柚皮苷對高糖作用下MC3T3-E1細胞活力和Akt通路相關(guān)因子表達的影響

林春淑 舒曉春 肖菲娜 彭虹 容嬋 江健 胡潔華 孟曉軍

隨著社會的快速發(fā)展，人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變和社會人口的老齡化，糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年上升趨勢，成為影響人們健康的慢性疾病之一。研究表明，高糖對MC3T3-E1成骨細胞增殖有抑制作用[1]，誘導(dǎo)成骨細胞凋亡[2]，長期高血糖可使糖尿病患者骨細胞分化受影響，破壞骨代謝的動態(tài)平衡，導(dǎo)致骨形成減少。成骨細胞的活力降低是導(dǎo)致糖尿病性骨病的主要原因[3]。糖尿病性骨質(zhì)疏松患者容易發(fā)生骨折，已成為糖尿病患者生活質(zhì)量下降的主要原因之一。目前骨質(zhì)疏松的主要治療藥物有骨吸收抑制劑和骨形成促進劑兩類，如雌激素、二磷酸鹽等，但這些藥物治療的同時出現(xiàn)了一定的副作用。當(dāng)前以信號通路等研究為依據(jù)的各種骨生長因子制劑逐漸被開發(fā)，療效也較好，促進骨形成類藥物是未來骨質(zhì)疏松癥治療藥物的發(fā)展趨勢之一[4]。Akt 信號通路廣泛存在于動物細胞中，參與多種細胞增殖、分化和凋亡調(diào)節(jié)[5]。柚皮苷（naringin，NG）是一種雙氫黃酮類化合物，主要來源于蕓香科植物的果皮和果肉中，在降血脂、調(diào)節(jié)血糖等方面具有較強的生物活性[6]。唐琪等[7]研究表明NG 對成骨細胞增殖有一定的促進作用。還有研究發(fā)現(xiàn)NG 可提高大鼠的骨密度和促進骨形成的作用[8]。本研究觀察不同濃度NG 作用于高糖環(huán)境下的MC3T3-E1細胞活力的變化，并檢測成骨細胞相關(guān)分化因子的表達情況，為進一步應(yīng)用NG 治療糖尿病性骨質(zhì)疏松提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料

小鼠前成骨細胞株MC3T3-E1（南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院）；Naringin（美國TARGET Mol公司，cas：10326-47-2）；α-MEM培養(yǎng)基（廣州凱基生物公司，葡萄糖濃度為5.6 mmol/L）；胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8 試劑盒（沈陽萬類生物公司）、D-（+）-葡萄糖（美國Sigma公司）、胰蛋白酶溶液-EDTA 溶液（廣州凱基生物公司）、SYBR?Premix Ex Taq?（TliRNaseH Plus）[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]、蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），BCA 蛋白定量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

二、方法

1.MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)：MC3T3-E1細胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于5 %CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到90 %時，用0.25 %胰蛋白酶進行消化，再以300×g離心5 min 收集細胞，傳代培養(yǎng)。

2.實驗分組及處理：分為對照組（正常無血清培養(yǎng)基）、高糖組（含25 mmol/L 葡萄糖）、0.1 μmol/L+高糖組（0.1 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）、1 μmol/L+高糖組（1 μmol/L NG+25 mmol/L 葡萄糖）、10 μmol/L+高糖組（10 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）。以二甲基亞砜為溶劑配制濃度為10 mmol/L 的柚皮苷儲備液，后分別用培養(yǎng)基稀釋成10、1、0.1 μmol/L 3個藥物濃度組，不加藥物組在培養(yǎng)基中加入0.1 %的DMSO 溶劑。

3.CCK-8 法檢測細胞活力：取生長良好的MC3T3-E1細胞，以1×104個/孔的密度接種于96 孔板，恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，加入各實驗組的培養(yǎng)基干預(yù)12、24、48 h，向每孔加入100 μL CCK-8 溶液，溫箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm 處的吸光度值。

4.實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測NG對高糖作用下MC3T3-E1細胞胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、蛋白激酶（Akt1）、細胞成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2）的mRNA表達：將細胞1×105個/mL，以每孔2 mL細胞懸液接種于6 孔板，恒溫箱預(yù)培養(yǎng)24 h后，加入各實驗組無血清培養(yǎng)基分別干預(yù)24、48 h，提取各實驗組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，Real-time PCR分析采用SYBR?Premix Ex Taq?PCR試劑盒。引物序列如表1所示。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 34 s（收集熒光信號），共40個循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法進行分析。

表1 引物序列信息

5.Western blot 法檢測NG 對高糖作用下MC3T3-E1細胞IGF-1、Akt1 及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）蛋白表達的影響：取生長良好的細胞，以1×106個/ml 密度接種于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后加入各實驗組含藥培養(yǎng)基，干預(yù)24、48 h。用TBS 緩沖液沖洗細胞2～3次，加入200 μL 的細胞蛋白裂解液，冰浴30 min，確保細胞完全裂解，12 000×g離心15 min，收集上清液。用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液在100℃加熱10 min 進行蛋白變性，200 mA 轉(zhuǎn)膜60 min。將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5 %的脫脂牛奶（0.5 %TBST 緩沖液配），封閉1 h，稀釋一抗（TBST 溶解的5 %脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5 %牛血清白蛋白BSA），4℃過夜。用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，將二抗用TBST 稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min。用電化學(xué)發(fā)光（ECL）進行發(fā)光顯影，通過蛋白條帶灰度分析進行定量測定。各組MC3T3-E1細胞IGF- 1、Akt1、ALP 蛋白的表達，是在同一凝膠上上樣檢測。Akt（60 kDa）、IGF-1（22 kDa）和內(nèi)參（beta-actin 42 kDa）分子量相差較大，通過剪膜的方式分開孵育的；ALP（39 kDa）和內(nèi)參分子量接近，通過膜再生的方式重新孵育不同的抗體。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，相關(guān)基因與蛋白的相對表達量用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、NG 在高糖環(huán)境下增加了MC3T3-E1細胞的活力

CCK8 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖組細胞OD 值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；與高糖組比較，0.1 μmol/L+高糖組細胞OD 值在24、48 h 升高，1 μmol/L+高糖組和10 μmol/L+高糖組OD 值在12、24、48 h 均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。（表2）

二、NG 在高糖環(huán)境下上調(diào)了MC3T3-E1細胞Runx2、IGF-1、Akt1 的mRNA表達

與對照組比較，24 h 高糖組細胞Runx2、IGF-1、Akt1 的mRNA 的表達水平 降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；48 h 高糖組細胞Runx2、Akt1 的mRNA的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與高糖組比較，1 μmol/L+高糖組和10 μmol/L+高糖組細胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表達水平在24、48 h 均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與高糖組比較，0.1 μmol/L+高糖組在24 h 時Akt1 mRNA 的表達水平和48 h 時IGF- 1 mRNA 的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。（表3～4）

表2 NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1 的CCK-8 檢測結(jié)果（± s）

表2 NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1 的CCK-8 檢測結(jié)果（± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與0.1 μmol/L+高糖組比較，cP ＜ 0.05；與1 μmol/L+高糖組比較，dP ＜ 0.05

分組 實驗次數(shù) 12 h 24 h 48 h對照組 3 0.90±0.01 1.00±0.05 1.09±0.03高糖組 3 0.80±0.01a 0.84±0.01a 0.90±0.01a 0.1 μmol/L+高糖組 3 0.82±0.01a 0.93±0.05b 0.99±0.01 ab 1 μmol/L+高糖組 3 0.92±0.01bc 1.01±0.04bc 1.12±0.02bc 10 μmol/L+高糖組 3 1.01±0.32 abcd 1.16±0.03 abcd 1.20±0.02 abcd F 值 74.876 49.449 143.567 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

表3 干預(yù)24 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表達的影響（± s）

表3 干預(yù)24 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表達的影響（± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與0.1 μmol/L+高糖組比較，cP ＜ 0.05；與1 μmol/L+高糖組比較，dP ＜ 0.05

分組 實驗次數(shù) Runx2 IGF-1 Akt1對照組 3 1.00 1.00 1.00高糖組 3 0.34±0.02a 0.34±0.01a 0.15±0.02a 0.1 μmol/L+高糖組 3 0.50±0.15 ab 0.61±0.14 ab 0.21±0.02a 1 μmol/L+高糖組 3 0.62±0.09 ab 0.77±0.03 ab 0.24±0.08ab 10 μmol/L+高糖組 3 0.64±0.05 abc 1.02±0.07bcd 0.40±0.09abc F 值 24.016 47.571 48.036 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

表4 干預(yù)48 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表達的影響（± s）

表4 干預(yù)48 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞Runx2、IGF-1、Akt1 mRNA表達的影響（± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與0.1 μmol/L+高糖組比較，cP ＜ 0.05；與1 μmol/L+高糖組比較，dP ＜ 0.05

分組 實驗次數(shù) Runx2 IGF-1 Akt1對照組 3 1.00 1.00 1.00高糖組 3 0.72±0.03a 1.09±0.07a 0.38±0.04a 0.1 μmol/L+高糖組 3 0.76±0.03ab 1.14±0.20 0.63±0.36ab 1 μmol/L+高糖組 3 1.27±0.02abc 2.44±0.19abc 0.86±0.06abc 10 μmol/L+高糖組 3 1.37±0.02abcd 2.73±0.04 abc 1.43±0.03abcd F 值 559.110 126.311 318.142 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

三、NG 在高糖環(huán)境下上調(diào)了MC3T3-E1細胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白的表達

與對照組比較，高糖組MC3T3-E1細胞IGF-1、ALP、Akt1蛋白表達水平在48 h均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與高糖組比較，0.1 μmol/L+高糖組、1 μmol/L+高糖組和10 μmol/L+高糖組ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表達水平在48 h 均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，表5～6，圖1）。

圖1 免疫印跡檢測不同時間點各組MC3T3-E1細胞IGF-1、Akt1、ALP 蛋白的表達

表5 干預(yù)24 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表達的影響（± s）

表5 干預(yù)24 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表達的影響（± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與0.1 μmol/L+高糖組比較cP ＜ 0.05；與1 μmol/L+高糖組比較dP ＜ 0.05

分組 實驗次數(shù) ALP Akt 1 IGF-1對照組 3 1.00 1.00 1.00高糖組 3 0.53±0.03a 1.03±0.02 0.23±0.03a 0.1 μmol/L+高糖組 3 1.07±0.06b 1.03±0.08 0.24±0.04a 1 μmol/L+高糖組 3 1.92±0.02 abc 1.26±0.03abc 2.14±0.15abc 10 μmol/L+高糖組 3 2.36±0.38abc 1.05±0.05d 2.44±0.39abc F 值 57.217 18.252 91.925 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

表6 干預(yù)48 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表達的影響（± s）

表6 干預(yù)48 h后不同濃度NG 對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞ALP、Akt1、IGF-1 蛋白表達的影響（± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與0.1 μmol/L+高糖組比較cP ＜ 0.05；與1 μmol/L+高糖組比較dP ＜ 0.05

分組 實驗次數(shù) ALP Akt 1 IGF-1對照組 3 1.00 1.00 1.00高糖組 3 0.72±0.02a 0.89±0.03a 0.09±0.01a 0.1 μmol/L+高糖組 3 1.92±0.02 ab 1.50±0.03ab 1.75±0.01ab 1 μmol/L+高糖組 3 2.30±0.30abc 1.43±0.04ab 2.30±0.31abc 10 μmol/L+高糖組 3 3.09±0.10abcd 1.40±0.13ab 2.07±0.07ab F 值 144.575 61.914 124.093 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

討 論

骨質(zhì)疏松癥是常見的代謝性骨病，研究發(fā)現(xiàn)高糖明顯降低成骨細胞增殖和礦化結(jié)節(jié)明顯減少[9]，引發(fā)骨保護素減少、礦物質(zhì)量的降低[10]。糖尿病性骨質(zhì)疏松是糖尿病在骨骼系統(tǒng)的重要并發(fā)癥之一，患者骨組織微結(jié)構(gòu)改變，成骨細胞數(shù)量減少，骨強度降低、脆性增加，骨折發(fā)生風(fēng)險明顯增加[11]。

NG 具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化的能力[12]，可以促進成骨細胞增殖、分化[13]。容嬋等[14]研究表明NG 可以抑制地塞米松誘導(dǎo)的小鼠MC3T3-E1細胞凋亡。在鈦顆粒誘導(dǎo)的糖尿病小鼠顱骨骨溶解實驗中發(fā)現(xiàn)NG 有促進骨形成的作用[15]。MC3T3-E1細胞具有體外培養(yǎng)成骨細胞的多種生物學(xué)特性，是研究藥物對成骨細胞影響的有價值的體外細胞模型。丁佩惠等[16]研究發(fā)現(xiàn)高濃度NG（10、1、0.1 μmol/L）在干預(yù)12 h 和24 h后促進MC3T3-E1細胞增殖，且?guī)缀醪挥绊懠毎L。本研究中，以MC3T3-E1細胞為研究對象，將不同濃度NG 溶液（10、1、0.1 μmol/L）+25 mmol/L 葡萄糖混合培養(yǎng)液，分別干預(yù)12、24、48 h后，觀察到各個時間點高糖組均顯著抑制MC3T3-E1細胞增殖，加入不同濃度NG 干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)NG 在高糖環(huán)境下可促進MC3T3-E1細胞增殖，并呈一定的濃度依賴性，以10 μmol/LNG 組效果最顯著。

IGF-1 可增加成骨細胞數(shù)目和活性以促進骨形成[17]，是骨生成的刺激因子，青春期可增加成骨細胞數(shù)量，成年期可維持骨量[18]。孫凱等[19]選取220例糖尿病患者，分為合并骨質(zhì)疏松的觀察組和無骨質(zhì)疏松的對照組，對比發(fā)現(xiàn)觀察組的IGF-1 水平明顯低于對照組。鄧子陽等[20]研究發(fā)現(xiàn)IGF-1 可增加糖尿病大鼠脛骨鈣磷含量，其機制可能與IGF-1 促進骨骼重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2表達，提高骨堿性磷酸酶含量有關(guān)。因而，提高成骨細胞數(shù)量及IGF-1水平是預(yù)防和治療糖尿病性骨質(zhì)疏松的一個重要方向。

Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)控細胞存活和凋亡中起重要作用，Akt 激酶家族包括Akt1、Akt2 和Akt3 3個成員，與磷脂酰肌醇3 激酶（P13K）共同組成P13K/Akt 信號通路。PI3K/Akt信號通路是IGF-1 發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。江健[21]等研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以促進小鼠前成骨細胞的分化與礦化，其機制可能與其激活 PI3K/Akt 信號通路有關(guān)。丹參素通過活化 PI3K/Akt通路減少骨質(zhì)疏松大鼠成骨細胞的凋亡[22]。張立超等[23]通過實驗發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物可通過Akt通路促進大鼠成骨細胞增殖。Ulici 等[24]研究表明敲除Akt1 的小鼠骨骼變短，次級骨化中心的形成也相應(yīng)延遲。有實驗表明把能持久表達Akt1 的基因?qū)隡C3T3-E1細胞中，Runx2表達增強，而使表達Akt1 的基因沉默后，Runx2表達也隨之下降。Runx2 是骨形成最早的標(biāo)志基因，是成骨細胞開始分化的標(biāo)志，能夠激活骨鈣蛋白、骨橋素、骨涎蛋白和CO1I基因的轉(zhuǎn)錄和表達[25]，還可促進成骨細胞成熟和骨吸收[26]。Inada等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Runx2基因敲除的小鼠表現(xiàn)出軟骨細胞ALP 活性水平低，軟骨內(nèi)骨化被抑制。ALP 是骨形成的代謝指標(biāo)，是成骨細胞早期分化的標(biāo)記物，是骨折愈合和骨重建的重要生物標(biāo)志[28]。元建民等[29]的研究發(fā)現(xiàn)高糖顯著抑制了細胞的ALP 活性和分泌。朱聰?shù)萚30]的研究發(fā)現(xiàn)在成骨誘導(dǎo)14 d后，應(yīng)力刺激組種子細胞的ALP 和Ca 結(jié)節(jié)染色陽性率增強。李念虎等[31]用NG 對體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞進行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)NG 能明顯提高細胞堿性磷酸酶ALP、骨鈣素的表達，并應(yīng)用NG 對卵巢摘除誘發(fā)骨質(zhì)疏松的大鼠灌胃2個月后，發(fā)現(xiàn)其骨質(zhì)疏松得到有效逆轉(zhuǎn)。徐展望等[32]研究也發(fā)現(xiàn)NG 增強骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨強度，增大骨小梁面積，促進體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞中Runx-2 的表達。

Runx2 是成骨細胞的轉(zhuǎn)錄因子，對骨組織的形成和重建起到重要作用。然而，Runx2 能促進成骨細胞早期分化，但對骨細胞的成熟有一定的抑制作用，因此，其蛋白水平的表達在本研究中無法給我們最明確的信息；此外，Runx2 的功能多樣，不僅僅影響成骨，對破骨，軟骨也有影響，機制復(fù)雜，但其基因水平的表達情況為我們實驗有很好的提示作用。而ALP 是成骨細胞分化的直接指標(biāo)，能直接反應(yīng)前成骨細胞的分化狀態(tài)與活力。Akt1 是P13K/Akt通路的重要組成部分，張健博等[33]研究也發(fā)現(xiàn)通過靶向下調(diào)Akt1 抑制OA 軟骨細胞的增殖，促進細胞凋亡。綜合考慮，本研究主要檢測MC3T3-E1細胞Akt1、Runx2 和IGF-1 mRNA 和IGF-1、Akt1、ALP 蛋白的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，24 h 和48 h 高糖組顯著下調(diào)MC3T3-EI細胞Akt1、Runx2 的mRNA 的表達，24 h 下調(diào)了IGF-1 的mRNA 的表達，而不同濃度NG 組在干預(yù)24、48 h后，明顯上調(diào)了MC3T3-E1細胞IGF-1、Akt1、Runx2 mRNA 的表達水平，并呈濃度依賴性，以10 μmol/LNG 組效果最明顯。Western blot 法檢測發(fā)現(xiàn)，高糖組顯著下調(diào)MC3T3-E1細胞IGF-1、ALP、Akt1 蛋白的表達水平；而不同濃度NG 組明顯上調(diào)ALP、IGF-1、Akt1 蛋白的表達水平，同樣呈濃度依賴性。通過實驗說明高糖抑制了MC3T3-E1細胞IGF-1、Akt1、Runx2 mRNA 和IGF-1、Akt1、ALP 蛋白的表達水平，而NG 在高糖環(huán)境下則明顯改善高糖的抑制作用，促進MC3T3-E1細胞IGF-1、Akt1、Runx2 mRNA 和IGF- 1、Akt1、ALP 蛋白的表達。

綜上所述，NG 在高糖環(huán)境下具有促進前成骨細胞生長的潛能，其機制可能通過刺激IGF-1表達，激活A(yù)kt 信號通路及其下游因子Runx2，提高ALP 的表達，從而促進MC3T3-E1細胞的生長，促進骨形成，為臨床應(yīng)用NG 治療糖尿病性骨質(zhì)疏松提供了一定的實驗依據(jù)。