李黎, 張文琪, 李強, 孫瑤

濰坊市益都中心醫(yī)院放療科(山東濰坊 262500)

肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近些年肺腺癌發(fā)生比例增加。目前靶向藥物如EGFR-TKI的應用提高肺癌患者生存，但預后仍較差[1]。目前常用的腫瘤標記物在預測預后方面敏感度和特異度較差。因此，探索新的檢測及預后因子對于提高肺癌患者生存有著重要的意義[2]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)最初研究是介導細胞適應缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，最近研究證實即使在常氧條件下，HIF-1α在腫瘤細胞中也過表達。HIF-1α與腫瘤進展、血管生成、細胞遷移和預后不良密切相關(guān)[3-4]。HIF-1α可能是腫瘤治療的一個新靶點。LASP1(LIM and SH3 protein 1)是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，LASP-1蛋白定位于人染色體17q21。有研究報道LASP-1過表達可誘導多種腫瘤細胞的增殖和遷移[5-6]。體內(nèi)外實驗證實HIF-1α通過直接結(jié)合LASP1啟動子中的缺氧反應元件進而導致腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[7]。然而在肺癌中LASP1和HIF-1α研究較少。本研究回顧分析LASP1和HIF-1α在肺癌中表達及其與臨床病理因素之間相關(guān)性，探討LASP1和HIF-1α在肺癌中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究納入標準為：(1)2002年10月至2012年10月于我院診斷為Ⅰ～ⅢA期行手術(shù)治療確診的有完整病理的肺腺癌患者；(2)所有患者都行表皮生長因子受體(EGFR)基因檢測；(3)術(shù)前檢查無遠處轉(zhuǎn)移；(4)圍手術(shù)期內(nèi)未死亡的患者。

病例剔除標準： (1)未行根治性手術(shù)患者； (2)無完整隨訪資料。根據(jù)納入排除標準本組共77例肺癌患者納入本研究。其中男50例，女27例；年齡≤60歲 43例，>60歲34例；吸煙患者34例，不吸煙患者43例；EGFR基因突變患者25例；未突變患者52例。

1.2 qRT-PCR(定量PCR) 肺癌細胞株(A427, A549, H1299)和正常肺細胞株(MRC-5)均購于中國科學院。將其培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素，37℃孵育在5%的CO2中。qRT-PCR具體步驟如下：試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)從細胞系提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將1 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄為20 μL cDNA。引物見表1，反應系統(tǒng)中，95℃反應30 s，55℃反應30s，72℃，持續(xù)30 s。32個周期，實驗重復3次，最后計算2-ΔΔCT值。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.3 Western blot 將細胞在RIPA裂解緩沖液中均勻化30 min，在4℃下離心(12 000 r/min)，將裂解液清除15 min，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白提取物，電轉(zhuǎn)移至PVDF。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合位點60 min后，在4℃下與兔抗 HIF-1α (1∶1 000)和兔抗LASP-1(1∶1 000)多克隆抗體孵育隔夜。用PBS-T洗滌膜3 min，用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)抗兔免疫球蛋白抗體(SP-9001，1∶2 000；中山生物技術(shù))在室溫下檢測60 min。然后用PBS-T對膜進行3次洗滌10 min，用增強化學發(fā)光系統(tǒng)觀察免疫復合物。

1.4 免疫組化檢測及評價 標本被切割，脫蠟，用二甲苯和分級醇再水合?？乖厥赵? mmol/L檸檬酸緩沖液中進行。用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，用山羊血清阻斷切片，在4℃下與HIF-1α抗體(1∶100)或LASP-1抗體(1∶100)孵育一夜，PBS沖洗，37℃下與二抗孵育20 min，然后洗滌。PBS沖洗3次。以二氨基聯(lián)苯胺為顯色底物。最后，用血木素對切片進行反染色。染色強度分為0(陰性)、1(低)、2(中)和3(高)。染色范圍分為0(0%染色)、1(1%～25%染色)、2(26%～50%染色)和3(51%～100%染色)。最終評分通過將強度評分與染色程度相乘來確定，范圍0～9。根據(jù)結(jié)果將免疫反應分為陰性表達(0～3分)和陽性表達(>3分)[8]。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，t檢驗分析兩組之間的差異。2檢驗進行相關(guān)性分析，預后生存分析采用Kaplan-Meier進行單因素分析，log-rank比較組間差異。Cox多因素分析確定預后獨立因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LASP1和HIF-1α mRNA和蛋白表達情況 qRT-PCR檢測LASP1和HIF-1α mRNA表達情況，結(jié)果顯示 LASP1和 HIF-1α mRNA在肺細胞株MRC-5(0.43±0.10；0.39±0.09)中的表達明顯低于在肺癌細胞株A427(0.73±0.14；0.69±0.12)、A549(0.87±0.25；0.75±0.22)和 H1299(0.79±0.19；0.65±0.14)中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測LASP1和HIF-1α蛋白表達情況，結(jié)果顯示 LASP1和 HIF-1α 蛋白在肺細胞株MRC-5(0.74±0.22；0.67±0.17)表達明顯低于肺癌細胞株A427(1.34±0.24；1.43±0.21)、A549(1.42±0.21；1.29±0.24)和 H1299(1.51±0.22；1.21±0.22)在中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 Western blot檢測LASP1和HIF-1α蛋白表達相對值

2.2 LASP1和HIF-1α表達與臨床因素之間相關(guān)性 免疫組化結(jié)果顯示LASP1和HIF-1α表達在細胞胞質(zhì)中(圖2)。按判定標準，49例患者為LASP1陽性表達組，其余28例患者為LASP1陰性表達組；41例患者納入HIF-1α陽性表達組，其余36例患者納入HIF-1α陰性表達組。肺癌石蠟組織中LASP1表達和HIF-1α表達呈正相關(guān)(r=0.273，P=0.025)。

將LASP1表達和HIF-1α表達與臨床因素間進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示LASP1表達與N分期(P=0.033)密切相關(guān)，而HIF-1α表達與LASP1表達與T分期(P=0.027)和N分期(P=0.015)密切相關(guān)(表2)。

注：A：肺腺癌組織中LASP1陽性表達；B：肺腺癌組織中LASP1陰性表達；C：肺腺癌組織中HIF-1α陽性表達；D：肺腺癌組織中HIF-1α陰性表達

表2 LASP1表達和HIF-1α表達與臨床病理因素之間相關(guān)性分析 例

2.3 預后生存分析 預后單因素分析顯示T分期(P=0.026)，N分期(P<0.001)，LASP1表達和(P=0.019)和HIF-1α表達(P=0.001)與本組預后相關(guān)，而性別、年齡、吸煙狀態(tài)、腫瘤部位和EGFR狀態(tài)與本組肺癌患者預后無關(guān)(P>0.05)。Cox預后多因素分析N分期(HR=1.563，P<0.001)、LASP1表達(HR=0.494，P=0.032)和HIF-1α表達(HR=0.451，P=0.010)為本組患者預后獨立因素(表3)。進一步分析發(fā)現(xiàn)LASP1陽性表達患者和HIF-1α表達陽性患者預后較LASP1陰性表達患者和HIF-1α表達陰性患者預后差(圖3)。

3 討論

Semenza于1992 年在缺氧誘導的細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的HIF-1。HIF-1是HIF-1α和 HIF-1β 構(gòu)成的異二聚體， HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基[9-10]。人類實體腫瘤中常存在缺氧環(huán)境，目前 HIF-1α已在多種惡性腫瘤中檢測到過度表達。腫瘤發(fā)生早期即可發(fā)生HIF-1α的過度表達，有研究報道HIF-1α參與腫瘤生長、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。低氧環(huán)境下多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達發(fā)生變化，對缺氧作出應激反應，這些基因被稱為缺氧反應基因。缺氧反應基因常為HIF-1α下游基因，其表達受HIF-1α基因調(diào)控。有研究證實LASP1就是HIF-1α的一個下游靶基因，受HIF-1α基因直接調(diào)控[7]。LASP1為肌動蛋白結(jié)合蛋白，主要分布于細胞的黏著斑和偽足等結(jié)構(gòu)附近，可影響偽足的延伸，因此被認為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白[12]。LASP1在肝癌、食管癌和膀胱癌等實體腫瘤中異常高表達，并對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起促進作用。其他研究發(fā)現(xiàn)LASP1的表達與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可通過EMT通路影響細胞的侵襲和遷移能力[13]。有報道LASP1可通過LASP1/PTEN/AKT在鼻咽癌的進展中起重要作用，LASP1可能作為鼻咽癌的治療潛在靶點[14]。然而肺癌中LASP1和HIF-1α相關(guān)性研究較少。

注：A：根據(jù)不同HIF-1α表達情況肺癌患者預后生存曲線；B：根據(jù)不同LASP1表達情況肺癌患者預后生存曲線

表3 本組肺癌患者預后生存分析

本研究首先檢測了細胞株中mRNA和蛋白的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)肺癌細胞株中LASP1和HIF-1α mRNA和蛋白表達水平均明顯高于正常肺細胞株，HIF-1α表達與T分期、N分期有關(guān)，LASP1表達與N分期(P=0.033)密切相關(guān)，分期越晚，HIF-1α和LASP1陽性表達越高。我們推測HIF-1α和LASP1與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)HIF-1α和LASP1表達在肺癌中的表達呈正相關(guān)，結(jié)合之前研究我們推測在肺癌中HIF-1α異常高表達，HIF-1α進一步刺激LASP1基因過表達，進而導致下游基因激活，進而導致肺癌進展。為了評估HIF-1α表達和LASP1表達在肺癌中的預后價值，我們采用預后生存分析。結(jié)果表明N分期、HIF-1α表達和LASP1表達是肺癌患者獨立的預后指標。此外，我們證明LASP1陽性表達患者和HIF-1α表達陽性患者預后較LASP1陰性表達患者和HIF-1α表達陰性患者預后差。這些結(jié)果提示，HIF-1α和LASP1過表達的肺癌患者可能是預后不良的高危人群，可能需要更積極的治療。

本研究發(fā)現(xiàn)LASP1和HIF-1α在肺腺癌中高表達，HIF-1α和LASP1可能與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，LASP1和HIF-1α可作為肺腺癌患者預后預測指標。