孫娟，楊莉娜 ，崔昊晶，胡文良，蘇琳，2

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，呼和浩特010000；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

喉癌作為頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人們健康。目前，喉癌的診療取得了一定進(jìn)展，但尚未獲得令人滿(mǎn)意的診療策略，多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，總體預(yù)后較差。喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)仍是臨床一大難題。因此，尋找能夠預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)志物和治療新靶標(biāo)意義重大。鐵死亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡的一種方式，逐漸成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究表明，鐵死亡具有抑制腫瘤（胰腺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤）細(xì)胞增殖，增加化療藥物敏感性等作用［1-4］。此外，鐵死亡與頭頸部鱗狀細(xì)胞關(guān)系密切，抑制Glutaredoxin5基因表達(dá)能夠使順鉑耐藥的頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［4］。可見(jiàn)鐵死亡基因在頭頸部腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但迄今尚無(wú)獨(dú)立研究喉癌與鐵死亡基因關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究基于美國(guó)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選與喉癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因，并建立預(yù)后預(yù)測(cè)模型，以期為喉癌的診療及預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中2000—2020年收錄并具有完整隨訪(fǎng)信息的喉鱗狀細(xì)胞癌樣本96例，均來(lái)自術(shù)后喉鱗狀細(xì)胞癌患者，均經(jīng)病理檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未進(jìn)行放療或化療；首次進(jìn)行手術(shù)治療；隨訪(fǎng)時(shí)間均超過(guò)1年；病歷資料完整?；颊吣?2例，女14例；年齡≤65歲65例，＞65歲31例；腫瘤等級(jí)G1～G2級(jí)40例，G3～G4級(jí)56例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期51例；原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)T1～T2期17例，T3～T4期79例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0期41例，N1～N3期55例。下載該喉癌數(shù)據(jù)集相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNAseq數(shù)據(jù)及樣本相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，用于后續(xù)分析。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017MS0838）。

1.2 喉癌中鐵死亡基因篩選 基于美國(guó)國(guó)家生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘能夠調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的鐵死亡基因60個(gè)，用于后續(xù)對(duì)照分析。用R語(yǔ)言limma包提取96例喉癌樣本中鐵死亡基因，并進(jìn)行差異表達(dá)分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率檢驗(yàn)（FDR）＜0.05為基因差異表達(dá)。

1.3 與喉癌預(yù)后有關(guān)的鐵死亡基因篩選 用R語(yǔ)言limma包提取TCGA喉癌樣本的存活時(shí)間及存活狀態(tài)（96例患者存活60例，死亡36例，隨訪(fǎng)時(shí)間2000—2020年），用R語(yǔ)言survival包對(duì)基因與喉癌預(yù)后時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行COX單因素回歸分析，P＜0.05被認(rèn)為與預(yù)后相關(guān)，風(fēng)險(xiǎn)比（HR）＞1代表該基因表達(dá)量與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即基因表達(dá)量越高，預(yù)后越差；HR＜1則相反。將差異表達(dá)鐵死亡基因與預(yù)后相關(guān)基因取交集后，獲得與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因。同時(shí)繪制森林圖，HR＞1為高風(fēng)險(xiǎn)基因，HR＜1為保護(hù)基因。用R語(yǔ)言pheatmap包繪制預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因表達(dá)熱圖。

1.4 喉癌中鐵死亡基因相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)模型建立及效能評(píng)估 基于LIANG等［5］的研究方法，利用LASSO回歸對(duì)TCGA樣本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，風(fēng)險(xiǎn)值根據(jù)以下公式得出：風(fēng)險(xiǎn)值表示回歸系數(shù)，xi表示基因相對(duì)表達(dá)值。獨(dú)立變量是鐵死亡相關(guān)預(yù)后基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)矩陣，而響應(yīng)變量是TCGA隊(duì)列中患者的總體生存率和生存狀態(tài)。確定模型的懲罰參數(shù)（λ）并遵循最低標(biāo)準(zhǔn)（即對(duì)應(yīng)于最低的部分似然偏差的λ值）進(jìn)行10倍交叉驗(yàn)證。根據(jù)每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。用這3個(gè)鐵死亡基因的表達(dá)量進(jìn)行LASSO回歸分析，在模擬1 000次運(yùn)算后，計(jì)算出基于每個(gè)獨(dú)立基因，或每?jī)蓚€(gè)基因，或全部3個(gè)基因的分組結(jié)果，結(jié)果顯示根據(jù)HSPB1、FTH1基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)（-2.568分）得到的分組結(jié)果最優(yōu)?；赗語(yǔ)言survival包進(jìn)行鐵死亡基因聯(lián)合預(yù)測(cè)喉癌患者生存率。利用R語(yǔ)言survival ROC包建立時(shí)間依賴(lài)性的ROC曲線(xiàn)以評(píng)估鐵死亡基因相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)喉癌預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 喉癌中與喉癌預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因 共篩選出3個(gè)鐵死亡基因與喉癌預(yù)后相關(guān)。PHKG2（HR=0.409，95%CI：0.199～0.842，P=0.015）、HSPB1（HR=1.842，95%CI：1.022～3.320，P=0.042）、FTH1（HR=1.708，95%CI：1.131～2.580，P=0.011）。其中，HSPB1、FTH1為高風(fēng)險(xiǎn)基因，PHKG2為保護(hù)基因。與正常樣本對(duì)比，PHKG2在喉癌樣本中低表達(dá)，HSPB1、FTH1在喉癌樣本中高表達(dá)。

2.2 鐵死亡基因風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)喉癌預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 該模型預(yù)測(cè)喉癌患者術(shù)后1、2、3年生存率的ROC線(xiàn)下面積分別為0.657、0.691、0.770。且隨時(shí)間延長(zhǎng)，該模型的敏感度、特異度逐漸升高。

3 討論

研究認(rèn)為細(xì)胞死亡主要分為凋亡和壞死。隨著研究不斷深入，細(xì)胞還可通過(guò)自噬、脹亡、焦亡等方式死亡［6-7］。此外，鐵死亡是2012年發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴(lài)的細(xì)胞程序性死亡形式之一，涉及多種疾病，有望成為腫瘤治療的新方式［8］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞鐵死亡過(guò)程會(huì)受復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，如核因子E2相關(guān)因子2能夠通過(guò)調(diào)控鐵死亡和線(xiàn)粒體功能障礙參與神經(jīng)變性過(guò)程［9］。腫瘤抑制因子TP53可通過(guò)抑制溶質(zhì)載體家族7成員11或過(guò)表達(dá)亞精胺/亞精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶1、谷氨酰胺酶2，影響鐵死亡基因網(wǎng)絡(luò)，從而促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡［10］。

本研究通過(guò)文獻(xiàn)挖掘收集了與鐵死亡相關(guān)的基因60個(gè)，并以此為靶點(diǎn)進(jìn)行分析。本研究共發(fā)現(xiàn)喉癌預(yù)后相關(guān)鐵死亡基因3個(gè)，分別為兩個(gè)高?；騊HKG2、FTH1，1個(gè)保護(hù)基因HSPB1。研究發(fā)現(xiàn)，抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4的小分子會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化物的致死性積累，并導(dǎo)致鐵死亡。在這個(gè)過(guò)程中，PHKG2能夠調(diào)節(jié)脂氧合酶的鐵利用量，進(jìn)而使不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，從而驅(qū)動(dòng)鐵死亡［11］。PHKG2在喉癌中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)PHKG2高表達(dá)是喉癌預(yù)后的高危因素，這可能與PHKG2通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡通路來(lái)促進(jìn)喉癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究證實(shí)，F(xiàn)TH1能夠通過(guò)吞噬鐵蛋白來(lái)抑制鐵死亡的發(fā)生，這使得FTH1能夠抑制鐵死亡促進(jìn)多種癌癥（肝癌、膀胱癌等）的發(fā)生發(fā)展［12-13］，但FTH1在喉癌中的作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TH1是喉癌預(yù)后的高危因素，提示FTH1可能在喉癌中也具有促癌作用。HSPB1是癌細(xì)胞鐵死亡的負(fù)性調(diào)節(jié)劑。蛋白激酶C介導(dǎo)的HSPB1磷酸化可通過(guò)減少鐵介導(dǎo)的脂質(zhì)反應(yīng)性氧化而抑制鐵死亡，從而提高抗癌活性［14］。在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)HSPB1后，癌細(xì)胞的鐵死亡明顯增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，HSPB1是喉癌預(yù)后的保護(hù)因素。以上結(jié)果提示HSPB1、PHKG2、FTH1能夠通過(guò)調(diào)控鐵死亡過(guò)程影響癌癥的發(fā)生發(fā)展，然而它們?cè)诤戆┲械淖饔蒙胁磺宄?。本研究發(fā)現(xiàn)它們與喉癌的預(yù)后關(guān)系密切，可能是喉癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。

目前，臨床主要根據(jù)腫瘤組織病理、淋巴結(jié)活檢及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移來(lái)預(yù)測(cè)喉癌患者的預(yù)后。然而，以上預(yù)測(cè)也存在較大差異，需要補(bǔ)充其他輔助手段進(jìn)而提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性［15］。本研究通過(guò)LASSO回歸等方法建立喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，以期為喉癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)找尋新的靶點(diǎn)。該模型基于鐵死亡基因HSPB1和FTH1的表達(dá)將喉癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，生存曲線(xiàn)證實(shí)兩組生存率有顯著差異，survStat分析結(jié)果也佐證了這一結(jié)果。ROC曲線(xiàn)提示該模型隨生存時(shí)間延長(zhǎng)其敏感度和特異度隨之升高。這提示該模型具有較強(qiáng)的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。然而，該模型對(duì)喉癌患者的危險(xiǎn)評(píng)分能夠與腫瘤分期作用相當(dāng)，提示該模型具有重要的臨床價(jià)值。在未來(lái)，臨床中可能通過(guò)檢測(cè)喉癌患者樣本中HSPB1和FTH1的表達(dá)量，來(lái)判斷喉癌患者是否處于高風(fēng)險(xiǎn)組，從而達(dá)到預(yù)測(cè)預(yù)后的目的。此外，與其他研究［16］相比，本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將研究范圍精準(zhǔn)縮小，重點(diǎn)探索鐵死亡基因?qū)戆╊A(yù)后的判斷及影響，有助于喉癌發(fā)生新機(jī)制以及喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)等方面的深入研究。這是首個(gè)根據(jù)鐵死亡基因建立的喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型。結(jié)果顯示，這一模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分高危風(fēng)險(xiǎn)與低危風(fēng)險(xiǎn)喉癌患者，而且具有很高的敏感度和特異度，具有成為輔助預(yù)后預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的潛力。此外，在獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析中，喉癌的腫瘤分期是獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，這符合惡性腫瘤的性質(zhì)特點(diǎn)。與腫瘤分期相比，本研究中的預(yù)測(cè)模型同樣能夠作為喉癌預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。盡管得出上述結(jié)論，但有關(guān)這3個(gè)鐵死亡基因在喉癌中的作用及機(jī)制的臨床、基礎(chǔ)研究很少，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)三者在喉癌中的作用。

綜上所述，基于TCGA和生物信息學(xué)方法構(gòu)建喉癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，結(jié)果顯示HSPB1是喉癌預(yù)后的保護(hù)因素，PHKG2和FTH1是喉癌預(yù)后的高危因素。該模型具有較高的敏感度和特異度，可能為喉癌的診療及預(yù)后評(píng)估提供新的切入點(diǎn)。