王佳豪 乜蘭春 趙文圣 葛暢 段雅倩

摘? ? 要：羊角脆甜瓜為青縣地理標(biāo)志性產(chǎn)品，但其果面常出現(xiàn)瘤狀凸起及綠色、黃色或黃綠色斑塊現(xiàn)象，影響果實(shí)外觀品質(zhì)。為了解其果皮組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及色素分布，利用徒手切片和石蠟切片技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段果實(shí)的果皮進(jìn)行了顯微觀察。結(jié)果表明，授粉至授粉后5 d外果皮細(xì)胞呈矩形且排列緊密，中果皮為排列無規(guī)則的圓形細(xì)胞，授粉5～15 d外果皮和中果皮細(xì)胞迅速增大，形狀和排列發(fā)生明顯改變，授粉15 d至果實(shí)成熟，外果皮和中果皮細(xì)胞形狀和排列不再發(fā)生明顯改變。瘤狀凸起果實(shí)自外表皮30層以下的細(xì)胞長(zhǎng)軸極顯著高于正常果實(shí)，且部分橢圓細(xì)胞長(zhǎng)軸走向變?yōu)榇怪庇诒砥で芯€，大量此類細(xì)胞在局部積聚造成果實(shí)表面異常瘤狀凸起。正常成熟果實(shí)自外果皮10層以下的薄壁細(xì)胞存在葉綠素，而10層以內(nèi)細(xì)胞無色素，果皮呈灰白色;果皮上的綠斑是因?yàn)橥夤?0層以內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)了葉綠素;黃斑則是因?yàn)橥夤ぜ?xì)胞間出現(xiàn)了黃色色素物質(zhì);兩種情況發(fā)生在同一區(qū)域時(shí)，果皮出現(xiàn)黃綠色斑塊。

關(guān)鍵詞：羊角脆甜瓜;果皮;色素分布;細(xì)胞形態(tài)

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）12-096-05

Abstract： Yangjiaocui melon is the leading melon variety cultivated in Qingxian County. The commodity quality of the fruit was often affected by the appearance of tumours like bulges， green， yellow or yellow-green colour spots on the surface of the fruit. To study the cell morphology and pigment distribution of fruit peel， freehand section and paraffin section techniques were performed at different developmental stages. The results showed that the exocarp cells were rectangular and closely arranged， while the mesocarp cells were rounded and irregularly arranged from 0 to 5 days after pollination. The exocarp and mesocarp cells grew rapidly and significantly changed shapes and arrangement during 5-15 days after pollination. From 15 days after pollination to fruit ripening， there were no significant changes in exocarp and mesocarp cells shapes and arrangement was observed. The long axis of cells in the tumour-like bulges fruit from the outer epidermis below 30 layers was significantly higher than that in the normal fruit， and the long axis of some cells became perpendicular to the epidermal tangents， a large number of such cells locally accumulated can cause the problem of tumor-like bulges. In mature fruits， chlorophyll usually existed in parenchymatous cells below 10 layers of exocarp， and there was no pigment within 10 layers’ cells. Therefore， the fruit peel was an off white colour. The green spots on fruit peel were due to the appearance of chlorophyll in the cells within 10 layers of the exocarp， and the yellow spots resulted from the presence of yellow pigment among intercellular space in exocarp cells. When both of two above mentioned cases occurred at the same area， the yellow-green patches appeared in fruit peel.

Key words： Yangjiaocui melons; Pericarp; Pigment distribution; Cell morphology

甜瓜在我國(guó)栽培歷史悠久，種植廣泛，截止到目前我國(guó)已連續(xù)30余年成為世界上甜瓜種植面積最大、產(chǎn)量和栽培品種最多的大國(guó)[1-2]，羊角脆屬薄皮甜瓜，青縣羊角脆為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品、河北省特色優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品，在河北滄州青縣已有千年以上的栽培歷史。目前，在青縣及周邊縣市種植面積近7000 hm2[3]。羊角脆甜瓜果實(shí)形似羊角，甜脆爽口，是夏季消暑的佳品，深受消費(fèi)者喜愛[4]。其成熟果實(shí)為灰白色，但實(shí)際生產(chǎn)中，果面常有綠色、黃色或黃綠色斑塊，還有一些果實(shí)果面出現(xiàn)瘤狀凸起，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀品質(zhì)，了解果皮細(xì)胞形態(tài)以及色素分布對(duì)解決以上問題具有重要意義。前人對(duì)厚皮甜瓜、西瓜果皮組織結(jié)構(gòu)做過一些研究，吳貝等[5]觀察京蜜11薄皮甜瓜授粉后0～5 d的幼果中果肉細(xì)胞變化，指出開花后3 d可能是其快速膨大的啟動(dòng)時(shí)期，授粉后5 d細(xì)胞明顯增大且排列緊密。梁世才等[6]在對(duì)厚皮甜瓜的研究中指出，M01-3厚皮甜瓜自授粉至果實(shí)軟化成熟的過程中經(jīng)歷了一個(gè)細(xì)胞迅速生長(zhǎng)分裂到生長(zhǎng)速度減慢的過程，果實(shí)成熟時(shí)外果皮細(xì)胞間填充大量的木質(zhì)素成分，中果皮細(xì)胞高度分散，細(xì)胞相互融合。高美玲等[7]通過觀察薄皮和厚皮西瓜外果皮的石蠟切片，總結(jié)出薄、厚皮西瓜外果皮細(xì)胞生長(zhǎng)方向分別為縱向生長(zhǎng)和橫向生長(zhǎng)，厚皮西瓜外果皮石細(xì)胞團(tuán)較大且細(xì)胞較大。羊角脆甜瓜在薄皮甜瓜中外觀顏色、形狀及口感均獨(dú)具特色，而其果皮發(fā)生的斑塊及瘤狀凸起嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)品質(zhì)，從而導(dǎo)致銷量的降低，果實(shí)宏觀表現(xiàn)與其微觀結(jié)構(gòu)密不可分，針對(duì)其果皮進(jìn)行的顯微觀察意義重大，而目前未見對(duì)羊角脆薄皮甜瓜細(xì)胞形態(tài)及色素分布的研究報(bào)道。筆者對(duì)羊角脆甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中果皮細(xì)胞形態(tài)和色素分布進(jìn)行了顯微觀察，以期了解羊角脆甜瓜果皮發(fā)育過程、瘤狀凸起及色斑成因，為改善果實(shí)外觀品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材為青縣蔬菜技術(shù)服務(wù)中心提供的地方品種青縣羊角脆。

1.2 方法

試驗(yàn)時(shí)間為2019年1—7月，其中育苗、種植及取樣部分在青縣司馬莊綠豪農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社日光溫室內(nèi)進(jìn)行。切片制作及顯微觀察部分在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝植物栽培生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。于2019年1月14日使用50孔穴盤育苗，2019年2月20日定植，總試驗(yàn)面積1000 m2，株距35 cm，行距90 cm，生長(zhǎng)期間吊蔓栽培，單蔓整枝，在主蔓12～15節(jié)留果。4月7日對(duì)盛花果實(shí)進(jìn)行授粉，授粉當(dāng)天第1次取樣，至5月7日（果實(shí)商品成熟）每5 d取樣1次，共7次，每次取發(fā)育正常果實(shí)10個(gè)，切取樣品近果臍1/3處外果皮及其以內(nèi)的0.5 cm中果皮制作石蠟切片，觀察自外果皮20層以內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)變化;商品成熟期取正常和果面瘤狀凸起的果實(shí)各10個(gè)，分別取正常部位和凸起部位果皮制作石蠟切片，觀察自外果皮以下30～60層細(xì)胞形態(tài)，測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)軸及短軸的長(zhǎng)度;取灰白色正常果實(shí)和分別帶有黃色、綠色、黃綠色斑塊的果實(shí)各10個(gè)，分別切對(duì)應(yīng)部位的單層外果皮（表面）、外果皮及其以內(nèi)0.5 cm中果皮（剖面），制作徒手切片，進(jìn)行果皮色素分布顯微觀察。

徒手切片制作與觀察：用雙面刀片切取灰白色、黃色、綠色的果實(shí)外表皮，立即置于載玻片上，滴少許蒸餾水，壓蓋玻片，排凈空氣，使用OLYMPUS CX41RF生物顯微鏡觀察。

石蠟切片制作與觀察：在近果臍1/3處使用雙面刀片橫切果實(shí)，取外表皮及其以內(nèi)的0.5 cm果皮，立即放入3.7%FAA固定液（V乙醇?V去離子水?V甲醛?V冰醋酸=10?7?2?1）中，真空泵抽真空20 min后置于梯度瓶中，60 r·min-1搖床上4 ℃固定過夜;依次使用50%、70%、85%、95%、100%乙醇脫水90 min，每個(gè)梯度加8滴2%曙紅染色（1 g曙紅粉末溶至50 mL乙醇），最后再次更換100%乙醇后不加染液4 ℃過夜;次日移至室溫，于60 r·min-1搖床上使用V乙醇?V脫蠟劑（Histoclear）為0?1、1?1、1?0（3次）依次滲透1 h，最后更換100% Histoclear，樣品上覆小塊石蠟，V石蠟?VHistoclear約1?4;次日將梯度瓶置于42 ℃恒溫箱，12 h后更換100%液態(tài)石蠟，置于60 ℃過夜;60 ℃環(huán)境下每隔24 h更換100%液態(tài)石蠟，連續(xù)更換4次，最后一次更換后5 h包埋，待蠟液完全凝固，置于4 ℃避光保存。使用組織切片刀將包含樣品的蠟塊切成梯狀體固定于組織包埋盒，SLEE CUT 4062-手動(dòng)旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)切7 μm薄片，37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)攤片30 min，42 ℃烤片機(jī)烤片12 h，Histoclear脫蠟3次，每次10 min，OLYMPUS IX73倒置顯微鏡觀察。

細(xì)胞截面長(zhǎng)軸及短軸測(cè)量：取瘤狀凸起果實(shí)和對(duì)照果實(shí)果皮縱切的石蠟切片各5片，拍照后在每片切片上隨機(jī)選取10個(gè)細(xì)胞，使用ToupView軟件測(cè)量其長(zhǎng)軸和短軸長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段果實(shí)的果皮結(jié)構(gòu)與細(xì)胞形態(tài)

由圖1-A～G可以看出，羊角脆果實(shí)授粉當(dāng)天和授粉后5、10、15、20、25、30 d（商品成熟）的果皮細(xì)胞形態(tài)。圖1-A中果實(shí)最外層細(xì)胞為外果皮，外果皮以內(nèi)為中果皮，中果皮又分為上中果皮和下中果皮，果實(shí)授粉當(dāng)天外果皮細(xì)胞排列緊密，形狀為矩形，細(xì)胞大小有差異，外果皮不平滑，上中果皮由4～6層等徑圓形細(xì)胞組成，下中果皮細(xì)胞體積較大，同樣為等徑圓形細(xì)胞組成。授粉后5 d（圖1-B）外果皮及中果皮細(xì)胞體積均有增大，細(xì)胞密度變小。至授粉后10 d（圖1-C）細(xì)胞繼續(xù)增大，外果皮細(xì)胞形狀更加規(guī)則，由此外果皮變得平展光滑，上中果皮細(xì)胞繼續(xù)增大，形狀開始向橢圓形轉(zhuǎn)變，下中果皮細(xì)胞排列緊密，形狀變?yōu)闄E圓形。至授粉后15 d（圖1-D），外果皮細(xì)胞在垂直于表皮切線方向有明顯增長(zhǎng)，排列規(guī)則且緊密，中果皮細(xì)胞全部為橢圓形。至授粉30 d（圖1-E～G），所觀察的外果皮及中果皮細(xì)胞不再發(fā)生明顯變化。另外，一部分羊角脆果實(shí)在發(fā)育中后期果皮會(huì)呈現(xiàn)瘤狀凸起狀態(tài)，造成果實(shí)表面凹凸不平，從而導(dǎo)致商品價(jià)值降低，圖1-H為商品成熟的瘤狀凸起果實(shí)果皮形態(tài)，在觀察視野下凸起部位果皮的細(xì)胞形態(tài)、大小及細(xì)胞排列與正常果實(shí)無明顯區(qū)別，而在若干層細(xì)胞下果皮細(xì)胞是否有差異還未可知。

2.2 瘤狀凸起果皮細(xì)胞形態(tài)

圖2為對(duì)照果實(shí)和瘤狀凸起果實(shí)凸起部位外果皮以下30～60層細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)（取樣部位為圓圈所示），對(duì)照果實(shí)（圖2-A）細(xì)胞多為圓形至橢圓形，橢圓形細(xì)胞長(zhǎng)軸方向多平行于表皮切線方向，其長(zhǎng)軸長(zhǎng)度均值為（71.90±14.16） μm，短軸長(zhǎng)度均值為（41.93±8.97） μm。瘤狀凸起果實(shí)凸起部位（圖2-B）的細(xì)胞多數(shù)呈橢圓形，并且長(zhǎng)軸方向多垂直于表皮切線方向，其長(zhǎng)軸長(zhǎng)度均值為（91.85±11.94） μm，極顯著高于正常果實(shí)，短軸長(zhǎng)度均值為（42.81±7.20） μm，與正常果實(shí)差異不顯著，大量長(zhǎng)軸垂直于表皮切線的細(xì)胞在局部積聚，導(dǎo)致果腔至外表皮距離增大，因此造成果皮瘤狀凸起現(xiàn)象。

2.3 不同顏色果皮的色素分布

灰白色（GW）果皮及黃色（Y）、綠色（G）、黃綠色（YG）斑塊果皮的色素分布情況見圖3，果皮取樣部位為圓圈所示。由圖3可以看出，甜瓜果皮由外到內(nèi)分別為外果皮細(xì)胞和若干層薄壁細(xì)胞，其中灰白色正常果實(shí)的外果皮不存在色素物質(zhì)，在約10層以下的薄壁細(xì)胞內(nèi)才有葉綠體（GW1～GW2）;黃斑果皮的外果皮細(xì)胞間隙存在黃色色素物質(zhì)（Y1～Y2）;綠斑果皮在外表皮細(xì)胞下10層以內(nèi)的薄壁細(xì)胞中含有葉綠體（G1～G2）;黃綠色斑塊果皮的外表皮細(xì)胞間隙存在黃色物質(zhì)，外表皮細(xì)胞下的10層薄壁細(xì)胞內(nèi)存在葉綠體（YG1～YG2）。

3 討論與結(jié)論

果實(shí)外觀表現(xiàn)與果肉細(xì)胞形狀、排列密不可分，有研究表明果皮厚度與果皮細(xì)胞層數(shù)和果皮射線方向細(xì)胞直徑有直接關(guān)系[8-9]，微觀結(jié)構(gòu)的變化可能由于基因突變、授粉不良和生長(zhǎng)環(huán)境所引起[10-12]。前人在對(duì)馬家柚粗果皮的研究中指出，粗果皮形成主要是由于表皮油胞體積變大且有凸起導(dǎo)致，而粗皮果果皮增厚由于果皮射線方向細(xì)胞直徑更大，細(xì)胞間隙大引起[13]。損傷對(duì)果皮結(jié)構(gòu)影響大，在對(duì)臍橙的研究中指出，輕微機(jī)械損傷后果皮經(jīng)一系列復(fù)雜過程最終導(dǎo)致臍橙油胞破裂，宏觀表現(xiàn)為果實(shí)表面有許多小坑，嚴(yán)重影響其外觀品質(zhì)[14]。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)羊角脆甜瓜時(shí)有發(fā)生瘤狀凸起的問題，而當(dāng)前針對(duì)該現(xiàn)象的研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)表明引起羊角脆果皮瘤狀凸起的原因主要是大量長(zhǎng)軸垂直于表皮切線的細(xì)胞在局部積聚，導(dǎo)致果腔至外果皮的距離增大，從而引起瘤狀凸起現(xiàn)象。本試驗(yàn)僅明確了瘤狀凸起果實(shí)的細(xì)胞形狀及排列，但該現(xiàn)象具體發(fā)生條件以及改善措施還需進(jìn)一步研究。

果實(shí)顏色是評(píng)價(jià)外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，而色素種類、分布及含量直接決定了果實(shí)顏色[15]。黎明等[16]指出在黃肉桃花后65 d，外果皮下第4～12層果肉細(xì)胞分布大量葉綠體，數(shù)量由外向內(nèi)逐漸減少，隨發(fā)育葉綠體數(shù)量下降、體積縮小，至果實(shí)成熟，葉綠體完全轉(zhuǎn)化為有色體。對(duì)于櫻桃番茄，在其果實(shí)綠熟期葉綠素含量極高，外觀表現(xiàn)為通體綠色，經(jīng)過轉(zhuǎn)色期到成熟期果實(shí)葉綠素逐漸降低至較低水平，而胡蘿卜素和番茄紅素逐漸增加，到果實(shí)成熟番茄紅素占據(jù)總色素含量的90%以上，此時(shí)果實(shí)表現(xiàn)通體紅色[17]。Huang等[18]在對(duì)砂梨的研究中指出，果實(shí)遮光對(duì)果皮花青素含量有顯著影響，完全暴露于陽(yáng)光下2～3周的果實(shí)可合成大量花青素，這表明光照對(duì)花青素的合成至關(guān)重要。羊角脆甜瓜成熟果實(shí)果皮顏色獨(dú)特，為通體灰白色，目前關(guān)于羊角脆甜瓜果實(shí)顏色的研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)結(jié)果表明正常的羊角脆商品成熟果實(shí)中有色物質(zhì)為葉綠素，并且葉綠素出現(xiàn)在約10層以下的薄壁細(xì)胞內(nèi)，果實(shí)外觀顯現(xiàn)灰白色。另外，葉綠體出現(xiàn)在10層以內(nèi)的薄壁細(xì)胞中使外果皮顯現(xiàn)綠色斑塊;外表皮細(xì)胞間隙出現(xiàn)黃色色素物質(zhì)使外果皮顯現(xiàn)黃色斑塊;外表皮出現(xiàn)黃色色素物質(zhì)的同時(shí)外表皮下10層薄壁細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)葉綠體而使果皮顯現(xiàn)黃綠色斑塊。本試驗(yàn)初步闡明了羊角脆甜瓜的色素分布，但色素的發(fā)生條件以及控制顏色發(fā)生的技術(shù)措施還需進(jìn)一步研究。

羊角脆甜瓜外果皮由單層矩形細(xì)胞組成，緊密排列在果實(shí)最外層，細(xì)胞長(zhǎng)軸的走向垂直于表皮切線，中果皮細(xì)胞在發(fā)育過程中層數(shù)逐漸增多，形狀由圓形變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞的長(zhǎng)軸走向平行于表皮切線;果實(shí)自授粉0～15 d細(xì)胞增大迅速，15 d后至成熟細(xì)胞形狀和排列不再發(fā)生明顯改變;果實(shí)異常瘤狀凸起是由于外表皮30層以下的細(xì)胞長(zhǎng)軸增長(zhǎng)，且部分橢圓形細(xì)胞長(zhǎng)軸走向變?yōu)榇怪庇诒砥で芯€造成;羊角脆正常成熟果實(shí)自外果皮10層以下的薄壁細(xì)胞存在葉綠素，而10層以內(nèi)細(xì)胞無色素，果皮呈灰白色;果皮上的綠斑是因?yàn)橥夤?0層以內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)了葉綠素;黃斑則是因?yàn)橥夤ぜ?xì)胞間出現(xiàn)了黃色色素物質(zhì);兩種情況發(fā)生在同一區(qū)域時(shí)，果皮出現(xiàn)黃綠色斑塊。

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