物理傷害誘導(dǎo)白木香應(yīng)激反應(yīng)的生理特征

張鵬 徐諳為 楊光大 肖嘉杰 李小飛 徐大平 崔之益

摘 ?要：為了分析物理傷害誘導(dǎo)白木香應(yīng)激反應(yīng)特征，本研究以3年生普通白木香與易結(jié)香白木香品系為對象，采用機械打孔處理，分析其受傷害前后的激素含量、抗氧化性酶活性、酚類與萜類防御物質(zhì)以及萜類前體物質(zhì)乙酰輔酶A含量的變化特征，比較兩類白木香受物理傷害后的應(yīng)激反應(yīng)特征。結(jié)果表明：機械損傷后，普通白木香與易結(jié)香白木香茉莉酸、水楊酸、乙烯含量都顯著增加。除抗壞血酸氧化酶外，其他5種抗氧化性酶活性顯著增強。防御物質(zhì)總酚、總萜含量在普通白木香中分別增加了15.31%和9.04%，在易結(jié)香白木香中分別增加了24.63%和15.08%。乙酰輔酶A在兩類白木香中也顯著增加。其中，易結(jié)香白木香中茉莉酸、乙烯前體含量變化顯著高于普通白木香。且易結(jié)香白木香的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性變化分別是普通白木香的1.63、1.60、1.55倍。易結(jié)香白木香的總酚和總萜增量顯著大于普通白木香。易結(jié)香白木香中乙酰輔酶A的增量是普通白木香的1.74倍。綜上所述，白木香在受到機械損傷后應(yīng)激反應(yīng)物質(zhì)都得到了增加，并且多數(shù)指標(biāo)在易結(jié)香白木香品系中顯著高于普通白木香，表明在物理傷害誘導(dǎo)下易結(jié)香白木香應(yīng)激反應(yīng)強于普通白木香。茉莉酸、乙烯、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、總酚、總萜以及乙酰輔酶A等應(yīng)激反應(yīng)的特征物質(zhì)在兩類白木香中表現(xiàn)出顯著差異，可作為快速判斷易結(jié)香白木香品系的有效生理指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：白木香;機械損傷;防御類激素;抗氧化性酶;次生代謝產(chǎn)物;乙酰輔酶A

中圖分類號：S718.43 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Mechanical drilling treatment was implemented for three-year-old common Aquilaria sinensis and easily induced agarwood A. Sinensis to analyze the characteristics of stress response of A. sinensis induced by physical injury. The changes of hormone content， antioxidant enzyme activity， phenolic and terpenoid defense substances， and terpenoid precursor acetyl-CoA content were analyzed before and after mechanical injury. The stress response characteristics of two kinds of A. sinensis after physical injury were compared. The contents of jasmonic acid， salicylic acid and ethylene of common Aquilaria sinensis and easily induced agarwood A. sinensis increased significantly after mechanical damage. Except for ascorbate oxidase， the activities of the other five antioxidant enzymes enhanced significantly. The contents of total phenols and total terpenes were increased by 15.31% and 9.04% in common A. sinensis， and 24.63% and 15.08% in easily induced agarwood A. sinensis respectively. Acetyl-CoA also increased significantly in both kinds of A. sinensis. Among them， the increments of jasmonic acid and ethylene precursor contents were significantly higher in easily induced agarwood A. sinensis than those in common A. sinensis. The activity changes of superoxide dismutase， catalase and peroxidase of easily induced agarwood A. sinensis were 1.63， 1.60 and 1.55 times of common A. sinensis respectively. The increments of total phenols and terpenes of easily induced agarwood A. sinensis were significantly higher than that of common A. sinensis. The increment of acetyl-CoA in easily induced agarwood A. sinensis was 1.74 times higher than that in common A. sinensis. In conclusion， stress response substances of A. sinensis increased after mechanical injury， and most indexs of them were significantly higher in easily induced agarwood A. sinensis than those in common A. sinensis. It was suggested that the stress response of easily induced agarwood Aquilaria sinensis was stronger than common Aquilaria sinensis. Jasmonic acid， ethylene， superoxide dismutase， catalase， peroxidase， total phenols， total terpenes and acetyl-CoA were significantly different between the two kinds of Aquilaria sinensis， which could be used as effective physiological indexes for rapid identification of easily induced agarwood Aquilaria sinensis.

Keywords： Aquilaria sinensis; mechanical injury; defense hormones; antioxidant enzymes; secondary metabolites; acetyl-CoA

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.019

沉香是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria Lam.）植物在生長過程中受到刺激或傷害后，抗逆境脅迫產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物與木質(zhì)部組織混合形成的含有油脂成分的木材[1]。沉香是名貴的傳統(tǒng)中藥材[2]，也是一種天然的高級香料[3-4]，同時在世界五大宗教中備受推崇[5]。白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Spreng.]又稱土沉香、香樹、女兒香、牙香樹，為我國特有珍貴藥用植物、國家二級重點保護野生植物[1]。白木香受到外界脅迫后能產(chǎn)生沉香，是我國生產(chǎn)沉香的重要植物資源。由于沉香在藥用、香料、宗教、收藏等方面的廣泛用途，使其在國內(nèi)外的需求供不應(yīng)求[6-7]。培育沉香樹人工林與人工誘導(dǎo)結(jié)香是目前解決沉香緊缺的有效方法。

植物通過進化出復(fù)雜的防御機制來精確地感知和響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫[8]。物理、化學(xué)或生物因素被認(rèn)為都是沉香形成的誘因，它們作為激發(fā)子誘導(dǎo)沉香樹體防御反應(yīng)的發(fā)生[9]。外部刺激因子通過植物激素等信號分子激活早期防御反應(yīng)信號途徑，誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，使得抗氧化性酶活性增強，產(chǎn)生酚類與萜類等次生代謝防御物質(zhì)，觸發(fā)沉香物質(zhì)合成途徑，使沉香樹種的防御反應(yīng)形成，從而抵御外界傷害[10]。國內(nèi)外人工誘導(dǎo)結(jié)香的研究方法可以概括為物理、化學(xué)、生物三類誘導(dǎo)法。其中，物理傷害（砍傷法、斷干法、半斷干法、打釘法、鉆孔法、火烙法、剝皮法等）是誘導(dǎo)沉香形成的主要傳統(tǒng)方法，且物理傷害誘導(dǎo)白木香的應(yīng)激反應(yīng)對其無性繁殖過程產(chǎn)生重要影響，然而目前對沉香的研究主要集中在沉香組成成分分析[11-12]、沉香形成機理假說驗證[9， 13-14]、人工誘導(dǎo)結(jié)香方法[15-16]、沉香物質(zhì)合成代謝途徑以及信號調(diào)控機制等方面[17-18]。張興麗[19]研究了沉香形成過程的信號分子與酶的變化，王東光等[20]對于多種結(jié)香處理過程的抗氧化性酶以及總酚的差異進行研究，然而關(guān)于物理傷害誘導(dǎo)白木香應(yīng)激反應(yīng)的生理特征研究尚未見系統(tǒng)報道。近年來，人們從普通白木香中選擇出更易結(jié)香的白木香優(yōu)樹，并通過嫁接等無性繁殖方式保持其優(yōu)良結(jié)香性狀，從而獲得優(yōu)良的易結(jié)香品系，是白木香良種化的重要基礎(chǔ)。易結(jié)香品系是指具有結(jié)香早、結(jié)香快、產(chǎn)香量大、產(chǎn)香質(zhì)量高等優(yōu)良特性的白木香優(yōu)良品系。王軍等[1]申請了白木香新品種，并證實其所產(chǎn)沉香的質(zhì)量更優(yōu)，是一種易產(chǎn)香、產(chǎn)量高、質(zhì)量優(yōu)的種質(zhì)。如何快速選育更易結(jié)香，結(jié)香品質(zhì)更高的沉香品系已成為提高沉香生產(chǎn)的關(guān)鍵，同時也是下一代林木育種的必然要求。

本研究以普通白木香與白木香易結(jié)香品系作為研究材料，分析其機械損傷后的激素含量、抗氧化性酶活性、酚類與萜類防御物質(zhì)含量以及萜類合成前體物質(zhì)乙酰輔酶A含量的變化特征，研究物理傷害誘導(dǎo)白木香的應(yīng)激反應(yīng)特征，旨在為機械損傷誘導(dǎo)沉香形成的機理研究與無性繁殖生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時，以期篩選出可早期鑒定易結(jié)香品系的生理指標(biāo)，為挖掘白木香優(yōu)良種質(zhì)資源提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實驗于2020年11月在廣東省茂名市電白區(qū)森海沉香種植專業(yè)合作社進行，地理坐標(biāo)21°46′15′′ N，111°13′6′′ E。選取相同立地條件，無病蟲害，生長健壯，長勢一致的3年生普通白木香與白木香易結(jié)香品系‘糖結(jié)’各6棵。PB、YB分別表示普通白木香、易結(jié)香白木香;PCK、PW分別表示普通白木香處理前、處理后;YCK、YW分別表示易結(jié)香白木香處理前、處理后;PBV、YBV分別表示普通白木香處理前后變化、易結(jié)香白木香處理前后變化。兩類白木香的形態(tài)差異如圖1所示，可知‘糖結(jié)’葉緣波狀，且多數(shù)不對稱。白木香取樣情況見表1，每類白木香各6個生物學(xué)重復(fù)。普通白木香與白木香易結(jié)香品系的平均樹高分別為（4.67±0.43）m和（4.98±0.34）m;平均地徑分別為（6.18±0.64）cm和（6.45±0.45）cm。

在每棵普通白木香與易結(jié)香白木香的側(cè)枝健康完整部位，用直徑0.5 cm電鉆鉆頭各鉆20個圓孔，鉆穿枝條，相連2個鉆孔距離5 cm。前人文獻(xiàn)表明，在機械損傷后24 h，植株信號分子與損傷前有顯著差異[19]，因此，本研究在傷害處理后0、24 h將傷口附近1 cm處3 cm長的枝條取下，取樣后用錫箔紙包好，迅速放入液氮中直至冷凍徹底，運送回實驗室后，將液氮速凍樣品放置于–80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

每株樣品取鮮重莖干1 g作為單獨重復(fù)。加入5 mL 80%甲醇和1 mmol/L 2， 6-二叔丁基-4-甲基苯酚冷卻緩沖液研磨萃取，勻漿于4 ℃放置4 h，4000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，再與提取緩沖液混合，4000 r/min離心5 min，上清液用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）測定內(nèi)源激素茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸含量（ACC），抗氧化性酶過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸氧化酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性;次生代謝防御物質(zhì)總酚類（phenol）、總萜類（terpene）含量;萜類前體物質(zhì)乙酰輔酶A（acetyl-CoA）含量，且均以鮮重計。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2017軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖，采用SPSS 23.0軟件對處理前后普通白木香與易結(jié)香白木香之間進行單因素方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?激素變化特征

機械損傷后調(diào)控防御反應(yīng)的3種激素含量變化分析結(jié)果如圖2所示。在受到傷害脅迫后，普通白木香與易結(jié)香白木香3種激素含量均顯著增加。其中茉莉酸含量在普通白木香中增加了14.42%，易結(jié)香白木香中增加了24.62%，在2種白木香中均達(dá)到極顯著差異。水楊酸含量在普通白木香中增加了11.52%，在易結(jié)香白木香中增加了16.69%。乙烯前體物質(zhì)ACC含量在普通白木香中增加了19.87%，在易結(jié)香白木香中增加了38.23%。

比較普通白木香與易結(jié)香白木香二者之間在機械損傷后3種激素含量的前后變化發(fā)現(xiàn)（圖3），易結(jié)香白木香中茉莉酸、乙烯前體含量變化顯著高于普通白木香，分別達(dá)到普通白木香的1.69、2.03倍，而水楊酸的含量變化在二者之間沒有顯著差異。

2.2 ?抗氧化酶活性變化特征

在機械損傷前后防御反應(yīng)的6種抗氧化酶活性變化分析結(jié)果如圖4所示。除抗壞血酸氧化酶活性在普通白木香中損傷前后差異不顯著外，其他5種抗氧化性酶活性在普通白木香與易結(jié)香白木香中均顯著增加。其中機械損傷后，超氧化物歧化酶活性在普通白木香與易結(jié)香白木香中分別增加了11.63%、19.21%。過氧化氫酶活性分別增加了13.42%、19.36%。過氧化物酶活性分別增加了13.68%、17.86%。多酚氧化酶活性分別增加了14.03%、20.84%?？箟难嵫趸富钚苑謩e增加了6.82%、10.25%。谷胱甘肽還原酶活性分別增加了14.85%、15.59%。

由圖5可知，普通白木香與易結(jié)香白木香之間在機械損傷后6種抗氧化性酶活性的增量差異不同。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性增量在普通白木香與易結(jié)香白木香之間變化差異顯著，其中，易結(jié)香白木香的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性增量分別是普通白木香的1.63、1.60、1.55倍。而多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、谷胱甘肽還原酶在普通白木香與易結(jié)香白木香之間的增量無顯著差異。

2.3 ?次生代謝防御物質(zhì)變化特征

機械損傷后起防御作用的次生代謝產(chǎn)物總酚和總萜含量變化分析結(jié)果由圖6所示。在受到傷害脅迫后，普通白木香與易結(jié)香白木香總酚和總萜含量均極顯著增加。其中總酚含量在普通白木香與易結(jié)香白木香中分別增加了66.66和106.00 ng/g?？傒坪吭谄胀ò啄鞠闩c易結(jié)香白木香中分別增加了69.92和106.72 ng/g。

由普通白木香與易結(jié)香白木香總酚和總萜含量變化比較（圖7）可知，防御物質(zhì)總酚和總萜在機械損傷處理后，易結(jié)香白木香的增量較普通白木香更多，2種白木香之間差異顯著。其中，總酚的含量易結(jié)香白木香較普通白木香多增加了59.03%，總萜含量增加了52.64%。

2.4 ?沉香萜類前體物質(zhì)含量變化特征

由圖8可知，沉香萜類前體物質(zhì)于機械損傷后在普通白木香與易結(jié)香白木香中都有所增加。其中在普通白木香中增加了74.79 pmol/g，處理前后之間差異顯著。在易結(jié)香白木香中增加了129.95 pmol/g，處理前后之間達(dá)到了極顯著差異。

由普通白木香與易結(jié)香白木香沉香萜類前體物質(zhì)含量變化比較（圖9）可知，在機械損傷處理后，易結(jié)香白木香的增量較普通白木香更多，2種白木香之間差異顯著。其中，易結(jié)香白木香中乙酰輔酶A的增量是普通白木香的1.74倍。

3 ?討論

植物受到傷害時，植物細(xì)胞可以激活依賴于特殊基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的防御反應(yīng)[21]。早期防御反應(yīng)信號途徑的激活，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的末端產(chǎn)物激素等作為信號分子，激活植物體內(nèi)防御基因的表達(dá)，從而使植物表現(xiàn)出對生物脅迫的抗性反應(yīng)，包括抗氧化酶活性與代謝反應(yīng)的改變[22]。

植物的防御反應(yīng)依賴于各種信號通路的復(fù)雜相互作用，這些通路在錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中相互聯(lián)系。防御反應(yīng)中的植物激素（如茉莉酸、水楊酸、乙烯）被認(rèn)為是防御反應(yīng)的重要信號[23]。在本研究中，受到傷害脅迫后，普通白木香與易結(jié)香白木香3種激素含量均顯著增加。此結(jié)果與龍血樹[Dracaena cochinchinensis （Lour.） S. C. Chen]在受到機械損傷后的幾類激素的含量變化相似[24]。筆者前期也研究發(fā)現(xiàn)，乙烯等激素是介導(dǎo)降香黃檀（Dalbergia odorifera T. C. Chen）響應(yīng)機械損傷的重要信號物質(zhì)[25-26]，說明無論是普通白木香還是易結(jié)香的白木香品系在受到外界逆境刺激后，起信號傳遞的激素分子都開始行使誘導(dǎo)防御作用的功能。且在本研究中發(fā)現(xiàn)，易結(jié)香白木香中茉莉酸、乙烯前體含量變化顯著高于普通白木香，而水楊酸的含量變化在二者之間無顯著差異。表明易結(jié)香白木香品系誘導(dǎo)防御的速度強于普通白木香，其應(yīng)激反應(yīng)的程度也強于普通白木香。

在正常的生理條件下，植物的抗氧化防御系統(tǒng)可以平衡植物的生長[27]。植物在逆境條件下能夠產(chǎn)生活性氧[28]。植物酶抗氧化系統(tǒng)是抗氧化防御系統(tǒng)的組成部分?？寡趸赶狄约案鞣敲复俳M分之間在活性氧的清除中存在共同調(diào)節(jié)作用，植物體在受到逆境脅迫時，這些抗氧化酶的活性會發(fā)生相應(yīng)的變化，共同參與調(diào)控活性氧自由基代謝、細(xì)胞膜脂過氧化程度，保護植物免受環(huán)境脅迫的危害[29]。研究表明，機械損傷可以誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生大量過氧化氫等活性氧自由基[30]，在本研究中，機械損傷使得6種抗氧化性酶活性中有5種酶活性在普通白木香與易結(jié)香白木香中均顯著增強。同時易結(jié)香白木香超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性變化顯著高于普通白木香。研究表明，機械傷害后的楊樹[Populus si-monii var. przewalskii （Maxim.） H. L. Yang]與菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.）葉片中抗氧化酶活性明顯增強，從而引起系統(tǒng)防御反應(yīng)[31-32]。

植物次生代謝過程是植物對環(huán)境的一種適應(yīng)，是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，以往的研究表明，植物在受到動物啃食、病原菌侵染和其他物理傷害時能激活自身防御反應(yīng)，激活植物次生代謝反應(yīng)，從而合成積累一些特異性防御次生代謝產(chǎn)物，以增強自身的免疫力和抵抗力[33]。在受到傷害脅迫后，普通白木香與易結(jié)香白木香次生代謝產(chǎn)物總酚和總萜含量均極顯著增加，且2種白木香之間有顯著差異。張爭等[34]在白木香的研究中表明，萜類含量增多是植物啟動相應(yīng)的防御反應(yīng)和抵御傷害脅迫的重要機制。

乙酰輔酶A是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物，是萜類合成途徑的前體物質(zhì)[35]。沉香萜類前體物質(zhì)乙酰輔酶A于機械損傷后在普通白木香與易結(jié)香白木香中都顯著增加，且易結(jié)香白木香的增量較普通白木香更多。表明在損傷的白木香中，能量代謝增強，其防御物質(zhì)萜類的前體物質(zhì)也增多，為白木香的防御反應(yīng)啟動提供了有效的物質(zhì)儲備。同時，易結(jié)香中的乙酰輔酶A含量增加量更大，可能意味著其防御反應(yīng)會強于普通白木香。

綜上，白木香在受到機械損傷后其防御類激素，抗氧化性酶活性，防御物質(zhì)總酚和總萜含量以及萜類物質(zhì)的前體物質(zhì)乙酰輔酶A含量都顯著增加。該結(jié)果為機械損傷誘導(dǎo)沉香形成的機理研究與無性繁殖生產(chǎn)應(yīng)用的深入研究奠定基礎(chǔ)。并且多數(shù)應(yīng)激反應(yīng)物質(zhì)變化在易結(jié)香白木香品系中都顯著高于普通白木香，表明在物理傷害誘導(dǎo)下易結(jié)香白木香應(yīng)激反應(yīng)強于普通白木香，且茉莉酸、乙烯、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、總酚、總萜以及乙酰輔酶A等應(yīng)激反應(yīng)的特征物質(zhì)可作為快速判斷易結(jié)香白木香品系的生理指標(biāo)。這些研究結(jié)果具有重要的科學(xué)價值和應(yīng)用前景。后期研究可以增加易結(jié)香白木香品系種類及其樣本數(shù)量，進一步篩選可以早期鑒定白木香易結(jié)香品系的特征指標(biāo)。

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