涂娜娜 武華周 婁德釗 盧芙萍 耿濤 王樹昌

摘 ?要：通過比較青枯病抗、感桑品種根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性差異，分析根際真菌群落與桑樹青枯病抗性的相關(guān)性。采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，對青枯病抗性桑品種‘抗青283’ב抗青10’和易感桑品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’根際土壤真菌群落ITS1-ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增、測序，分析了2種桑品種根際真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性。（1）‘抗青283’ב抗青10’根際優(yōu)勢菌門主要為囊菌門（54.86%）、擔(dān)子菌門（24.67%）、接合菌門（3.17%），優(yōu)勢菌屬主要為淡紫擬青霉屬（5.71%）、鐮孢菌屬（5.43%）、旋孢腔菌屬（1.29%）;‘強(qiáng)桑1號(hào)’根際優(yōu)勢菌門主要為囊菌門（68.04%）、擔(dān)子菌門（15.12%）、接合菌門（1.90%），優(yōu)勢菌屬主要為腐質(zhì)霉屬（8.46%）、鐮孢菌屬（5.44%）、旋孢腔菌屬（2.22%）。（2）抗性品種根際土壤中起重要作用的真菌群落為：海殼科、小皮傘科、球囊霉目_f_uncultured，而易感品種根際土壤中起重要作用的真菌群落為：毛孢殼目、赤殼科、干朽菌科、Cantharellales-fam-incertae-sedis。（3）抗性品種根際檢測到淡紫擬青霉屬和叢枝菌根真菌球霉菌目均為廣泛應(yīng)用的生防菌，推測與其抗性有直接關(guān)系。雖然2種桑品種根際土壤優(yōu)勢真菌群落豐度無顯著差異，但抗性品種根際檢測到豐度更高的淡紫擬青霉屬和叢枝菌根球霉菌目，可能與其抗性有關(guān)。該研究結(jié)果為海南桑青枯病拮抗真菌的篩選與防控技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桑樹;根際土壤;真菌群落;多樣性;生物防治

中圖分類號(hào)：S154.3;S888.71 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The structure and diversity of fungi communities in mulberry rhizosphere soil were analyzed to indicate the correlation with resistance and susceptibility to bacterial wilt. The ITS1-ITS2 region of fungi were amplified and se-quenced to analyze the structure and diversity of fungi communities in resistant mulberry variety ‘Kangqing 283’ × ‘Kangqing 10’ and susceptible mulberry variety Qiangsang 1 by Illumina miseq high-throughput sequencing technology. The dominant phylum of ‘Kangqing 283’ × ‘Kangqing 10’ were Cystophyta （54.86%）， Basidiomycota （24.67%） and Zygomycota （3.17%）， while the dominant genus Paecilomyces （5.71%）， Fusarium （5.43%） and Cochilobolus （1.29%）. The dominant phylum in ‘Qiangsang 1’ were Cystophyta （68.04%）， Basidiomycota （15.12%） and Zygomycota （1.90%）， while the dominant genus Pythium （8.46%）， Fusarium （5.44%） and Cochilobolus （2.22%）. The most important fungi communities in the rhizosphere soil of resistant varieties were Conchochaetales， Crustaceaceae and uncultured families of Angiosporaceae， while Coniochaetales， Crustaceaceae， Serpulaceae and Cantharellales-fam-incertae-sedis in the sensitive varieties. Paecilomyces and arbuscular mycorrhizal fungi Coccidiales are widely used as the biocontrol fungi， which were found as the dominant fungi in the rhizosphere soil of resistant varieties and might be directly related to the resistance. Although there were no significant differences in the fungi communities abundance of the two mulberry varieties， the dominant fungi such as Penicillium and arbuscular mycorrhizal Angiocystidea detected in the resistant varieties were closely related with its resistance. The results yield insights to screen antagonistic fungi and effective control methods against mulberry bacterial wilt in Hainan province.

Keywords： mulberry; rhizosphere soil; fungi community; diversity; biological control

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.038

土壤為植物的生長提供必需的營養(yǎng)元素和水分，是植物健康生長生存的基礎(chǔ)，植物在生長過程中通過根系分泌物也向土壤中釋放各種有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)，對土壤微生物種群多樣性、數(shù)量和分布有很大的影響[1]。土壤微生物組成的多樣性和種群功能是衡量植物健康生長與否的重要指標(biāo)[2]，土壤微生物可通過與病原菌進(jìn)行競爭、拮抗等作用抑制病原菌的生長防止作物病害的發(fā)生，微生物群落結(jié)構(gòu)豐富度及多樣性越高，在對抗病原菌時(shí)發(fā)揮的作用就越明顯[3]。但是，土壤微生物也可通過積累大量的病原菌導(dǎo)致植株染病死亡[4]，許多土傳病害的發(fā)生與微生物有非常密切的關(guān)系。王茹華等[5]研究表明，植物對土傳病害表現(xiàn)出的抗性與根際真菌有密切關(guān)系;劉先良[6]、董朝霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)接種叢枝菌根真菌能提高植株對青枯病的抗性并能促進(jìn)植株生長;龔云麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌對青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）有抑制作用;張深[9]通過平板拮抗實(shí)驗(yàn)篩選出的15株對煙草青枯病有抑制作用的菌株中，分泌抗菌活性物質(zhì)最強(qiáng)的2株均為真菌菌株;董夏偉[10]用濾紙法從59株真菌中分離出2種對煙草青枯病菌有較好抑制作用的拮抗真菌煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和淺黃新薩托菌（Neosartorya aureola），抑菌圈直徑分別為10 mm和9.5 mm，經(jīng)過反復(fù)拮抗試驗(yàn)表明抑菌圈直徑無明顯差異;黎起秦等[11]篩選到5株經(jīng)鑒定對西瓜枯萎病、番茄青枯病有抑制活性的康氏木霉菌，且在人工接種條件下仍有防效。

桑青枯病是華南地區(qū)桑園的毀滅性土傳病害[12-13]，在海南連作桑園的發(fā)病率高達(dá)85%以上，嚴(yán)重影響蠶桑生產(chǎn)，造成巨大損失，已成為海南桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要制約因素，亟待研究解決熱區(qū)桑青枯病綠色高效防控技術(shù)。本研究以海南省瓊中縣主載桑樹抗性品種‘抗青283’ב抗青10’（QZ1K）和易感桑品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’（QZ1Q）為研究對象，從桑樹根際土壤微生態(tài)角度出發(fā)，通過高通量測序技術(shù)對抗、感桑樹根際土壤真菌群落多樣性及分布規(guī)律等進(jìn)行分析，旨在探究不同抗性桑樹品種根際土壤真菌的物種組成和差異，分析真菌群落多樣性與桑樹抗、感青枯病之間的關(guān)系，為今后海南省桑青枯病拮抗真菌的篩選與有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

2019年7月在瓊中紅毛鎮(zhèn)牙挽農(nóng)場采集桑樹土壤樣品，土質(zhì)為砂礫土。采樣點(diǎn)信息：19°00′10″ N，109°38′46″ E，海拔368 m，pH 5.93，有機(jī)質(zhì)0.4279 g/kg，土壤有機(jī)質(zhì)58.12 g/kg、電導(dǎo)率205 uS/cm、鹽分115 g/kg、總懸浮物（TSS）100 mg/L，全鉀865.34 g/kg，全磷19 496.83 g/kg。采用五點(diǎn)取樣法，隨機(jī)選取‘抗青283’ב抗青10’（QZ1K）和易感桑品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’（QZ1Q）各5株，挖取植株地下10～20 cm根系，抖落較大塊土壤后，用軟毛刷刷取根表面0～5 mm的土壤于樣品袋中，混合均勻后分裝進(jìn)4個(gè)5 mL凍存管中分別編號(hào)為QZ1K1～QZ1K4和QZ1Q1～ QZ1Q4，置于冰盒，–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?土壤根際樣品微生物DNA的提取 ?取充分混合后的土壤根際樣品0.5 g，采用QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HTkit（13）試劑盒按照說明書提取根際土壤DNA，之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1.2.2 ?基因擴(kuò)增與測序 ?TaKaRa公司的Takara Ex Taq高保真酶進(jìn)行PCR，利用ITS1-ITS2區(qū)域（引物ITS1F 5￠-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA A-3￠和ITS2 5￠-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3￠）進(jìn)行擴(kuò)增[6]。PCR擴(kuò)增體系：25 μL 2×Premix Taq（TakaraBiotechnology），引物各1 μL（10 mmol/L），DNA模板3 μL（20 ng/μL），加ddH2O溶解定容至50 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);延伸72 ℃ 10 min。采樣瓊脂糖電泳檢測，利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒精確定量回收產(chǎn)物并進(jìn)行測序。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic（Version 0.35）軟件首先把原始數(shù)據(jù)（raw data）質(zhì)量部分進(jìn)行剪切，拼接繼而得到整條的paried end序列。使用QIIME的split-libraries（version1.8.0）軟件得到clean tags序列。去除非特異性序列和嵌合體，得到valid tags序列。對質(zhì)控得到的質(zhì)量較高的序列valid tags使用vsearch（version 2.4.2）軟件按照97%的相似度進(jìn)行OTU（操作分類單元）分類，并選取每個(gè)OTU種豐度最大序列作為該OTU的代表序列，采用RDP classifier Native Bayesian分類算法對代表序列與數(shù)據(jù)進(jìn)行對比注釋，得到OTU的注釋信息。使用BioVenn在線軟件進(jìn)行Flower圖繪制;對2個(gè)樣本測序數(shù)據(jù)各取平均值后，使用Excel 2013和SPSS19.0軟件對相對豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制相對豐度柱狀圖;使用Qiime軟件觀測物種數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、PDwhole指數(shù)、Goods_coverage指數(shù)等多樣性指數(shù)，稀釋曲線圖用R軟件繪制。通過LDA對根際細(xì)菌群落進(jìn)行LEFSE分析（LDA Score2.5）尋找不同樣地桑樹根際土壤真菌群落差異。用FUNGuild軟件對測序得到的2個(gè)樣本的OTU進(jìn)行營養(yǎng)型類別分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?OTU聚類分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過優(yōu)化處理后共得到266 777條高質(zhì)量序列，單一樣本序列數(shù)在24 264～40 473條之間。在97%的相似度水平上對2種桑樹的OTU進(jìn)行聚類分析，得到2604個(gè)OTU，共分析鑒定出9個(gè)門、33個(gè)綱、96個(gè)目、184個(gè)科、319個(gè)屬、592個(gè)種。由圖1 QZ1K和QZ1Q根際土壤真菌群落OTU flower圖可知，QZ1K和QZ1Q根際土壤

真菌共有OTUs 107個(gè)，QZ1K根際土壤真菌特有OTUs分別為371、307、483、530個(gè)，分別占其總數(shù)的77.62%、74.15%、81.86%、83.2%;QZ1Q根際土壤真菌特有OTUs分別為382、550、342、455個(gè)，占其總數(shù)的78.12%、83.71%、76.17%、80.96%。

2.2 ?Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)和Observed-species指數(shù)反映樣本中物種的豐富度，其值越高代表群落物種越豐富。由圖2 Chao1指數(shù)和Observed-species指數(shù)稀釋曲線可知，真菌群落豐富度與測序的深度呈正相關(guān)，隨著測序深度的增加而增加，最后逐漸趨于平穩(wěn)，說明測序深度已覆蓋樣品中的所有物種，測序合理。對QZ1K和QZ1Q樣本的Alpha多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1），各樣本間除Good-coverage指數(shù)外其余各指數(shù)均無顯著差異。

2.3 ?不同品種根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 ?門水平根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析 ?由圖3可知，在門水平分類上，QZ1K和QZ1Q桑樹品種根際土壤中的真菌群落Others-Top30優(yōu)勢菌門為：子囊菌門（Ascomycota）分別為54.86%和68.04%，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）分別為24.67%和15.12%，接合菌門（Zygomycota）分別為3.17%和1.90%，球囊菌門（Glomeromycota）分別為2.92%和0.80%，壺菌門（Chytridiomycota）分別為1.12%和0.81%，其他類群分別為13.25%和13.30%。其中，根際土壤中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）相對豐度QZ1K高于QZ1Q。

2.3.2 ?綱水平根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析 ?由圖4可知，在綱水平分類上，QZ1K和QZ1Q桑樹品種根際土壤中的真菌群落組成Others-Top30優(yōu)勢菌綱為：糞殼菌綱（Sordariomycetes）分別為27.68%和38.49%，座囊菌綱（Dothideomycetes）分別為18.95%和21.93%，傘菌綱（Agaricomy?cetes）分別為22.04%和11.35%，銀耳綱（Tremello?mycetes）分別為2.28%和3.29%，Mortierello?mycotina分別為2.90%和1.63%，散囊菌綱（Eurotiomycetes）分別為2.30%和1.24%，球囊菌綱（Glomeromycetes）分別為2.43%和0.75%，其他類群分別為18.08%和18.70%。其中根際土壤中銀耳綱（Tremellomycetes）、Mortierellomycotina、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、球囊菌綱（Glomeromycetes）的相對豐度QZ1K高于QZ1Q。

2.3.3 ?屬水平根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析 ?由圖5可知，在屬水平分類上，QZ1K和QZ1Q桑樹品種根際土壤中真菌群落組成Others-Top30主要為：鐮孢菌屬（Fusarium）分別5.43%和5.84%，腐質(zhì)霉屬（Humicola）分別為0.46%和8.46%，淡紫擬青霉屬（Purpureocillium）分別為5.71%和0.01%，旋孢腔菌屬（Cochilobolus）分別為1.79%和2.22%，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）分別為1.72%和2.09%，Galerella分別為0.01%和3.21%，木霉屬（Trichoderma）分別為0.51%和1.39%，斜蓋傘屬（Clitopilus）分別為1.54%和0.32%，被孢霉屬（Mortierella）分別為0.78%和1.01%，漆斑菌屬（Myrothecium）分別為1.21%和0.36%，其他屬分別為76.92%和72.98%。其中，根際土壤中淡紫擬青霉屬（Purpureocillium）、斜蓋傘屬（Clitopilus）、被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度QZ1K高于QZ1Q。

2.4 ?桑樹根際土壤優(yōu)勢真菌差異分析

使用LEfSe分析抗性品種QZ1K和易感品種QZ1Q根際土壤中真菌群落的主要差異物種（LDA Score的預(yù)設(shè)值為2.5，小于2.5視為沒有差異）發(fā)現(xiàn)，抗性品種QZ1K根際土壤中小皮傘屬（Marasmius）、小皮傘科（Marasmiaceae）、海殼科（Halosphaeriaceae）、球囊霉目_f_uncultured、瓶霉屬（Phialophora）、球囊霉目_f_uncultured_g_ uncultured的相對豐度顯著高于易感品種QZ1Q，而赤殼科（Nectriaceae）、赤殼科_g_uncultured、Cantharellales-fam-incertae-sedis、Minimedusa、被孢霉科_g_uncultured、干朽菌科（Serpulaceae）、干腐菌屬（Serpula）、毛孢殼目（Coniochaetales）這幾類真菌群落在易感品種QZ1Q根際土壤中的相對豐度顯著高于抗性品種QZ1K（圖6A）?？剐云贩NQZ1K根際赤殼科LDA值最大，易感品種QZ1Q根際小皮傘屬LDA值最大，可見這2個(gè)真菌群落在抗性品種QZ1K和易感品種QZ1Q根際土壤中的差異最大?？剐云贩NQZ1K根際土壤中起重要作用的真菌群落為：海殼科、小皮傘科、球囊霉目_f_uncultured_，而易感品種QZ1Q根際土壤中起重要作用的真菌群落為：毛孢殼目（Coniochaetales）、赤殼科（Nectriaceae）、干朽菌科（Serpulaceae）、Cantharellales-fam-incertae- sedis（圖6B）。

2.5 ?真菌營養(yǎng)型分類

用FUNGuild軟件對抗性品種QZ1K和易感品種QZ1Q的OTU進(jìn)行營養(yǎng)型類別分析，主要?jiǎng)澐譃?類：病原營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型。其中Highly Probable（1個(gè)）和Probable（98個(gè)）為病原營養(yǎng)型真菌共有99個(gè)，屬于植物病原菌的有74個(gè)，屬于動(dòng)物病原菌的有8個(gè);Highly Probable（19個(gè)）和Probable（227個(gè)）為腐生營養(yǎng)型共246個(gè);Highly Probable（129個(gè)）和Probable（19個(gè)）為共生營養(yǎng)型共148個(gè)，屬于外生菌根真菌的有41個(gè)，屬于外生菌根真菌的有11個(gè)。進(jìn)一步分類得到22個(gè)Guild（圖7），抗性品種‘抗青283’ב抗青10’根際真菌病原營養(yǎng)型真菌數(shù)量相對較多，而易感品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’根際聚集了相對較多的腐生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型真菌。

3 ?討論

根際真菌作為根際微生物的主要成員，其多樣性、活性、相互間的復(fù)雜性對植物的生長和抗性起決定性作用[14-15]。因此，對根際真菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性分析在生產(chǎn)中具有重要意義。

本研究以海南省瓊中縣主栽桑樹抗性品種‘抗青283’ב抗青10’（QZ1K）和易感桑品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’（QZ1Q）為研究對象，對其根際土壤真菌群落多樣性研究發(fā)現(xiàn)根際真菌群落多樣性差異未達(dá)到顯著水平，這可能與相近植被和氣候以及土壤條件下，真菌群落的組成具有較高的相似性有關(guān)[16]。在門水平，子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門、球囊菌門和壺菌門等為2個(gè)樣本根際土壤真菌的優(yōu)勢菌門，分別占‘抗青283’ב抗青10’和‘強(qiáng)桑1號(hào)’根際真菌門整體的86.74%和86.67%，與王艷云等[17-20]的研究結(jié)果相似。在土壤根際真菌群落屬水平，優(yōu)勢菌屬主要分布在鐮孢菌屬、腐質(zhì)霉屬、淡紫擬青霉屬、旋孢腔菌屬、擬盤多毛孢屬等，但抗性和易感品種在各個(gè)屬豐度上存在不同，抗性品種‘抗青283’ב抗青10’根際真菌淡紫擬青霉屬、斜蓋傘屬、被孢霉屬的相對豐度均高于易感品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’。淡紫擬青霉是被廣泛應(yīng)用的一種生防菌，單獨(dú)或者結(jié)合藥劑使用都能增強(qiáng)植物的抗逆性[21-23]，張雅靜等[24]研究表明，淡紫擬青霉菌株對黃瓜根腐病和根結(jié)線蟲病的防效高于同類商品菌株，張菁等[25]研究表明淡紫擬青霉屬可誘導(dǎo)番茄植物防御酶活性的提高進(jìn)而抑制番茄霉灰病的發(fā)生。木霉能產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)及水解酶能對很多病原因子產(chǎn)生抑制作用，是目前研究較多、應(yīng)用廣泛的一種生防菌[26-28]，‘抗青283’ב抗青10’和易感桑品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’的根際土壤中均檢測到木霉菌，但抗性品種的木霉菌含量低于易感品種，具體原因?qū)⑦M(jìn)一步探索。

進(jìn)一步通過LDA Score進(jìn)行LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)抗、感青枯病桑樹品種的根際真菌群落的重要作用類群存在差異。海殼科、小皮傘科、球囊霉目_f_uncultured_是‘抗青283’ב抗青10’的重要真菌群落，研究表明球囊霉目屬于從枝菌根真菌[29]，叢枝菌根真菌對多種作物病害具有防控作用[30-32]，因此球囊菌目可能與桑樹對青枯病抗性有關(guān)。對于‘抗青283’ב抗青10’根際聚集的小皮傘科、海殼科、瓶霉屬是否與其抗性有關(guān)有待進(jìn)一步探索。

對抗、感品種土壤根際真菌群落進(jìn)行營養(yǎng)型分類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性品種‘抗青283’ב抗青10’根際真菌病原營養(yǎng)型真菌數(shù)量相對較多，而易感品種‘強(qiáng)桑1號(hào)’根際聚集了相對較多的腐生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型真菌，這與李朋發(fā)等[33]研究鐮刀根腐病發(fā)病與未發(fā)病植株根際真菌的營養(yǎng)型組成有所不同。周峰等[34-35]在研究植物病原菌效應(yīng)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，宿主植物的抗性基因產(chǎn)物若能與病原菌的無毒基因的效應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生不相容性，則植物不會(huì)發(fā)生病害，本研究中抗性品種‘抗青283’ב抗青10’基因產(chǎn)物與其根際病原菌是否存在這種互作關(guān)系，將是未來研究的方向之一。

本研究結(jié)果表明，2種抗桑青枯病桑樹根際土壤真菌群落優(yōu)勢菌群豐度和多樣性無顯著差異，抗性品種根際檢測到可能與其抗性有關(guān)的淡紫尼青霉屬和叢枝菌根球霉菌目。研究結(jié)果將為海南桑青枯病拮抗真菌的篩選與有效利用奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮