陳華

（江蘇省揚州市邗江區(qū)西湖鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇 揚州 225200）

1 樣品運輸與保存

1.1 樣品運輸 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）的樣品一般為全血或血清。運輸溫度偏高、運輸時間過長的血樣會導致ELISA 靈敏度偏低，因此夏季血樣應低溫運輸。

1.2 樣品保存 如48h內(nèi)能完成檢測，血樣只需2～8 ℃冷藏即可，如48 h 內(nèi)無法完成檢測，血樣應于-20 ℃保存，長期保存血清可在-80 ℃，全血樣品不適合凍存。血液樣品含水量較大，冷凍固定時會對血樣結(jié)構(gòu)造成破壞，故超低溫快速冷凍固定多適用于組織而非血樣。

2 樣品稀釋

ELISA 一般要求對血樣進稀釋，不按要求稀釋會出現(xiàn)非特異性反應，即假陽性。取出血樣后，若發(fā)現(xiàn)膠凍樣樣品和溶血樣品，應盡量棄去。研究表明重度溶血樣品可能導致ELISA 出現(xiàn)假陽性。

稀釋過程中影響實驗結(jié)果的有兩項：一是實驗器材，微量移液器的精準度和吸頭的質(zhì)量會對實驗結(jié)果造成較大影響，劣質(zhì)的吸頭會導致更多的樣品掛壁殘留，造成稀釋倍數(shù)不準確；二是稀釋方法，稀釋樣品應當混勻，稀釋時應當避免取樣過少，一般用10 μL稀釋比用1 μL稀釋更準確，更能避免樣品掛壁影響。如果稀釋倍數(shù)過大，可采用梯度稀釋的方法稀釋，如稀釋40 倍，可以先進行4 倍稀釋，再進行10 倍稀釋，以保證稀釋的精確度。

3 試劑盒平衡

實驗前將試劑盒從2～8 ℃冷藏室取出置室溫下，使試劑盒及板條恢復至室溫（一般要求為20～25 ℃），平衡時間至少20 min。冬季室溫偏低，平衡耗時加長，可將試劑盒置于暖風下或37 ℃溫箱內(nèi)。未平衡狀態(tài)下進行實驗會導致孵育不充分，影響樣品與包被物的特異性反應。

4 加樣方法

ELISA易出現(xiàn)污染的步驟就是加樣。加樣必須使用一次性的潔凈吸頭，每吸取一個樣品都須更換吸頭。

加樣時應避免沿管壁加樣，以免造成非特異性吸附，影響加樣準確性；應當避免加樣過快，以免造成液體濺出，出現(xiàn)交叉污染；應當避免產(chǎn)生氣泡，特別是讀取吸光值時，氣泡會對最終結(jié)果產(chǎn)生影響。

正確的加樣方法是勻速輕緩地將樣品加于酶標板孔底，且加樣時間不宜過長，否則會導致第一孔與最后一孔反應時間差異過大，影響實驗結(jié)果。如果樣品數(shù)量過多，加樣時間過長，可使用排槍。

5 孵育方法

孵育是液相的抗原或抗體和酶標板反應孔內(nèi)固相的抗原或抗體發(fā)生特異性反應的過程，這一步驟要求一定的反應溫度和反應時間。常見的孵育溫度為37 ℃和室溫，一些ELISA 要求43 ℃、2～8 ℃和其他溫度。如果孵育溫度為37 ℃，則可使用溫箱孵育，注意孵育前使溫箱溫度達到37 ℃，因為孵育所需時間與孵育溫度成反比，所以未達到要求溫度進行孵育會使抗原抗體反應不充分。

除此之外，孵育被證明會受到“邊緣效應”的影響。用相同的樣品在96孔板進行ELISA測定，會出現(xiàn)外周孔和中心孔吸光值不同的現(xiàn)象。這是由于酶標板材料——聚苯乙烯為不良導體，在從室溫加熱到37 ℃的過程中，外周孔和中心孔之間存在一定的熱力學梯度，從而使酶標板的溫度在剛放進溫箱時并不均一。因此孵育前可用水浴或其他方法均勻加熱，去除“邊緣效應”的影響。為防止反應液的蒸發(fā)和污染，孵育過程中酶標板須貼上板貼。

6 洗板方法

6.1 洗滌液配制 洗板是ELISA 必不可少的步驟。在孵育過程中，除發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合反應外，還會出現(xiàn)非特異性吸附，因此，必須通過洗板將非特異性吸附物質(zhì)洗去，避免實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

洗板一般需要稀釋洗滌液。稀釋前注意觀察濃縮洗滌液是否有結(jié)晶，如果有結(jié)晶則先讓結(jié)晶在室溫下全部溶解再進行稀釋。稀釋必須使用新鮮的蒸餾水，按說明書的稀釋倍數(shù)進行稀釋。

6.2 注意事項

6.2.1 加洗滌液時，沖擊力不可過大，且洗滌液盡量不要溢出孔外，一般每孔加300 μL即可。

6.2.2 加入洗液后，需要靜置1～3 min，以提高洗板的效率，避免非特異性物質(zhì)殘留。

6.2.3 兩次洗滌之間和加入酶標抗體之前，應避免包被孔干燥。酶結(jié)合物不耐干燥，且高溫下容易失活，包被孔干燥時間越長，最終得到的吸光值越低。

6.2.4 拍板時可在吸水紙下墊一層泡沫板，防止抗原抗體復合物脫離。拍板要垂直，避免交叉污染，每次拍板要盡量拍干。每次拍板后都要更換一次性吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙。吸水紙應選擇不易脫屑且吸水性強的。

6.2.5 洗板次數(shù)一般為3～5次，次數(shù)低于3次易出現(xiàn)假陽性，高于5次易出現(xiàn)假陰性。

6.2.6 為避免人工洗板造成的不確定性，可采用自動洗板機洗板，使用洗板機要檢查沖洗頭是否順暢。由于自動洗板機洗板后不能完全拍干，有較多液體殘留，故可適當增加洗板次數(shù)或采用機洗和人工洗板相結(jié)合的辦法減少誤差，即機洗后人工洗板1～2次。

7 底物添加

目前ELISA 廣泛使用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRP），其一般以鄰苯二胺（OPD）和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物。OPD 和TMB都有毒性和致突變性，操作過程中要注意防護。

加入底物前，要先檢查底物的有效性，如果以TMB 為底物，一般會提供A、B 兩瓶底物試劑，可各取少量相同體積的A、B 試劑于潔凈的反應孔或試管內(nèi)，觀察是否出現(xiàn)顯色反應，如果以OPD為底物，則應呈無色。在加入底物及之后的孵育過程中要注意避光，特別是OPD，這種底物在光照條件下會分解顯色，影響結(jié)果的準確性。平常保存底物也應注意避光。

8 顯色方法

顯色最重要的是時間的把握，應按照ELISA說明書上標明的底物反應時間操作，到時間后立即加入終止液，終止液的加入順序要和底物溶液的加入順序相同。加入終止液后可觀察到淡藍色溶液變?yōu)辄S色。

9 比色方法

加完終止液后立即進行比色，否則非特異性顯色會隨之增加。

比色可通過肉眼觀察顏色梯度，但要精確得出結(jié)果還應使用酶標儀。測量前酶標儀應預熱15～30 min，使光源穩(wěn)定。不同的ELISA 試劑盒要求不同的濾鏡，不同的波長。TMB底物的顯色波長為450 nm，OPD的顯色波長為492 nm。除使用單波長比色，也可使用雙波長比色減小誤差，即在敏感波長和非敏感波長各測一次，非敏感波長一般設為630 nm 或650 nm。由于實際測量的吸光值是溶液的吸光值、酶標板本身的吸光值及灰塵、指紋等污垢的吸光值之和，所以可用非敏感波長減少非樣本的影響。