周伊敏，姜志梅

孤獨(dú)癥譜系障礙 （autism spectrum disorder，ASD） 是一組發(fā)生于兒童發(fā)育早期的發(fā)育障礙性疾病，以社交障礙、限制性重復(fù)刻板行為和興趣狹窄為核心癥狀［1］。美國疾病控制與預(yù)防中心于2020 年公布的 ASD 患病率由 1/59 增加至 1/54，中國 0～6 歲ASD 兒童患病率為 3.51‰，均呈逐年上升趨勢(shì)［2，3］。迄今ASD 病因與發(fā)病機(jī)制尚未闡明，常伴有的感知覺、胃腸道和睡眠等問題已嚴(yán)重影響了兒童的日常生活，導(dǎo)致 ASD 成為嚴(yán)峻的社會(huì)問題之一［4］。由于兒童早期的神經(jīng)系統(tǒng)可塑性強(qiáng)，研究者認(rèn)為早期識(shí)別、及時(shí)診斷以及有效干預(yù)能明顯改善ASD 的不良預(yù)后［5］。然而現(xiàn)在大多是結(jié)合兒童的核心癥狀、典型行為以及量表對(duì)ASD 進(jìn)行診斷，主觀性強(qiáng)，早期診斷難以實(shí)現(xiàn)［6］。故尋找和開發(fā)能客觀有效地預(yù)測ASD 危險(xiǎn)因素或篩查可疑ASD 兒童的生物標(biāo)志物，已成為ASD 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年ASD 的外周血潛在生物標(biāo)志物的研究取得較大進(jìn)展，尤其在MicroRNA、lncRNA、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、淀粉樣前體蛋白以及免疫活性物質(zhì)方面。該文就ASD 外周血潛在生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為ASD 的病理機(jī)制研究、早期診斷及開發(fā)藥物治療新靶點(diǎn)提供幫助。

1 ASD 與非編碼RNA

1.1 MicroRNA微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約20～24 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，由內(nèi)源基因進(jìn)行編碼并參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。相關(guān)研究表明尸檢腦組織、外周血和唾液中miRNA 表達(dá)的失調(diào)與 ASD 有關(guān)［7］。一項(xiàng)針對(duì)腦部尸檢標(biāo)本miRNA 表達(dá)水平的高通量分析表明，與正常人對(duì)比，hsa-miR-21-3p 在ASD 中被上調(diào)，能夠靶向調(diào)節(jié)ASD 相關(guān)的神經(jīng)元基因并下調(diào)其表達(dá)；hsa_can_1002-m 在 ASD 中被下調(diào)，能夠調(diào)節(jié)涉及神經(jīng)發(fā)育和免疫功能的表皮生長因子受體和成纖維細(xì)胞生長因子受體的信號(hào)通路［8］。Nt 等［9］采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）對(duì) 30 例 3～11 歲 ASD 患者與 30 名健康對(duì)照組的血清miR-328-3p 和miR-3135a 表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示： 與健康對(duì)照組相比，ASD 患者中的miR-328-3p 和 miR-3135a 明顯下調(diào)； 血清 miR-3135a 和miR-328-3p 可將ASD 患者與健康對(duì)照組區(qū)分開，有望成為診斷ASD 的新型生物標(biāo)志物。Kichukova 等［10］對(duì) ASD 患者與健康對(duì)照組血清中的42 種 miRNA 進(jìn)行了 qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn) ASD 患者血清中的 3 種 miRNA （miR-365a-3p、miR-619-5p 和miR-664a-3p） 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，血清中的 5 種 miRNA（miR-3135a、miR-328-3p、miR-197-5p、miR-500a-5p 和 miR-424-5p）表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，提出這8 種血清miRNA 可作為診斷 ASD 的潛在生物標(biāo)志物。Nakata 等［11］采用 qRTPCR 方法檢測高功能 ASD （High Functioning Autism Spectrum Disorder，HFASD） 成人患者的血液miRNA 表達(dá)水平，結(jié)果與正常組相比，miR-6126在ASD 患者中下調(diào)顯著，且miR-6126 表達(dá)水平與ASD 的癥狀嚴(yán)重程度有關(guān)，但與智商（Intelligence Quotient，IQ） 無關(guān)，提示血液 miRNA 可能是診斷HFASD 的潛在生化指標(biāo)。還有研究通過高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）證明，血清miRNA表達(dá)水平可用作篩選和檢測ASD 患者自身免疫性疾病和線粒體功能障礙的潛在生物標(biāo)志物［12］。由于不同組織、RNA 質(zhì)量和用藥狀態(tài)等因素，miRNA 尚未成為特異性診斷ASD 的生物標(biāo)志物，后續(xù)研究需注重控制潛在影響因素，且擴(kuò)大樣本進(jìn)行miRNA亞型之間的重復(fù)驗(yàn)證，從而確定最適用于ASD 診斷的miRNA 亞型。

1.2 lncRNA長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 是長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與細(xì)胞分化、劑量補(bǔ)償效應(yīng)（Dosage compensation effect）、細(xì)胞周期以及表觀遺傳調(diào)控等神經(jīng)活動(dòng)。Parikshak 等［13］采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq） 檢測了48 例ASD 患者與49 名正常人的腦部尸檢標(biāo)本的lncRNA 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD 患者的lncRNA 存在靈長類動(dòng)物特異性表達(dá)模式，于大腦中相對(duì)富集并富含ASD 風(fēng)險(xiǎn)基因，其中兩種靈長類特異性的lncRNA（即 LINC00693 和 LINC00689）在ASD 患者皮質(zhì)中被上調(diào)，而在正常發(fā)育期間是下調(diào)的。Wang 等［14］通過微陣列雜交（Microarray hybridization）和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative realtime PCR）比較 25 對(duì) 3～5 歲 ASD 和健康兒童的外周血 lncRNA 水平，發(fā)現(xiàn) ASD 中的 13 種突觸lncRNA 具有顯著差異性表達(dá)，與HOX 基因有關(guān)的lncRNA 也存在差異性表達(dá)，并提出外周血lncRNA可能是診斷ASD 的潛在生物標(biāo)志物。至今國內(nèi)外對(duì)此研究存在樣本量小、缺乏重復(fù)驗(yàn)證等局限性，進(jìn)一步探究lncRNA 的分子作用機(jī)制與途徑將有助于發(fā)掘lncRNA 與ASD 發(fā)病的相關(guān)性。

2 ASD 與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracelluar signalregulated protein kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-aetivated protein kinases，MAPKs）的重要一員，參與MAPKs 的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即MAPK 激酶的激酶 （Raf）-MAPK 激酶 （MEK）-MAPK（ERK，其中 ERK1 和 ERK2 是主要亞型）信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通過連續(xù)的磷酸化步驟，ERK 信號(hào)傳導(dǎo)通路將傳入的細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核中，從而調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化和遷徙以及細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，同時(shí)參與一系列神經(jīng)活動(dòng)，包括突觸可塑性的調(diào)節(jié)、大腦發(fā)育的調(diào)控、學(xué)習(xí)和記憶的形成等。

已有ASD 基因集和通路網(wǎng)絡(luò)分析表明，MEK/ERK 信號(hào)傳導(dǎo)通路與 ASD 聯(lián)系密切［15］。Pucilowska等［16］發(fā)現(xiàn)小鼠模型 ERK1 基因或 ERK2 基因的缺失，均可導(dǎo)致孤獨(dú)癥樣表現(xiàn)。有研究進(jìn)一步表明，ASD 小鼠模型大腦皮質(zhì)中MEK/ERK 信號(hào)通路的激活水平升高［17］。Faridar 等［18］發(fā)現(xiàn)剛出生和 30 日齡的BTBR 小鼠大腦的ERK 通路過度激活，尤其是剛出生的小鼠。Cheng 等［19］發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組 B6 小鼠相比，剛出生的BTBR 鼠模型海馬裂解液中磷酸化的 MEK （Phospho-MEK，p-MEK） 和磷酸化的ERK（Phospho-ERK，p-ERK）表達(dá)水平均升高。孫艷秋等［20］發(fā)現(xiàn)ASD 仔鼠模型在發(fā)育過程中額皮質(zhì)ERK 的表達(dá)增加，于 14 日齡達(dá)到最大峰值，28 日齡趨于穩(wěn)定。一項(xiàng)研究表明MEK/ERK 通路的活性受 MEK 抑制劑 U0126 特異抑制后，VPA 聯(lián)合U0126 組大鼠海馬、小腦組織及前額葉皮質(zhì)中的p-MEK 和p-ERK 表達(dá)均顯著下降，明顯減輕了孤獨(dú)癥樣行為［21］。Pucilowska 等［22］對(duì)產(chǎn)前及出生后 90 日齡的ASD 小鼠模型均使用ERK 特異性抑制劑細(xì)胞滲透肽RB1/RB3，模型小鼠的行為缺陷得到有效改善。基于ASD 鼠模型腦組織的MEK/ERK 通路過度激活，F(xiàn)aridar 等［18］還揭示了 ASD 鼠模型淋巴細(xì)胞中MEK 蛋白和ERK 蛋白的表達(dá)水平與其在鼠模型腦組織中的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)性，提示ASD患者淋巴細(xì)胞中的MEK/ERK 通路可能失調(diào)，且推測或許可在ASD 患者外周血中開發(fā)相關(guān)生物標(biāo)志物。對(duì)此，Erickson 等［23］首次通過免疫組化技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）對(duì)ASD 患者外周血淋巴細(xì)胞ERK 表達(dá)展開研究，發(fā)現(xiàn)ASD 患者p-ERK 較對(duì)照組增加顯著，并提出ERK 可考慮成為篩查ASD 的潛在生物標(biāo)志物，但結(jié)果無法進(jìn)行ASD 患者亞組的有效分析，包括臨床癥狀程度、年齡、智力、服用精神藥物等。下一步研究需擴(kuò)大樣本重復(fù)驗(yàn)證以確定外周血淋巴細(xì)胞中過度激活的ERK 是否等同于大腦中的ERK 失調(diào)，目前國內(nèi)對(duì)此實(shí)證研究尚屬空白，而且MEK 表達(dá)失調(diào)是否可在人外周血中檢測尚不明確。

3 ASD 與淀粉樣前體蛋白

淀粉樣前體蛋白 （Amyloid precursor protein，APP）是一種單次跨膜蛋白，廣泛存在于全身組織細(xì)胞中。APP 經(jīng)a 分泌酶裂解后生成具有神經(jīng)營養(yǎng)作用 的分泌 型 APP-α （secreted amyloid precursor protection alpha，sAPP-α）；但經(jīng) β 和 y 分泌酶裂解后的APP 產(chǎn)生在高濃度（nM）時(shí)表現(xiàn)為毒性作用的β-淀粉樣蛋白 （β-amyloid，Aβ），Aβ 包含 40 或 42個(gè)氨基酸殘基（Aβ1-40、Aβ1-42）。

近年有對(duì)照研究表明，ASD 兒童的外周血sAPP-α 水平較健康兒童增加明顯，而且差異在不同程度病情ASD 間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［24］。這一研究結(jié)果經(jīng)國內(nèi)汪鴻等人擴(kuò)大樣本量后得到進(jìn)一步證實(shí)，顯示重度ASD 兒童的外周血sAPP-α 水平較輕-中度ASD 的增加顯著，并發(fā)現(xiàn)父母親高齡受孕、早產(chǎn)小孕周、出生體重輕、新生兒高膽紅素血癥及缺氧缺血性腦病是ASD 兒童sAPP-α 升高的影響 因 素［25］。Bailey 等［26］通過酶聯(lián)免疫吸附 測定 法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA） 檢測了25 例2～4 歲 ASD 兒童和25 名年齡匹配的健康兒童的血漿 sAPP-α 水平，發(fā)現(xiàn) sAPP-α 在 60%的ASD 兒童中表達(dá)顯著增加，故考慮sAPP-α 可作為早期識(shí)別兒童患 ASD 的輔助指標(biāo)。Ray 等［27］用ELISA 法分析了 6 例輕-中度 ASD 兒童、15 例重度ASD 兒童以及18 名健康兒童的血漿樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重度 ASD 兒童血漿 sAPP-α 表達(dá)顯著增高；Aβ1-40、Aβ1-42 與 sAPP-β 顯著下降； 輕-中度ASD 患兒與健康兒童對(duì)比無顯著差異。研究提示外周血sAPP-α 可能是輔助診斷重度ASD 的潛在生物標(biāo)志物。為進(jìn)一步探討APP 在ASD 外周血中表達(dá)的特異性，汪鴻等［28］對(duì) 103 例 ASD 兒童血漿總sAPP、sAPP-α 和 sAPP-β 采用 ELISA 法進(jìn)行檢測，且與 78 名健康兒童、25 例注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD） 兒童和 25 例智力障礙（intellectual disability，ID）兒童進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：sAPP 和 sAPP-α 在 ASD、健康兒童、ADHD 和ID 之間差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，sAPP-β 的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明外周血sAPP 和sAPP-α 表達(dá)在ASD 兒童中具有特異性，可作為疾病篩查的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。此外與36 名3～16歲健康兒童比較，52 例ASD 兒童的血漿Aβ1-40、Aβ1-42 和 Aβ40/Aβ42 比值均顯著下降，且受試者工作特征曲線 （receiver operator characteristic curve，ROC）在區(qū)分ASD 及健康兒童上顯示高度特異性與敏感性［29］。盡管以上研究尚未明確APP 是導(dǎo)致ASD 發(fā)病的直接原因，且sAPP-α 如何介導(dǎo)與ASD 相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳遞仍是未解之謎，但APP 目前作為一種外周血生物標(biāo)志物結(jié)合臨床癥狀診斷ASD 是有參考意義的。

4 ASD 與免疫活性物質(zhì)

4.1 細(xì)胞因子細(xì)胞因子（cytokine，CK）是一類由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，可介導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，或作為生長因子促進(jìn)靶細(xì)胞增殖、分化。Saghazadeh 等［30］對(duì) 38 項(xiàng)研究中涉及2487 名參與者 （1393 名 ASD 患者和 1094 名對(duì)照組） 的外周血細(xì)胞因子水平進(jìn)行Meta 分析，發(fā)現(xiàn)ASD 患者外周血干擾素（Interferon，IFN）-γ、白介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 的 濃 度 均 高 于 對(duì) 照 組 。Krakowiak 等［31］使用 Luminex Multiplex 技術(shù)對(duì) 214例 2～4 歲 ASD 兒童 （141 例重度 ASD，73 名輕-中度ASD）、62 名正常兒童和27 例發(fā)育遲緩（developmental delay，DD）兒童的出生48 h 內(nèi)儲(chǔ)存的血液樣本進(jìn)行細(xì)胞因子水平檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生兒期血清 IL-1β 和 IL-4 濃度增高者，患 ASD 風(fēng)險(xiǎn)增大；其中 IL-4 濃度升高者患重度ASD 風(fēng)險(xiǎn)增加1.4 倍，且與非語言的認(rèn)知能力呈負(fù)相關(guān)；IL-1β 濃度升高者患輕-中度ASD 風(fēng)險(xiǎn)增加3 倍。研究提示IL-1β和IL-4 可為早期預(yù)測不同嚴(yán)重程度ASD 提供參考依據(jù)。有研究通過ELISA 法對(duì)42 例ASD 兒童和20名相匹配的正常兒童的血清細(xì)胞因子水平進(jìn)一步分析，顯示 ASD 兒童的 IL-1β，IL-4，IL-6 和 IL-13濃度較正常兒童顯著升高，而且ROC 結(jié)果表明這4種因子可能是診斷 ASD 的潛在生物標(biāo)志物［32］。Singh 等［33］對(duì) 30 例 ASD 兒童與匹配的正常兒童的血清成分進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)ASD 兒童血清IL-8 水平較對(duì)照組的高，而且促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）和IL-8 較其他表達(dá)差異的血清蛋白具有更高診斷水平。其中IL-8 診斷ASD 的靈敏度達(dá)94%、特異性為55%、準(zhǔn)確率為74%；TSH 診斷的靈敏度達(dá)94%、特異性為60%、準(zhǔn)確率為76%；結(jié)合兩項(xiàng)指標(biāo)診斷的靈敏度達(dá)89%、特異性為75%、準(zhǔn)確率為 82%。Mostafa 等［34］用 ELISA 法檢測62 例4～11 歲的ASD 兒童的血清上皮細(xì)胞衍生的中性粒激活胎78（ENA-78）水平，發(fā)現(xiàn)ASD 兒童的ENA-78 水平顯著高于相匹配的健康對(duì)照組，且與ASD 兒童的血清抗神經(jīng)自身抗體的升高顯著相關(guān)，提出接下來應(yīng)探討ENA-78 拮抗劑對(duì)ASD 兒童的治療作用。另有研究對(duì)84 例 ASD 兒童、49 例DD兒童和159 名正常兒童在出生48 h 內(nèi)儲(chǔ)存的血液樣本進(jìn)行檢測，顯示與正常兒童對(duì)比，ASD 兒童的單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1） 升高，DD 兒童的巨噬細(xì)胞炎癥蛋白 1α（macrophage inflammatory protein-1alpha，MIP-1α）降低，表明檢測新生兒血液中的免疫生化指標(biāo)可能有助于早期識(shí)別異常的神經(jīng)發(fā)育疾病［35］。目前細(xì)胞因子在ASD 診斷中的特異性尚未明確，甚至出現(xiàn)研究結(jié)果相矛盾，后續(xù)跨文化的縱向研究需更嚴(yán)謹(jǐn)以增加數(shù)據(jù)的可靠性和臨床的應(yīng)用性。

4.2 自身抗體自身抗體指針對(duì)自身組織，器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體，其中抗腦抗體是一類能在血清中作用于腦組織的自身抗體。已有研究報(bào)道ASD 患兒的血清抗核抗體、骨橋蛋白、抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體等抗腦抗體水較正常兒童顯著升高，并與ASD 病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［36］。Al-Ayadlhi 等［37］采用ELISA 法對(duì)60 例 3～12 歲 ASD 兒童的血漿抗核小體特異性抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與健康兒童對(duì)比，ASD 兒童血漿內(nèi)存在高水平的抗核小體特異性抗體，且存在自身免疫病家族史的ASD 兒童的血漿抗核小體抗體水平顯著高于無自身免疫病家族史的ASD 兒童，提示可通過免疫生化指標(biāo)來探究ASD 的發(fā)病機(jī)制及潛在的生物標(biāo)志物。Frye 等［38］的研究發(fā)現(xiàn)，94 例ASD 兒童的葉酸受體α 自身抗體的封閉與ASD 特定的生理和行為特征有關(guān)，有助于進(jìn)行ASD 的亞型分析。

4.3 其他ASD 患者體內(nèi)存在一定具有特異性的分子或蛋白，可考慮作為早期診斷ASD 的標(biāo)志物，如γ-氨基丁酸、干擾素γ 和催產(chǎn)素誘導(dǎo)的蛋白16（IFI16）與 SRS 和 CARS 量表得分均明顯相關(guān)，三者可作為評(píng)估 ASD 嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物［39］。Qasem等［40］發(fā)現(xiàn)ASD 患者體內(nèi)8-差向前列腺素和半胱氨酰白三烯的濃度較正常人顯著升高，提出二者可作為早期發(fā)現(xiàn)ASD 患者的生物標(biāo)志物。此外，ASD 兒童的血漿新蝶呤水平增高，新蝶呤水平的檢測可作為 ASD 的輔助診斷，正常不超過 8.5 nmol/L［41］。還有ASD 兒童的血漿脂氧素A4 水平降低，檢測血漿脂氧素A4 也可作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，正常兒童不低于81.5 pg/mL［42］。

5 展 望

迄今，ASD 病因與發(fā)病機(jī)制仍不明確，而且量表診斷主觀性強(qiáng)，導(dǎo)致ASD 的早期識(shí)別、及時(shí)診斷以及有效干預(yù)相對(duì)滯后，故建立一種結(jié)合生物標(biāo)志物和臨床癥候群為一體的ASD 診斷系統(tǒng)具有重大意義。其中血液采集相對(duì)簡單快捷，侵入性和成本效益較低，是作為疾病診斷標(biāo)志物的最佳來源之一，更適用于臨床大規(guī)模篩查和診斷ASD。然而由于血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的存在，從外周血中找到ASD 蛋白標(biāo)志物仍有一定難度，特別是源自大腦病變的相關(guān)疾病的特異性蛋白標(biāo)志物。

目前，ASD 的生物學(xué)指標(biāo)變化復(fù)雜多樣，不同程度的病情由不同的神經(jīng)系統(tǒng)病變決定，進(jìn)而有不同的神經(jīng)生化改變，無法確定以哪種生物標(biāo)志物為主要標(biāo)準(zhǔn)。而APP 及其分解物在ASD 中相對(duì)特異，但大部分研究仍存在樣本量小、方法學(xué)差異及缺乏跨文化的重復(fù)驗(yàn)證等局限性，使得臨床應(yīng)用受到限制。未來針對(duì)ASD 兒童的實(shí)驗(yàn)室檢測，需要全面考慮患兒的年齡、起病經(jīng)過、病情輕重程度以及有無并發(fā)癥等因素進(jìn)行分層研究，還要在樣本量與標(biāo)準(zhǔn)化上獲取更多支持，以增加檢測結(jié)果的可靠性，進(jìn)而開發(fā)不同階段的特異性生物標(biāo)志物。