黑天鵝嗜水氣單胞菌與腸致病性大腸埃希菌混合感染的診斷

單云芳 鐘震宇 李俊芳

(北京麋鹿生態(tài)實驗中心，北京，100076)

黑天鵝(Cygnusatratus)原產于澳大利亞，體態(tài)美麗、優(yōu)雅，深受喜愛，為世界著名觀賞珍禽，近年來作為觀賞禽類在國內廣泛養(yǎng)殖。黑天鵝抗病力強，成年天鵝不易發(fā)病，國內養(yǎng)殖黑天鵝疾病文獻極少[1-4]。本研究對北京麋鹿生態(tài)實驗中心的2只死亡黑天鵝進行分析診斷，確定死亡原因為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和腸致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)混合感染引起的菌血癥，現(xiàn)報道如下。

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

2016年2月5日，北京麋鹿生態(tài)實驗中心的散養(yǎng)黑天鵝中，2只雄性黑天鵝于其棲息水域中發(fā)生激烈爭斗，造成其頸部外傷。經望遠鏡觀察其傷口較小，出血量小，隨即凝集結痂。5 d后發(fā)現(xiàn)2只黑天鵝死于散養(yǎng)區(qū)域，經確認為之前發(fā)生爭斗的2只雄性黑天鵝。在死亡前的幾日內，未觀察到黑天鵝有明顯異常行為，散放區(qū)域內其他禽類亦無發(fā)病或死亡情況。

2 病理變化

經解剖觀察發(fā)現(xiàn)，死亡黑天鵝頸部羽毛少量掉落，皮膚有破損結痂，其他部位羽毛完整。頸部及背部見多處瘀傷。心臟外膜出血，有出血斑，心臟冠狀脂肪有出血斑，心臟內膜點狀出血。肝臟腫大，表面有大面積出血斑和黃色壞死灶。肌胃內見石子、草等食團。胰腺見出血點。十二指腸彌漫性出血。

3 實驗室檢查結果

3.1 細菌形態(tài)觀察

無菌采集死亡黑天鵝的肝臟、腎臟涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡下可見少量兩端鈍圓、革蘭氏陰性的短桿菌(Gram negative bacilli)，大小約0.8 μm×3 μm；無菌采集心臟血液涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡下可見革蘭氏陰性的球桿菌(Gram negative coccobacillus)，大小約0.5 μm×2 μm。

3.2 分離培養(yǎng)

分別無菌取肺臟、心臟血液、肝臟、腎臟、脾臟接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于需氧及厭氧條件下37℃培養(yǎng)24 h。結果心臟血液培養(yǎng)物長出表面光滑，灰白色圓形菌落，直徑1—2 mm，編號為1；肝臟培養(yǎng)物長出圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落，直徑2—3 mm，編號為2；厭氧條件下培養(yǎng)基均未長菌。

將1、2號菌落接種麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基。結果菌落1血瓊脂培養(yǎng)基長出圓形光滑有β溶血環(huán)的灰白色菌落，麥康凱培養(yǎng)基長出光滑濕潤半透明無色菌落，SS培養(yǎng)基未生長菌落；菌落2血瓊脂培養(yǎng)基長出圓形稍凸有β溶血環(huán)的灰白色菌落，麥康凱培養(yǎng)基長出不透明紅色菌落，SS培養(yǎng)基長出不透明粉紅色菌落。

3.3 生化鑒定結果

將1、2號菌落接種生化鑒定管，結果表明，1號菌落為嗜水氣單胞菌，2號菌落為大腸埃希菌。

表1 生化試驗結果Tab.1 Results of biochemical tests

續(xù)表1

3.4 血清學試驗

2號菌落腸道致病性大腸埃希菌診斷血清凝集試驗陽性，血清型O114∶K90。

3.5 水體檢測

無菌采集黑天鵝棲息水域的水樣2 L，檢測其中總大腸菌群和嗜水氣單胞菌。

3.5.1 多管發(fā)酵法檢測水中總大腸菌群

參考國家環(huán)境保護總局出版的《水和廢水監(jiān)測分析方法》中的監(jiān)測方法檢測水體中大腸菌群[5]。將采集的水樣做1∶10稀釋，于各裝有5 mL 3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管(內有倒管)中各加10 mL水樣，于各裝有10 mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管(內有倒管)中各加1 mL水樣，于各裝有10 mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管(內有倒管)中各加1 mL 1∶10稀釋的水樣，共計15管，3個稀釋度，于37℃培養(yǎng)24 h。將產酸產氣的培養(yǎng)物接種于美藍培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，結果長出深紫黑色具有金屬光澤和紫黑色不帶金屬光澤的菌落。將菌落接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中進行復發(fā)酵試驗，結果均產酸產氣，證實有大腸菌群存在。

3.5.2 致病性嗜水氣單胞菌檢測

參考國家標準《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法》(標準號：GB/T 18652—2002)檢測水樣中的嗜水氣單胞菌[6]。將水樣用孔徑為0.2 μm的硝酸纖維素微孔濾膜過濾。濾膜置于滅菌堿性蛋白胨水中，于28℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)物接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)24 h，結果長出光滑、微凸、圓整、淡黃色菌落，直徑1—2 mm。挑取菌落革蘭氏染色鏡檢，顯微鏡下可見革蘭氏陰性球桿菌，大小約0.5 μm×2 μm。將菌落接種于AHM鑒別培養(yǎng)基，結果培養(yǎng)基頂部為紫色，底部為淡黃色。同時進行氧化酶試驗、吲哚試驗、糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷)和脫脂奶培養(yǎng)基試驗，結果如下。

表2 大腸菌群檢測結果Tab.2 Monitoring result of coliform bacteria

表3 嗜水氣單胞菌鑒定結果Tab.3 Identification result of Aeromonas hydrophila

3.5.3 結果

水樣中存在嗜水氣單胞菌和大腸埃希菌，推斷為感染源。

4 分析與體會

4.1 防治措施

對黑天鵝棲息水域消毒，水體(以1 m水深計)可潑灑10%—20%生石灰溶液40—50 g/m2(也可使用漂白粉1.0—1.5 g/m2、氯異氰尿酸鈉消毒劑0.2—0.5 g/m2、二氧化氯消毒劑0.1—0.3 g/m2、適量雙鏈季銨鹽絡合碘消毒劑)，15—30 d/次，若能夠清塘后消毒，消毒劑用量可將酌情減少[7]。購買禽用嗜水氣單胞菌滅活疫苗進行定期免疫接種。為預防和控制感染，可選用慶大霉素、頭孢拉定、丁胺卡那霉素等敏感抗生素[8]，同時可給予維生素B、維生素C等輔助藥物。

腸道致病性大腸埃希菌O114∶K90可引起人食物中毒腹瀉[9-11]，需要對天鵝尸體、培養(yǎng)物、污染物統(tǒng)一無害化處理，對尸體污染和解剖臺等場地進行嚴格消毒，防止病原菌擴散。操作人員按照要求嚴格防護。

飼養(yǎng)管理水平是影響疫病發(fā)生的首要因素，需定期進行水質檢測，清塘換水和消毒，消滅感染源；患病或受傷的畜禽要及時治療，清創(chuàng)喂藥，隔離觀察，防止病情加重或死亡；提高飼養(yǎng)水平，重視畜禽的健康狀況，避免感染或體質降低而誘發(fā)其他疫病。

4.2 大腸埃希菌和嗜水氣單胞菌混合感染診斷的分析

大腸埃希菌寄居在動物的腸道，是腸道正常菌群，也是臨床常見病原菌，在特定條件下可引起動物體各部位感染，發(fā)生病變。解剖結果表明，動物體肝臟腫大，出血嚴重，表面有黃色壞死灶，與張恩強[12]、劉明生等[13]的報道一致，呈現(xiàn)長期慢性病理過程，因此推測動物體在傷口感染之前已發(fā)生大腸桿菌病，導致動物體持續(xù)精神沉郁，免疫力下降，在打斗中易受傷害。嗜水氣單胞菌屬弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽孢和莢膜，是一種條件致病菌，在自然界尤其水中廣泛分布。本研究從患病黑天鵝體內分離出一株嗜水氣單胞菌，該菌在瓊脂平板上形成圓形凸起、表面光滑、灰白色的菌落，與杜毅超等[14]的報道一致。另外，嗜水氣單胞菌是水產養(yǎng)殖中常見致病菌，可感染水生動物、水禽和人，引起動物腸內和腸外感染；主要表現(xiàn)為腹瀉和菌血癥。由嗜水氣單胞菌感染的疾病一般病勢較猛，多為惡性傳染病，病程短，死亡率高[15]。本研究中黑天鵝由于慢性感染，抗病力下降，皮膚傷口接觸被本菌污染的水而受染，產生急性病理過程。

麋鹿中心定期對動物活動區(qū)域進行清潔、消毒，但由于冬天水面結冰，為消毒工作帶來困難，僅留的活水面積減小，水禽活動范圍減小，集中排便污染水體易導致水體菌群結構發(fā)生變化，為各種病原菌的傳播創(chuàng)造條件。

綜合臨床癥狀、病理解剖和實驗室檢查結果可判斷，黑天鵝直接死亡原因為打斗后受傷，經傷口感染嗜水氣單胞菌，導致菌血癥死亡。