劉德慧, 嚴(yán)玉蘭

(1. 江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江, 212013; 2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 江蘇 鎮(zhèn)江, 212002)

肺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中85%為非小細(xì)胞肺癌[1]。中國(guó)的肺癌發(fā)病率和增長(zhǎng)率始終居高不下，且肺癌患者的5年生存期相對(duì)較低，主要原因是缺乏早期篩查以及在治療過(guò)程中出現(xiàn)進(jìn)展、耐藥和復(fù)發(fā)[2-3]。目前，急需一種高效且準(zhǔn)確的方法對(duì)肺癌患者進(jìn)行診斷及預(yù)后評(píng)估。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA, 這種閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使circRNA 具有高度的穩(wěn)定性及保守性、普遍性、組織和疾病特異性等，這提示circRNA具有作為癌癥診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物的潛力。本文從肺癌組織與體液2個(gè)方面，對(duì)circRNA在肺癌診斷及預(yù)后評(píng)估中的作用與價(jià)值進(jìn)行綜述與分析，并對(duì)當(dāng)前臨床研究中存在的問(wèn)題進(jìn)行討論。

1 circRNA的概述

SANGER H L等[4]通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA, 但當(dāng)時(shí)普遍認(rèn)為這種circRNA是pre-mRNA剪接過(guò)程中的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。其后，隨著高通量測(cè)序和生物信息分析技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)研究[5]證實(shí)真核細(xì)胞包含成千上萬(wàn)個(gè)不同的circRNA, 可以穩(wěn)定存在于組織、細(xì)胞及體液中，如血液、唾液、外泌體等，且circRNA的拷貝數(shù)可能是其相關(guān)線(xiàn)性RNA的10倍，表明circRNA 具有潛在的生物學(xué)功能。circRNA可以通過(guò)多種途徑參與調(diào)控基因，包括小RNA(miRNA)的海綿作用[6]、與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)的相互作用[7]、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄/剪接過(guò)程及翻譯蛋白質(zhì)[8-10]等。

2 肺癌組織中異常表達(dá)的circRNA

人類(lèi)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)100 000個(gè)不同的circRNA，而某些circRNA在肺癌組織中富集且異常表達(dá)[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)水平上調(diào)的circRNA發(fā)揮著類(lèi)似原癌基因的作用，可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖、遷移以及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程，即腫瘤促進(jìn)circRNA(hsa_circ_0075930、circRNA_102231、hsa_circ_0014130、hsa_circ_0011385、hsa_circ_0013958、circ_0067934、hsa_circ_0001715等); 與之相反，在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)水平下調(diào)的circRNA發(fā)揮著類(lèi)似抑癌基因的作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]、遷移并促進(jìn)凋亡[14-15], 即腫瘤抑制circRNA(circRNA_FOXO3、hsa_circ_0001073、hsa_circ_0077837等)。下文將從診斷準(zhǔn)確性、臨床特征、預(yù)后評(píng)估等方面對(duì)2類(lèi)circRNA作為生物診斷標(biāo)志物的可能性進(jìn)行綜述。

2.1 circRNA的診斷價(jià)值

通過(guò)繪制受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)對(duì)腫瘤促進(jìn)circRNA的診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)腫瘤促進(jìn)circRNA具有良好的診斷價(jià)值。如hsa_circ_0075930的曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.756(95%置信區(qū)間: 0.649～0.864;P<0.01)，靈敏度為76.2%、特異度為72.1%[16]。circRNA_102231的AUC為0.897, 靈敏度及特異度分別為81.2%、88.7%[17]。hsa_circ_0014130的AUC為0.878, 靈敏度與特異度分別為87.0%和84.8%[18]。至于腫瘤抑制circRNA, ZHANG Y N等[19]證實(shí)circRNA_FOXO3在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中下調(diào)，繪制ROC曲線(xiàn)后發(fā)現(xiàn)其AUC為0.782(95%置信區(qū)間: 0.682～0.862), 靈敏度為80.0%、特異度為73.3%。hsa_circ_0077837在肺腺癌及鱗癌中表達(dá)水平均下調(diào)，其AUC為0.921 (95%置信區(qū)間: 0.868～0.975)[17]。由此可見(jiàn)，在肺癌組織中，無(wú)論是腫瘤促進(jìn)circRNA還是腫瘤抑制circRNA，二者均體現(xiàn)出良好的診斷價(jià)值，具有成為肺癌診斷生物標(biāo)志物的潛力。

2.2 circRNA與臨床特征

對(duì)于腫瘤促進(jìn)circRNA，以其在組織中表達(dá)量的中位數(shù)為節(jié)點(diǎn)，將患者分為相對(duì)高表達(dá)組與低表達(dá)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平的hsa_circ_0075930與腫瘤的大小(P=0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.038)有關(guān)[16]; hsa_circ_0014130的高表達(dá)與TNM分期(P=0.001) 及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)有關(guān)[18]; circRNA_102231的表達(dá)水平與晚期TNM分期(P=0.024)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)有關(guān)[17]; circRNA_100876的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性(P=0.001)及腫瘤分期(P=0.001)有關(guān)[20]。由此表明腫瘤促進(jìn)circRNA 的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期存在著一定的聯(lián)系。另一方面，對(duì)于腫瘤抑制circRNA而言，在非小細(xì)胞肺癌組織中下調(diào)的circ_0001649, 當(dāng)其表達(dá)水平較低時(shí)，預(yù)示著可能存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)及患者當(dāng)前處于腫瘤晚期(P=0.010)。不管是腫瘤促進(jìn)circRNA還是腫瘤抑制circRNA, 其表達(dá)水平與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期存在一定關(guān)聯(lián)，這也意味著目的circRNA具有成為一種指導(dǎo)腫瘤分期以及提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物的潛力。

2.3 circRNA與腫瘤分型

WANG C D等[21]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001073僅在腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，而hsa_circ_0001495僅在鱗癌組織中上調(diào)，分別繪制ROC曲線(xiàn)后發(fā)現(xiàn), hsa_circ_0001073對(duì)腺癌診斷的AUC為0.919, hsa_circ_0001495對(duì)鱗癌診斷的AUC為0.965, 這意味著hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495能作為非小細(xì)胞肺癌分型的生物標(biāo)志物, 具有鑒別鱗癌與腺癌的潛力。

2.4 circRNA與腫瘤預(yù)后

對(duì)于腫瘤促進(jìn)circRNA而言, ZOU Q G 等[22]通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)和log-rank 檢驗(yàn)對(duì)總體生存時(shí)間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)組織中circ_0067934高表達(dá)的患者與低表達(dá)組相比通常預(yù)后不佳。同時(shí)運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素生存分析發(fā)現(xiàn), circ_0067934可作為影響非小細(xì)胞肺癌患者總體生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外, ZONG L等[17]研究發(fā)現(xiàn)circRNA_102231高表達(dá)患者的預(yù)后(中位生存期為26個(gè)月)比低表達(dá)者(中位生存期為43個(gè)月)更差。此外，有學(xué)者[23]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_103809在順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著上調(diào)，具有評(píng)估肺癌患者治療效果的生物標(biāo)志物的潛力[24]。相關(guān)研究[25-26]證實(shí)hsa_circ_003099在肺癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，生存分析研究顯示其表達(dá)水平愈高預(yù)示著更長(zhǎng)的生存時(shí)間，且與紫杉醇的耐藥有關(guān)。

3 外周血游異常表達(dá)的游離circRNA

外周血細(xì)胞外游離的circRNA即不同組織細(xì)胞分泌進(jìn)循環(huán)血液中的circRNA。circRNA得益于獨(dú)特的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)、對(duì)RNA水解酶不敏感、外泌體囊泡的保護(hù)作用等因素，可穩(wěn)定存在于體液中，如血漿，血清，唾液，外泌體等[27], 故液體活檢檢測(cè)circRNA可能成為無(wú)創(chuàng)診斷腫瘤生物標(biāo)志物[28]。作者現(xiàn)分別對(duì)血漿/血清中的circRNA及外泌體中的circRNA對(duì)肺癌的診斷及預(yù)后價(jià)值進(jìn)行分析。

3.1 血清/血漿中的circRNA

液體活檢因其無(wú)創(chuàng)性、可重復(fù)性在臨床應(yīng)用中越來(lái)越廣泛，但目前肺癌分子水平檢測(cè)主要是血清腫瘤標(biāo)志物、肺癌自身抗體等，在臨床實(shí)踐中的表現(xiàn)均不甚理想，臨床上仍以病理活檢為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。circRNA的出現(xiàn)為液體活檢在腫瘤診斷及療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用提供了新方向。

3.1.1 circRNA與腫瘤診斷及臨床特征: 研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿中的hsa_circ_0001715的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001), 其AUC為0.871(95%置信區(qū)間: 0.807～0.936), 其中靈敏度、特異度及準(zhǔn)確性分別為87.72%、71.67%及79.49%, 顯示出較好的診斷價(jià)值; 其可作為一種獨(dú)立的預(yù)后評(píng)估因素，血漿中hsa_circ_0001715的表達(dá)水平越高表明生存時(shí)間越短[29]。研究[30]發(fā)現(xiàn)circPVT1在肺癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，其AUC為0.794, 靈敏度為71.1%、特異度為80.0%, 提示血清中的circPVT1具有作為診斷非小細(xì)胞肺癌的生物標(biāo)志物的潛力。在臨床特征方面, LUO Y H等[31]發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血漿中hsa_circ_0000190表達(dá)量與腫瘤體積(P<0.000 1)、惡性程度(P=0.002 8)、TNM分期晚期(P< 0.000 1)以及遠(yuǎn)處(P=0.003 9)及胸外轉(zhuǎn)移(P=0.000 4)呈正相關(guān)，其表達(dá)水平上調(diào)可能預(yù)示著生存時(shí)間更短(P=0.047)。由此可見(jiàn)，血漿/血清中的circRNA在肺癌的診斷、臨床分期方面有著重要的價(jià)值。

3.1.2 circRNA與療效評(píng)價(jià): TAN S Y等[28]發(fā)現(xiàn)F-circEA僅在EML4-ALK融合基因患者的血漿中表達(dá)，推測(cè)其可作為非小細(xì)胞肺癌液體活檢的生物標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)，血漿中hsa_ circ_0086414的表達(dá)水平與EGFR突變有關(guān)(P=0.001), 具有指導(dǎo)治療與監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的作用; hsa_circ_0000190的表達(dá)水平與腫瘤中程序性死亡受體(PD-L1)有關(guān)(P< 0.000 1)[31]，具有評(píng)估治療效果的作用。此外，在免疫治療患者的長(zhǎng)期隨訪(fǎng)[32]中發(fā)現(xiàn)，血漿中hsa_circ_0000190高表達(dá)患者全身治療及免疫治療效果更差(P=0.000 2, 0.005 8)。血漿中hsa_circ_0005962的表達(dá)水平在治療前后有顯著差異。血漿或血清中的目的circRNA可作為評(píng)估疾病進(jìn)展及療效的一種無(wú)創(chuàng)性監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

3.2 外泌體circRNA

外泌體為一種自然生物運(yùn)載納米粒子，其囊泡可以攜帶蛋白質(zhì)、核酸如mRNA、微小核糖核酸(miRNA)、circRNA等[33]。表明血漿或者血清來(lái)源外泌體中的circRNA可作為一種高效且非創(chuàng)傷的診斷癌癥及評(píng)價(jià)預(yù)后的生物標(biāo)志物[34]。

3.2.1 circRNA與鑒別診斷及臨床特征: 研究[35]通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者及正常對(duì)照組外泌體中circRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)3種circRNA的表達(dá)具有顯著差異(circ_0047921、circ_0056285、circ_0007761)。其中circ_0047921可有效鑒別慢性阻塞性肺疾病及非小細(xì)胞肺癌(AUC=0.890, 95%置信區(qū)間: 0.831～0.902)。而circ_0056285與circ_0007761可有效聯(lián)合鑒別出非小細(xì)胞肺癌與結(jié)核病(AUC=0.820, 95%置信區(qū)間: 0.739～0.902), 且circ_0056285的表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。血漿外泌體中hsa_circ_0056616的表達(dá)水平上調(diào)對(duì)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者具有一定診斷意義，其AUC為0.812(95%置信區(qū)間: 0.720～0.903), 靈敏度及特異度分別為0.792、0.810[36-37], 這使其可作為一種評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子。WANG J等[38]發(fā)現(xiàn)在血清來(lái)源外泌體circRNA_002178中，通過(guò)外泌體與CD8+T淋巴細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)PD-L1/PD-1在肺腺癌中的表達(dá)，并且其對(duì)肺腺癌的診斷具有一定價(jià)值(AUC=0.995 6,P<0.001)。

3.2.2 circRNA的療效評(píng)價(jià): 三代EGFR-TKI藥物奧希替尼(泰瑞沙)為EGFR突變的晚期非小細(xì)胞肺癌治療的一線(xiàn)用藥，但在臨床應(yīng)用中部分患者表現(xiàn)出不敏感甚或出現(xiàn)耐藥，MA J等[39]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0002130在抵抗的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)耗竭h(yuǎn)sa_circ_0002130 能夠抑制奧希替尼的抵抗作用，并依此推測(cè)在血清來(lái)源外泌體中表達(dá)水平同樣上調(diào)的hsa_circ_0002130可作為一種評(píng)估奧希替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療效果的生物標(biāo)志物。血清外泌體來(lái)源的circRNA可作為一種評(píng)估肺癌治療效果的生物標(biāo)志物。

4 存在的問(wèn)題

將circRNA作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌診斷，仍具有以下問(wèn)題。盡管circRNA以其高度器官組織特異性得以成為一種極具潛力的生物標(biāo)志物，但當(dāng)前的研究亦不能證明候選circRNA的敏感性?xún)?yōu)于已知的腫瘤經(jīng)典血清生物標(biāo)志物，如CEA、NSE等。與組織活檢相比，液體活檢具有無(wú)創(chuàng)性和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，然而circRNA在體液中的含量較低，外周血和外泌體的研究臨床數(shù)據(jù)有限，且多數(shù)circRNA還沒(méi)有在大樣本中顯示出優(yōu)秀的預(yù)后或診斷意義，雖然大多數(shù)circRNA在組織及血液中的表達(dá)水平具有一致性[40], 但一些circRNA在組織與全血中的表達(dá)可能存在差異，甚至存在相背的情況[41, 29], 因此在研究時(shí)需要對(duì)組織及血液中circRNA的表達(dá)水平進(jìn)行綜合評(píng)估?，F(xiàn)今對(duì)circRNA診斷及預(yù)后的研究主要是通過(guò)meta分析等進(jìn)行評(píng)價(jià)，這使結(jié)果存在一定的局限性，比如受限于研究樣本，沒(méi)有根據(jù)不同的circRNA進(jìn)行亞組分析等。

5 展望

circRNA因其高度的穩(wěn)定性、保守性、普遍性、組織和疾病特異性，有望成為一種新的腫瘤生物標(biāo)志物。通過(guò)對(duì)肺癌患者腫瘤組織中及循環(huán)中游離的circRNA進(jìn)行綜述，提示circRNA在診斷準(zhǔn)確性、臨床分期、鑒別診斷、預(yù)后及治療反應(yīng)評(píng)價(jià)等方面有重要意義與價(jià)值。在候選circRNA中尋找具有高度特異性及敏感性的肺癌生物標(biāo)志物，通過(guò)將其與其他生物標(biāo)志物或影像學(xué)檢查相結(jié)合，或許可以提高診斷準(zhǔn)確性和特異性，可減少有創(chuàng)操作，同時(shí)有助于解決現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物的低器官特異性等問(wèn)題。當(dāng)前研究證實(shí)circRNA不僅對(duì)臨床工作中肺癌的診斷及預(yù)后評(píng)估有一定的幫助，對(duì)于降低肺癌的死亡率及生抗腫瘤藥物的研發(fā)也具有深遠(yuǎn)意義。此外，還需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證目的circRNA作為生物標(biāo)志物在臨床實(shí)踐中的有效性，以及在肺癌的生理過(guò)程中發(fā)揮的作用與機(jī)制。相信在不久的將來(lái) circRNA 會(huì)在肺癌的診斷和預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。