葉片性狀測定 各單株選取20個葉片，用游標卡尺測量(精確至0.01 mm)葉寬和葉長，并計算葉形指數(葉寬/葉長)；用托盤天平(PB1502-L，瑞士)稱取葉質量。

1.2.2 雄球花表型性狀測定 各單株隨機選取30個雄球花，用游標卡尺測量雄球花橫徑、縱徑，并計算花形指數(球花橫徑/縱徑)，同時用托盤天平稱取雄球花質量。

1.2.3 雄球花水培及散粉時間觀察 各單株選取3個雄球花數量較多且長勢良好的枝條插入水中，置于浙江農林大學校園，培養(yǎng)條件設置為溫度20 ℃，濕度75%，光強400 μmol·m?2·s?1，二氧化碳摩爾分數520 μmol·mol?1，2 d更換1次水，每天定期觀察并記錄花枝散粉情況。當雄球花的小孢子葉松散，顏色變黃，花粉囊縱裂，部分花苞散出黃色花粉時記為始花期，直至完全散粉。大約3 d時間。

1.2.4 花粉得率測定 每個單株各選30個即將散粉(即各小孢子葉松散，花苞顏色變黃，花粉囊開始縱裂)的雄球花，置干燥玻璃培養(yǎng)皿中，放置在室內干燥桌面上，使雄球花自然散粉。待雄球花完全開放，抖落所有花粉，收集花粉稱量，計算花粉得率。花粉得率=[花粉質量/(花粉質量+撒粉后球花質量)]×100%。

1.2.5 花粉生活力測定 在全程避光的條件下，用熒光染料反應法(fluorescein diaectate reaction，二乙酸熒光素染色)測定花粉生活力[16]。隨機觀測3個不同視野，統(tǒng)計有活力花粉(呈綠色)數量和花粉總數(綠色和黑色)?；ǚ凵盍?(有活力花粉數量/花粉總數)×100%。

1.3 數據處理

運用Excel和SPSS 17.0對各指標進行數據統(tǒng)計和方差分析、t檢驗及相關性分析等。

2 結果與分析

2.1 雄性榧樹葉片與雄球花表型性狀的差異顯著性分析

方差分析表明：葉片性狀的葉長在居群間有顯著差異(P＜0.05)，雄球花性狀的花粉得率在居群間呈極顯著性差異(P＜0.01)，其他指標均無顯著差異(表2)。t檢驗分析結果顯示：在居群內單株間10個表型性狀均差異極顯著(P＜0.01)，表明雄性榧樹表型性狀的變異可能主要來源于居群內。

表 2 雄性榧樹5個居群葉片與雄球花相關指標的方差分析Table 2 ANOVA in leaf-and male flower-associated parameters among five natural populations in T.grandis

多重比較分析發(fā)現：葉長在5個居群間差異顯著(P＜0.05)，5個居群中淳安居群的葉片平均最長(18.99 mm)，顯著長于其他居群；嵊州與黃山居群的葉片最短，且2個居群間無顯著差異；臨安與富陽居群的葉片長度居中，2個居群間無顯著差異(圖1A)。花粉得率在5個居群間差異極顯著(P＜0.01)，嵊州和富陽居群的花粉得率較高，顯著高于其他居群，且2個居群間無顯著差異；而淳安與臨安居群花粉得率最低且無顯著差異(圖1B)。

圖 1 雄性榧樹5個居群葉長(A)和花粉得率(B)的變化Figure 1 Varieties among five natural populations in the leaf length(A) and pollen yield(B) in T.grandis

變異系數與性狀的離散程度呈正相關，變異系數越大表明個體間的差異越大，多樣性越豐富，選擇的潛力就越大[17]。本研究表明：同一性狀在不同居群中變異系數不同；同一居群中不同性狀的變異系數也存在差異。5個雄性榧樹居群間葉片的變異程度由大到小依次為葉質量、葉長、葉形指數、葉寬；雄球花的變異程度由大到小依次為花粉生活力、花粉得率、球花質量、球花縱徑、球花橫徑、花形指數?；ǚ凵盍Φ淖儺愖顬樨S富，5個居群的花粉生活力為51.70%～58.51%，變異系數為39.04%～45.40%，平均值為42.36%；其次是花粉得率(31.03%～37.77%)，平均達34.13%；葉寬和球花橫徑變異系數較小，分別為10.82%和12.13%(表3)。

表 3 5個雄性榧樹居群葉片與雄球花指標的極值與變異Table 3 Extreme values and variation in the parameters of leaves and male flowers of five natural populations in T.grandis

居群差異體現了居群對當地環(huán)境的不同適應狀況，數值大小反映了不同居群對不同環(huán)境的適應性[18]。基于葉片的表型指標分析發(fā)現：5個天然居群的變異系數臨安(16.27%)最大，其次是嵊州(14.73%)，淳安(10.74%)最??；而雄球花是嵊州(26.82%)和黃山(26.42%)的變異系數較高，淳安(19.49%)最小。本研究中榧樹雄株的生殖器官花的變異系數大于營養(yǎng)器官葉。

2.2 雄球花散粉時間的變異

榧樹雄株的散粉時間不僅與遺傳有關[15]，也與地域氣候、環(huán)境差異有關。榧樹的雌雄花期不集中，且雄株花期比雌株早[19]，散粉時間一般在4月中旬[20]。因此在新造林中要配置適當花期的雄性授粉樹，滿足雌花充分受粉的要求[15]。

經溫室水培雄球花枝觀測統(tǒng)計，雄球花散粉時間在4月7?17日，散粉周期約10 d。中花型所占比例最大(47株)，占總樣本數的38.84%，散粉時間在4月11?15日；晚花型比例最小(30株，24.79%)，散粉時間在4月15?17日(表4)。5個居群中，淳安、臨安、黃山這3個居群的中花型偏多，分別有11、13、13株，而富陽和嵊州的早花型略多，花期為4月7?11日(表4)。

表 4 5 個天然居群榧樹雄株散粉期比較Table 4 Pollen availability of male flowers in T.grandis

2.3 雄性榧樹葉片表型性狀間的相關性分析

葉質量、葉長與葉形指數均呈極顯著負相關(P＜0.05)，而其他指標間均為顯著正相關(P＜0.05)(表5)。這與董雷鳴等[15]的研究結果一致。

球花質量與球花大小及花粉得率呈顯著正相關(P＜0.05)，球花大小與花粉得率均顯著正相關(P＜0.05)，花粉活力與花粉得率呈極顯著正相關(P＜0.01)，而球花質量和球花縱徑都與花形指數呈極顯著負相關，其他指標間相關性不顯著 (表 6)。

表 5 雄性榧樹葉片各指標之間的相關系數Table 5 Correlation coefficients among indexes of leaves in male T.grandis

表 6 榧樹雄球花及各指標間的相關系數Table 6 Correlation coefficients among indexes of male flowers in T.grandis

2.4 雄性榧樹優(yōu)株的初選

花粉會對植株坐果率高低、果實大小以及產量等產生直接影響[21?22]。篩選適宜的雄性優(yōu)株可以提供香榧基地授粉雄株不足、香榧樹體坐果率低的現狀，從而促進香榧產業(yè)健康發(fā)展。營養(yǎng)器官葉片受環(huán)境影響較大，因而榧樹可基于生殖器官的性狀初選核心種質[23]。本研究主要依據榧樹雄株散粉時間、花粉生活力、花粉量的多少等綜合進行雄株優(yōu)株的篩選。早花類型中表現較好的優(yōu)株有富陽居群的雄9、嵊州居群的雄5以及黃山居群的雄23，花粉生活力分別高達92.55%、92.08%、90.01%，花粉得率也在20%以上；中花類型表現最佳的優(yōu)株有臨安居群的雄22、嵊州居群的雄1，花粉活力均在90%以上，花粉得率也不低；而晚花類型中，淳安居群的雄3、臨安居群的雄18以及黃山居群的雄1花粉生活力分別為92.71%、92.61%、91.65%，共初選36個單株作為優(yōu)良授粉樹，占所有供試材料的29.75%(表7)。

表 7 雄性榧樹優(yōu)株的初選Table 7 Screening of male elite trees in T.grandis

3 結論與討論

本研究發(fā)現：在居群間，葉片與雄球花的10個表型指標，只有葉長和花粉得率差異顯著，而居群內，單株間10個指標均差異極顯著，表明居群內的變異比居群間更加豐富。該結果與劉浩凱等[24]研究雌性榧樹居群遺傳多樣性的結果基本一致。因此，為配置香榧授粉樹的榧樹雄株選育可選擇優(yōu)良單株。

變異系數是衡量各觀測性狀變異程度的一個統(tǒng)計指標。本研究各指標的相對極差和變異系數的變化趨勢完全不同，表明榧樹雄株表型性狀存在豐富的表型多樣性。經過長期的自然選擇，不同數量性狀對環(huán)境形成了不同的適應能力。相關分析表明：雄性榧樹的大部分表型性狀相關性達顯著或極顯著水平，說明這些性狀在環(huán)境適應中表現出相互調節(jié)的作用。

雄性榧株以提供花粉為主要利用目的，花粉得率和花粉生活力在居群間和個體間變異大，且比較穩(wěn)定，不僅有利于選擇，選擇結果也相對可靠。本研究顯示：雄球花各指標變異系數大，球花大小與花粉得率呈顯著正相關，直接影響花粉得率。因此優(yōu)株初選應從花粉生活力、花粉得率及球花大小等綜合考慮。基于上述指標初步篩選出36個優(yōu)良雄性單株，其中8個單株的花粉生活力在90%以上。在今后的育種工作中，這些雄性優(yōu)株應是優(yōu)先考慮的對象。本研究所有單株的花粉得率最高值為38.23%，與董雷鳴等[15]的研究結果類似。

居群內的變異主要受遺傳因素的影響，而居群間的變異則與遺傳和環(huán)境2個因素相關[25]。由于榧樹雄株不結果，以往人為破壞嚴重，部分地區(qū)的雄株資源已瀕臨絕跡，雌雄比例嚴重失調。易官美等[26]對榧樹資源分布進行調查發(fā)現：雌雄株比例在江西巖泉自然保護區(qū)為4∶1，在福建建甌玉山鎮(zhèn)居群為29∶1；在安徽居群為19∶1；在浙江諸暨趙家鎮(zhèn)居群為99∶1。因此，加強雄性榧樹資源保護刻不容緩，需加大種質資源調查與收集力度，建立雄性榧樹優(yōu)株資源庫。

本研究僅對雄性榧樹的表型多樣性進行初步研究，后續(xù)的研究將擴大居群選擇的范圍及居群個數，并結合分子生物學從DNA水平深入揭示雄性榧樹天然居群的遺傳變異特點和規(guī)律。