翁曉濱，王躍嗣

濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺264003

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元和（或）其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化并出現(xiàn)功能障礙，從而表現(xiàn)出一系列與神經(jīng)退行相關(guān)的臨床癥狀。神經(jīng)退行性疾病是人口老齡化進程中必然出現(xiàn)的一類疾病，在其疾病過程中所伴隨的病理變化是不可逆的，當(dāng)前的治療方法仍停留在通過藥物控制其病情進展階段。近年來，細胞替代療法治療神經(jīng)退行性疾病展現(xiàn)出了巨大潛力。細胞替代療法是指用功能正常的細胞替代體內(nèi)的病變、損傷細胞，從而實現(xiàn)功能修復(fù)的治療方法，其實質(zhì)是直接將細胞作為藥物，通過細胞移植的方法，用健康細胞替代病變細胞對各種疾病進行治療的方法。隨著體細胞重編程概念引入，細胞替代療法中源頭細胞的選擇不斷豐富。近年來，體細胞重編程為神經(jīng)細胞用于神經(jīng)退行性疾病治療受到廣泛關(guān)注，而供體細胞的選擇仍然多以成纖維細胞為主，在成纖維細胞獲取過程中必然產(chǎn)生一定程度損傷，對其擴增極易造成后代畸變，并且異體來源的成纖維細胞會引起免疫排斥反應(yīng)。血液細胞作為臨床診斷中常用的細胞來源，其采樣方便，細胞活力好、創(chuàng)傷小，現(xiàn)已成為重編程的最佳來源細胞。血液細胞最初在神經(jīng)細胞重編程領(lǐng)域的研究是采用新生兒臍血來源的CD34+細胞［1］。目前，已有多種血液細胞進行神經(jīng)細胞重編程，如外周血單個核細胞（PBMC）、T 細胞、混合外周血細胞（PBC）等均可誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞。本文結(jié)合文獻就血液細胞重編程為神經(jīng)細胞的研究進展作一綜述。

1 能夠誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞的血液細胞

最初用于誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的血液細胞是新生兒臍血細胞（HUCB），因為HUCB中含有豐富的胎盤樣干細胞和祖細胞，可快速高效地轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細胞。隨著研究不斷深入，目前已有多種血液細胞可用于誘導(dǎo)神經(jīng)細胞，如PBMC、T細胞、PBC等。

1.1 PBMC PBMC 是指外周血中具有單個細胞核的細胞，通常采用密度梯度離心法分離。以往供體細胞必須經(jīng)過擴增傳代來滿足重編程所需要的細胞數(shù)量，這會讓細胞具有譜系代數(shù)的異質(zhì)性，而PBMC則避開了這一缺點，一次取材可獲得大量細胞，使PBMC 成為更加優(yōu)質(zhì)的候選細胞。近年來，對于PBMC 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞的研究相對較少，轉(zhuǎn)化效率為0.6%～6%。2016 年，TANG 等［2］從一位33歲健康男性供血者中提取PBMC，利用非整合性附著載體來傳遞重編程基因（OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-Myc、KLF-4、SV40LT）去轉(zhuǎn)染PBMC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用PBMC 誘導(dǎo)的神經(jīng)干細胞（HiNSC）具有強大的擴增能力，誘導(dǎo)7 周后成功分化為MAP2+神經(jīng)元，并表達成熟神經(jīng)元表面標志物NeuN。該研究成果為體細胞重編程為神經(jīng)細胞擴展了供體細胞來源。YUAN 等［3］采用編碼OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc的非整合仙臺病毒載體轉(zhuǎn)染PBMC，經(jīng)過14～35 d誘導(dǎo)，出現(xiàn)了廣泛的HiNSC 克??；經(jīng)過10 d 誘導(dǎo)成功定向分化為多巴胺能神經(jīng)元，分化成熟的多巴胺能神經(jīng)元不僅表達中腦腹側(cè)神經(jīng)元標志物和核受體相關(guān)因子，還具備電生理活性，通過細胞移植治療帕金森病（PD）小鼠能夠明顯改善其臨床癥狀。同樣，ZHENG 等［4］采用編碼OCT3/4、SOX2、KLF4、c-Myc的仙臺病毒載體轉(zhuǎn)染PBMC，經(jīng)過2 個誘導(dǎo)階段（約42 d），成功將PBMC 分化為中腦腹側(cè)神經(jīng)元，移植入PD 小鼠后能夠明顯改善其運動功能。這些研究為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了依據(jù)。

采用PBMC 作為重編程的供體細胞，能夠避開傳統(tǒng)采用成纖維細胞作為重編程的供體細胞對人體本身的侵入性損害，如采用成纖維細胞需要開放性皮膚活檢，而且在實驗過程中，成纖維細胞需要不斷傳代以獲得足夠數(shù)量的實驗細胞，在此過程中會引發(fā)基因突變的風(fēng)險。但在對血液細胞重編程過程中，都使用了c-Myc這一原癌基因。OKITA等［5］研究表明，c-Myc 在血液細胞重編程過程中對誘導(dǎo)細胞衍生后代具有癌變風(fēng)險。但目前尚無血液細胞所衍生的神經(jīng)細胞在成瘤性方面的報道。因此，對于PBMC 重編程為神經(jīng)細胞的風(fēng)險仍需進一步探索，并且在實驗過程中，重編程和神經(jīng)元分化過程耗時久、效率低，仍有許多問題亟待解決。

1.2 T細胞 T細胞是一種終末分化的循環(huán)淋巴細胞。大多數(shù)研究認為，唯一有可能改變譜系特征的是未分化的干細胞和祖細胞，如成纖維細胞，而在終末分化的T 細胞上不會發(fā)生改變。TANABE 等［6］從1 名健康成人新鮮血液中分離出T 細胞作為起始細胞，使用游離載體編碼BRN2、ASCL1、MYT1L、NGN2四個轉(zhuǎn)錄因子后進行重編程，成功誘導(dǎo)分化出成熟的神經(jīng)元細胞。為了驗證該方法的普遍適用性，他們又采集了35名不同年齡段、不同種族和性別的健康成人血液進行重編程，結(jié)果均誘導(dǎo)分化出成熟的神經(jīng)元細胞。1 mL 外周血細胞在不需要初始擴增的情況下，一步就可以誘導(dǎo)產(chǎn)生5 萬多個神經(jīng)元細胞，其重編程效率達到6.2%。這些研究表明，細胞轉(zhuǎn)分化能力并非僅限于未分化的祖細胞，終末分化的體細胞通過重編程亦可分化為譜系親緣關(guān)系較遠的體細胞，并能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率［7-8］。T 細胞的重編程轉(zhuǎn)化效率雖然比同類研究較高，但與成纖維細胞相比，其轉(zhuǎn)化效率仍然較低。

1.3 PBC PBC 是血液細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞的常規(guī)來源細胞，除了正常人的PBC 可作為重編程的候選細胞外，阿爾茨海默病、PD 患者的PBC 亦可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞。研究表明，PBC 相較于其他血液細胞，可快速穩(wěn)定地向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化。2018 年SHENG 等［9］以仙臺病毒作為載體，非整合SOX2、c-Myc 兩個基因，在培養(yǎng)過程中添加小分子GSK3β抑制劑、Hedgehog 活化劑、ALK-5 抑制劑、重組人白血病抑制因子和苯環(huán)丙胺，在7 d 內(nèi)就可將PBC 轉(zhuǎn)化為HiNSC，轉(zhuǎn)化效率為0.08%～0.66%，繼續(xù)誘導(dǎo)分化6 周后，PBC 來源的HiNSC 分化為成熟的神經(jīng)元細胞。該研究還發(fā)現(xiàn)，直接轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的HiNSC 在很大程度上喪失了其親代PBC 的年齡相關(guān)性DNA 甲基化模式，其新生成的HiNSC 更年輕化。有研究認為，多能性因子OCT4 會引起遺傳畸變和染色體不穩(wěn)定［10］。本研究在未使用OCT4 的情況下，誘導(dǎo)分化形成的HiNSC 具備新生成細胞的譜系特征，在神經(jīng)退行性疾病治療上更具有臨床價值。

1.4 HUCB HUCB 是新生兒娩出后，殘留在胎盤和臍帶中的血液。臍血來源的細胞是最具年輕化的細胞，免疫原性較弱，是細胞生物治療、組織工程學(xué)等潛在的候選細胞。有研究報道，臍血中含有胚胎樣干細胞和祖細胞，能夠在培養(yǎng)過程中迅速高效地增殖，對其定向培養(yǎng)和誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞［11］。WALCZAK 等［12］成功將臍血來源的細胞定向分化為神經(jīng)元細胞，并將分化的神經(jīng)元細胞移植入小鼠紋狀體中，免疫組化顯示移植后臍血來源的神經(jīng)元細胞能夠在小鼠腦內(nèi)存活并表達早期神經(jīng)元標志物。HUCB 因其自身的突出特征，其在神經(jīng)退行性疾病的生物學(xué)治療中顯示出強大的臨床應(yīng)用前景。

2 血液細胞作為供體細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞的技術(shù)困難

現(xiàn)階段，血液細胞向神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)化的研究相對較少，仍面臨許多亟待解決的技術(shù)困難，如轉(zhuǎn)染多個轉(zhuǎn)錄因子的異質(zhì)性、血液細胞重編程效率低等。

2.1 轉(zhuǎn)染多個轉(zhuǎn)錄因子的異質(zhì)性 在重編程過程中，部分供體細胞不能同時轉(zhuǎn)染到幾個甚至十幾個轉(zhuǎn)錄因子，這部分供體細胞不能轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細胞，也不同于供體細胞，即在重編程過程中產(chǎn)生了異質(zhì)性。目前，多數(shù)研究產(chǎn)生的特定神經(jīng)元類型多為混合型或其他非典型的細胞類型［13］。如在產(chǎn)生特定多巴胺能神經(jīng)元的研究中，這種異質(zhì)性使得體外模型建立以及體內(nèi)追蹤多巴胺能神經(jīng)元變得困難。有研究試圖將誘導(dǎo)得到的多巴胺能神經(jīng)元進行純化，培養(yǎng)25 d時純化的Th 陽性細胞僅達到70%［14］。此外，異質(zhì)性可引起移植后宿主體內(nèi)腫瘤形成、異動癥等其他未知風(fēng)險的發(fā)生，給患者帶來了潛在的、不可預(yù)估的安全風(fēng)險［15］?，F(xiàn)階段針對特定神經(jīng)細胞的優(yōu)化方案并不十分完美，均無法回避血液細胞重編程為特定神經(jīng)細胞時的異質(zhì)性問題。

2.2 血液細胞重編程效率低 相較于重編程轉(zhuǎn)化種子細胞的成纖維細胞，血液細胞的誘導(dǎo)分化效率低這一技術(shù)難題一直未被突破，這也限制了血液細胞重編程為神經(jīng)細胞的臨床應(yīng)用［16］。學(xué)者們通過多種方法來提高重編程效率，如有研究發(fā)現(xiàn)分化潛能高的造血祖細胞重編程效率高于終末分化的T細胞和B 細胞，表明細胞的分化狀態(tài)可能對血液細胞的重編程效率有一定影響［17-18］。細胞的表觀遺傳學(xué)不管是在干細胞還是在體細胞均普遍存在，表觀遺傳因子的靶點是某一功能的一群基因，而不是某一個基因，實現(xiàn)靶向性必須依賴其他因子的共同作用。有研究報道，轉(zhuǎn)錄因子的基因沉默能夠抑制某些表觀遺傳學(xué)作用［19］。因此，對這些機制進行干擾有可能會提高血液細胞的重編程效率。

3 轉(zhuǎn)錄因子在血液細胞重編程為神經(jīng)細胞過程中的作用

3.1 SOX2 在血液細胞重編程為神經(jīng)細胞中的作用 SOX2 基因定位于人染色體3q26.3-27，其編碼的SOX2 蛋 白由317 個氨基酸組成［20］。AVILION等［21］研究發(fā)現(xiàn)，SOX2 蛋白能夠在神經(jīng)外胚層的HiNSC 中特異性表達，對維持胚胎干細胞的自我更新和干性具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。ELLIS 等［22］通過綠色熒光蛋白標記SOX2 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，證實SOX2不僅表達于胚胎神經(jīng)祖細胞，還可表達于成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的增殖細胞以及一些神經(jīng)組織，如側(cè)腦室下區(qū)、海馬齒狀回的顆粒下層等。因此，在血液細胞重編程為神經(jīng)細胞過程中，研究者們常常加入SOX2以加速重編程進程。

3.2 OCT4 在血液細胞重編程為神經(jīng)細胞中的作用 OCT4 屬于POU 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，能夠激活或抑制多種靶基因表達，是維持胚胎干細胞多能性的關(guān)鍵基因［23］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，OCT4 與SOX2 特異性結(jié)合可加速血液細胞重編程進程［24］。因此，OCT4在血液細胞重編程為神經(jīng)細胞中的作用逐漸受到重視。

3.3 ASCL1 在血液細胞重編程為神經(jīng)細胞中的作用 ASCL1是堿性螺旋—環(huán)—螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，能夠促進高分化潛能細胞向神經(jīng)元細胞分化［25］，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中不可或缺。研究表明，ASCL1 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特定神經(jīng)細胞的增殖具有調(diào)節(jié)作用，能夠決定特定神經(jīng)細胞中哪些DNA 序列被開啟或關(guān)閉，從而決定這些細胞的形成和功能。

4 血液細胞重編程為神經(jīng)細胞的臨床應(yīng)用前景

神經(jīng)系統(tǒng)是人體內(nèi)起主導(dǎo)作用的功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變后，病變的神經(jīng)細胞不能進行有效地再生與修復(fù)，故神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致死率和致殘率一直高居榜首。隨著人口老齡化程度加深，神經(jīng)退行性疾病在老年人群中的患病率明顯上升，但當(dāng)前的醫(yī)療手段仍停留在控制疾病進展階段。因此，替換或修復(fù)損傷和缺失的神經(jīng)細胞成為學(xué)者們著力攻克的難題。利用干細胞重編程分化為神經(jīng)細胞已成為治療神經(jīng)退行性疾病的研究熱點。學(xué)者們通過構(gòu)建神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型，在體外通過相關(guān)手段將不同來源細胞重編程為特定的神經(jīng)細胞，再移植入體內(nèi)，從而治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。血液細胞作為臨床診斷中常用的細胞來源，其采樣方便，細胞活力好、創(chuàng)傷小，現(xiàn)已成為重編程的最佳來源細胞，在神經(jīng)退行性疾病的治療中具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，血液細胞重編程為神經(jīng)細胞將為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了一條新的途徑，相較于其他來源類型的細胞，血液細胞采樣方便，細胞活力好、創(chuàng)傷小，是細胞重編程的最佳來源細胞。但血液細胞重編程過程中也存在一系列技術(shù)難題，如轉(zhuǎn)染多個轉(zhuǎn)錄因子的異質(zhì)性、血液細胞重編程效率低等。如能解決這些技術(shù)難題，血液細胞重編程為神經(jīng)細胞在神經(jīng)退行性疾病治療中的應(yīng)用前景將更加廣闊。