周丁丁，范元嬋，王杰，蔣海賓，祝智威，范小雪，陳華枝，杜宇，周紫彧，熊翠玲，鄭燕珍，付中民，陳大福，郭睿

福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350002

0 引言

【研究意義】蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis，簡(jiǎn)稱球囊菌）是一種專性侵染蜜蜂幼蟲(chóng)的真菌性病原[1]，對(duì)西方蜜蜂（Apis mellifera）幼蟲(chóng)、中華蜜蜂（Apis cerana cerana，簡(jiǎn)稱中蜂）雄蜂和工蜂幼蟲(chóng)以及成年熊蜂均具有侵染性[2-3]。球囊菌可導(dǎo)致蜜蜂幼蟲(chóng)罹患白堊病，能夠引起成年蜜蜂數(shù)量和蜂群生產(chǎn)力大幅下降[2-5]。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類(lèi)主要由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，不具備蛋白編碼能力，缺少完整開(kāi)放閱讀框（ORF）且長(zhǎng)度＞200 nt的轉(zhuǎn)錄本[6]，已被證明在真核生物的基因組印記和細(xì)胞周期等諸多生物學(xué)過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色[7-8]。然而，球囊菌的lncRNA研究十分滯后。本研究基于前期獲得的球囊菌菌絲和孢子混合樣品的高質(zhì)量lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)開(kāi)展相關(guān)生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)驗(yàn)證，對(duì)球囊菌lncRNA的順式（cis）作用、反義lncRNA（antisense lncRNA）作用和競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）作用進(jìn)行全面分析和深入探討。研究結(jié)果可豐富球囊菌的lncRNA信息，為其他真菌的lncRNA提供參考，并揭示lncRNA在球囊菌中的潛在調(diào)控功能。【前人研究進(jìn)展】LncRNA可通過(guò)順式作用調(diào)控同一染色體上鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)[9]；通過(guò)反式作用調(diào)控距離較遠(yuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄激活及表達(dá)[9-10]；含有微小 RNA反應(yīng)元件（microRNA response element，MRE）的lncRNA還能夠通過(guò)發(fā)揮 ceRNA作用吸附結(jié)合miRNA，從而間接調(diào)節(jié)下游靶mRNA的表達(dá)[11]；還能與特定蛋白質(zhì)結(jié)合形成核酸蛋白復(fù)合物，調(diào)控蛋白活性或改變蛋白在細(xì)胞中的定位，以及作為某些小RNA的前體分子[12-13]。VAN WERVEN等[14]研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的孢子形成過(guò)程中，lncRNAIRT1通過(guò)順式作用抑制轉(zhuǎn)錄因子Rme1與啟動(dòng)子IME1的結(jié)合，從而抑制IME1的表達(dá)；孢子形成過(guò)程中另一個(gè)lncRNAIME4-AS的表達(dá)能夠抑制IME4的表達(dá)。杜慶國(guó)[15]通過(guò)對(duì)正常磷水培和低磷水培2 d和8 d的地下和地上的玉米組織進(jìn)行鏈特異性建庫(kù)的RNA-seq測(cè)序，基于測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)出65 099個(gè)lncRNA，進(jìn)一步利用psRobot軟件預(yù)測(cè)6 787個(gè)差異表達(dá)lncRNA（differentially expressed lncRNA，DElncRNA）可靶向結(jié)合miR399，推測(cè)這些DElncRNA通過(guò)影響miR399的表達(dá)介導(dǎo)玉米的低磷脅迫響應(yīng)。SHAO等[16]通過(guò)對(duì)生理鹽水和嗎啡耐受兩組小鼠的比較分析，鑒定到 136個(gè) DElncRNA，進(jìn)而通過(guò)構(gòu)建和分析 DElncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)部分DElncRNA可作為潛在的ceRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而間接影響泛素化途徑、GRCP和TLR信號(hào)通路。真菌lncRNA的研究起步較晚且進(jìn)展緩慢，有限的 lncRNA研究主要集中于芽殖酵母（Schizosaccharomyces cerevisiae）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）等少數(shù)真菌物種[14,17-19]，昆蟲(chóng)病原真菌的lncRNA研究未見(jiàn)報(bào)道。球囊菌的基因組序列信息早在2006年就已公布[20]；但其完整的基因序列和功能注釋信息直到 2016年才正式公布[21]。因此，球囊菌的分子生物學(xué)及組學(xué)研究進(jìn)展緩慢。前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)組裝和注釋了球囊菌的參考轉(zhuǎn)錄組[22]；分析和探討了侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，簡(jiǎn)稱意蜂）幼蟲(chóng)和中蜂幼蟲(chóng)的球囊菌的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)和致病機(jī)理[23-24]；近期又利用PacBio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT）對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件下純培養(yǎng)的球囊菌進(jìn)行了測(cè)序，重新組裝和注釋了更高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，包含394 142條高可信度的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本以及11 623條參考基因組未注釋的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本[25]，可為參考基因組的完善、新基因的全長(zhǎng)克隆以及可變剪接和可變腺苷酸化的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者團(tuán)隊(duì)前期利用鏈特異性建庫(kù)的 lncRNA-seq技術(shù)分別對(duì)純化的球囊菌菌絲和孢子的混合樣品進(jìn)行了深度測(cè)序，對(duì)球囊菌lncRNA的數(shù)量、種類(lèi)和保守性進(jìn)行了分析，并全面比較了lncRNA和mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[26]。但上述lncRNA在球囊菌中的作用方式及潛在調(diào)控功能尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于已獲得的高質(zhì)量 lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)球囊菌 lncRNA的順式作用、反義lncRNA作用和ceRNA作用進(jìn)行深入細(xì)致的分析和探討，以期豐富球囊菌lncRNA的相關(guān)信息，并在組學(xué)水平揭示球囊菌lncRNA的潛在調(diào)控功能。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 生物材料

球囊菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離、培養(yǎng)和保存[22-24]。

1.2 LncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源

筆者團(tuán)隊(duì)前期已利用鏈特異性建庫(kù)的 lncRNA-seq技術(shù)對(duì)球囊菌菌絲和孢子混合樣品進(jìn)行測(cè)序，共獲得了70 612 299條原始讀段（raw reads），質(zhì)控后共獲得48 268 696條有效讀段（clean reads），平均Q30達(dá)到90.21%，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好[26]；利用軟件CNCI、CPC、Pfam和CAPT分別預(yù)測(cè)出578、1 848、1 460和 1 662條 lncRNA，四者的交集為 379條lncRNA，即高可信度的球囊菌lncRNA[26]。高質(zhì)量的lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)可用于本研究中l(wèi)ncRNA順式作用、反義lncRNA作用和ceRNA作用的生物信息學(xué)分析。原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject號(hào)：PRJNA395108。

1.3 sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源

筆者團(tuán)隊(duì)前期已利用small RNA-seq（sRNA-seq）技術(shù)對(duì)球囊菌菌絲和孢子的混合樣品進(jìn)行測(cè)序，獲得了70 612 299條raw reads，質(zhì)控后得到48 268 696條clean reads，平均Q30達(dá)到98.75%[27]。高質(zhì)量的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)為本研究中l(wèi)ncRNA與miRNA以及miRNA和mRNA靶向結(jié)合關(guān)系的預(yù)測(cè)提供數(shù)據(jù)支撐。原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject號(hào)：PRJNA560456。

1.4 LncRNA上下游基因的功能及通路注釋

LncRNA位于編碼蛋白基因上下游，可能與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可誘導(dǎo)元件等產(chǎn)生部分重疊，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)具有調(diào)控作用[8-9]。參照周丁丁等[28]的方法，將lncRNA上下游100 kb范圍內(nèi)的鄰近基因作為其調(diào)控的靶基因，利用Blast軟件（采用默認(rèn)參數(shù)）將lncRNA的上下游基因比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://geneontology.org/）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.kegg.jp/），獲得上下游基因的功能和通路注釋。

1.5 LncRNA序列互補(bǔ)的mRNA預(yù)測(cè)及分析

LncRNA序列可以與對(duì)應(yīng)的靶mRNA序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，在配對(duì)的過(guò)程中，可以攜帶某些作用因子到靶mRNA，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)編碼蛋白基因的表達(dá)[11]。參照周丁丁等[28]的方法，利用 LncTar軟件[29]對(duì)lncRNA的靶 mRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，基于 lncRNA和mRNA之間的互補(bǔ)序列，計(jì)算配對(duì)位點(diǎn)自由能和標(biāo)準(zhǔn)化自由能，標(biāo)準(zhǔn)化自由能閾值以下的則認(rèn)為是lncRNA的靶mRNA。利用Blast軟件（采用默認(rèn)參數(shù)）將lncRNA的互補(bǔ)序列基因比對(duì)到eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://eggnogdb.embl.de/）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相應(yīng)的蛋白功能注釋信息。

1.6 LncRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

參照郭睿等[30]的方法，利用Target Finder軟件[31]預(yù)測(cè)球囊菌lncRNA靶向結(jié)合的miRNA以及miRNA靶向結(jié)合的mRNA，利用三者之間的靶向結(jié)合關(guān)系構(gòu)建lncRNA-miRNA及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape v 3.7.1軟件[28,31]對(duì)上述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.7 LncRNA和mRNA的RT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)1.6中靶向預(yù)測(cè)的結(jié)果，隨機(jī)選取9個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA（MSTRG.6443.1、MSTRG.2135.1、MSTRG.2134.1、MSTRG.3422.1、MSTRG.2302.1、MSTRG.5023.1、MSTRG.5584.1、MSTRG.1870.1 和MSTRG.1614.1）和8個(gè)靶mRNA（gene2674、gene4126、gene4125、gene1602、gene5384、gene1986、gene989、和gene1970）進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)上述lncRNA和mRNA的核酸序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物（表 1）。選取actin（gene6001）作為 lncRNA和mRNA的內(nèi)參基因（陽(yáng)性對(duì)照）。將9對(duì)lncRNA（或8對(duì)mRNA）特異性上游引物（1 μL/種）和下游引物（1 μL/種）混合，以無(wú)菌水為模板進(jìn)行RT-PCR，作為陰性對(duì)照。利用RNA抽提試劑盒（TaKaRa公司，日本）分別提取球囊菌菌絲的總 RNA和孢子的總RNA，將1 μg菌絲RNA與1 μg孢子RNA等量混合，作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的 cDNA作為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA模板1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Mixture 10 μL，無(wú)菌水7 μL。PCR程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像儀（上海培清，中國(guó)）檢測(cè)。

1.8 MiRNA的Stem-loop RT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)1.6中靶向預(yù)測(cè)的結(jié)果，隨機(jī)選取7個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶miRNA（miR-281-y、miR-13-y、miR-11980-y、miR-6057-y、miR-1-z、miR-9-z 和miR-13-x）參照郭睿等[27]和杜宇等[32]的方法，利用DNAMAN軟件（Lynnon Biosoft 公司，美國(guó)）設(shè)計(jì)miRNA的Stem-loop引物、特異性上游引物和通用下游引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物（表1）。選取actin（gene6001）作為miRNA的內(nèi)參基因（陽(yáng)性對(duì)照）。將7對(duì)miRNA特異性上游引物（1 μL/種）和通用下游引物（1 μL/種）混合，以無(wú)菌水為模板進(jìn)行RT-PCR，作為陰性對(duì)照。利用RNA抽提試劑盒（TaKaRa公司，日本）分別提取球囊菌菌絲的總RNA和孢子的總RNA，將1 μg菌絲RNA與1 μg孢子RNA等量混合作為反轉(zhuǎn)錄的模板。利用Stem-loop引物反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR 體系（20 μL）：上下游引物（1.67 mol·L-1）各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，PCR mix 10 μL，無(wú)菌水 7 μL。PCR程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，梯度退火30 s，72℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像儀（上海培清，中國(guó)）檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 球囊菌lncRNA的順式作用分析

球囊菌的371個(gè)lncRNA共預(yù)測(cè)出5 852個(gè)上下游基因。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，這些上下游基因可注釋到48個(gè)功能條目，涉及生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分 3大類(lèi)；其中生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)的前 5個(gè)條目分別是細(xì)胞進(jìn)程（1 707）、代謝進(jìn)程（1 705）、單組織進(jìn)程（1 231）、定位（473）和生物學(xué)調(diào)控（325）；細(xì)胞組分相關(guān)的前5個(gè)條目分別是細(xì)胞（1 163）、細(xì)胞組件（1 163）、細(xì)胞器（795）、細(xì)胞膜（532）和大分子復(fù)合物（501）；分子功能相關(guān)的前5個(gè)條目分別是催化活性（1 796）、結(jié)合（1 388）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（180）、分子結(jié)構(gòu)活性（106）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)化因素（40）（圖1）。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示注釋到該條目的上下游基因數(shù)。

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，這些上下游基因可注釋到121條通路，注釋基因數(shù)最多的前10位分別為新陳代謝途徑（564）、次生代謝產(chǎn)物的生物合成（233）、抗生素的生物合成（176）、氨基酸的生物合成（89）、碳代謝（81）、核糖體（78）、嘌呤代謝（75）、剪接體（66）、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（65）和細(xì)胞周期-酵母（62）。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示注釋到該通路的上下游基因數(shù)。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2.2 球囊菌中反義lncRNA分析

共預(yù)測(cè)出球囊菌的7個(gè)lncRNA與7個(gè)mRNA序列互補(bǔ)，它們的結(jié)合關(guān)系如圖2所示。其中，有1個(gè)靶mRNA（gene3444）在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋為核孔復(fù)合體蛋白An-Nup120和假定蛋白（K14303），另有1個(gè)靶mRNA（gene1554）注釋為假定蛋白（K07117）；共有 5個(gè)靶基因（gene1316、gene1194、gene4650、gene5233和gene1554）在eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為假定蛋白（表2）。

2.3 球囊菌lncRNA的ceRNA作用分析

共預(yù)測(cè)出227個(gè)lncRNA靶向結(jié)合73個(gè)miRNA，二者之間形成較為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中MSTRG.2597.1、MSTRG.4497.1和MSTRG.1789.9靶向結(jié)合的miRNA數(shù)量較多，分別為7、7和6個(gè)；但多數(shù) lncRNA（79.02%）僅能結(jié)合 1—2個(gè) miRNA；部分 miRNA可靶向多個(gè) lncRNA，其中 miR-34-x、miR-10-x和miR-375-y結(jié)合的lncRNA數(shù)量最多，分別為31、27和24個(gè)（圖3）；但多數(shù)miRNA（80.82%）可靶向的lncRNA數(shù)少于10個(gè)。

表2 球囊菌中與lncRNA序列互補(bǔ)靶標(biāo)的功能注釋Table 2 Functional annotation of complementary targets with lncRNA sequence in A. apis

2.4 氧化磷酸化和MAPK信號(hào)通路相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)lncRNA與miRNA、miRNA與mRNA的靶向結(jié)合關(guān)系構(gòu)建 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)三者之間具有更為復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，227個(gè)lncRNA靶向73個(gè)miRNA，這些miRNA可結(jié)合50個(gè)靶mRNA。對(duì)上述靶mRNA進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，結(jié)果顯示它們共注釋到28條通路，注釋最多的通路是新陳代謝途徑（9），其次為次生代謝產(chǎn)物的生物合成（4）、自噬-其他真核生物（3）、線粒體自噬-酵母（3）和自噬-酵母（3）（表3）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有10個(gè)靶mRNA可注釋到9條物質(zhì)能量代謝通路，分別為谷胱甘肽代謝（2）、脂肪酸延長(zhǎng)（1）、不飽和脂肪酸的生物合成（1）、鞘脂類(lèi)代謝（1）、脂肪酸代謝（1）、碳代謝（1）、氧化磷酸化（1）、丙酸代謝（1）、糖酵解和糖質(zhì)生（1）。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字代表注釋在該通路的靶mRNA數(shù)。

根據(jù)靶mRNA對(duì)應(yīng)的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白注釋信息，篩選與氧化磷酸化通路和 MAPK信號(hào)通路相關(guān)的靶mRNA及與上述靶 mRNA存在靶向結(jié)合關(guān)系的miRNA及相應(yīng)lncRNA，分析發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化通路相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含222個(gè)lncRNA、78個(gè)靶miRNA和50個(gè)靶mRNA，其中MSTRG.2597.1、MSTRG.4497.1及MSTRG.1789.9結(jié)合的miRNA數(shù)最多，分別為7、7和6個(gè)（圖4-A）；MAPK信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含222個(gè)lncRNA、76個(gè)靶miRNA和46個(gè)靶mRNA，其中MSTRG.4497.1、MSTRG.2597.1及MSTRG.1789.9結(jié)合的miRNA數(shù)最多，分別為7、7和6個(gè)（圖4-B）；共有217個(gè)lncRNA和66個(gè)miRNA同時(shí)涉及上述兩條通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.5 球囊菌ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA、miRNA和mRNA的表達(dá)驗(yàn)證

為驗(yàn)證ceRNA網(wǎng)絡(luò)中 lncRNA、靶miRNA和靶mRNA的表達(dá)，通過(guò)RT-PCR對(duì)上述ceRNA網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA和靶mRNA的進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示9個(gè)lncRNA均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶，陽(yáng)性對(duì)照能擴(kuò)增出目的片段而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段；8個(gè)靶mRNA能擴(kuò)增出預(yù)期片段，陽(yáng)性對(duì)照能擴(kuò)增出目的片段而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段；上述結(jié)果證實(shí)了lncRNA和靶mRNA的真實(shí)表達(dá)。利用Stem-loop RT-PCR對(duì)7個(gè)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示它們均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段，陽(yáng)性對(duì)照能擴(kuò)增出目的片段而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段（圖5），證實(shí)了miRNA的真實(shí)表達(dá)。上述結(jié)果表明球囊菌中l(wèi)ncRNA、靶miRNA和靶mRNA真實(shí)表達(dá)。

表3 球囊菌ceRNA網(wǎng)絡(luò)中靶mRNA注釋數(shù)前12位的KEGG通路Table 3 Top 12 KEGG pathways annotated by target mRNAs involved in A. apis ceRNA networks

3 討論

球囊菌侵染蜜蜂幼蟲(chóng)導(dǎo)致白堊病，該病危害蜜蜂健康并長(zhǎng)期困擾養(yǎng)蜂生產(chǎn)。相對(duì)于酵母等模式真菌，球囊菌的分子生物學(xué)及組學(xué)研究較為滯后，miRNA和lncRNA等ncRNA的相關(guān)研究更為匱乏。目前，較多的研究表明 lncRNA在人類(lèi)、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和酵母（Saccharomyces）等模式生物中發(fā)揮特殊而重要的調(diào)控功能[8,10-14,33-35]。筆者團(tuán)隊(duì)前期已對(duì)球囊菌的miRNA進(jìn)行了全基因組鑒定、分析和驗(yàn)證[27]；并對(duì)侵染中華蜜蜂6日齡幼蟲(chóng)的球囊菌的miRNA差異表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了解析[36]。近期，為最大限度鑒定球囊菌的 lncRNA，筆者團(tuán)隊(duì)利用鏈特異性建庫(kù)的 lncRNA-seq技術(shù)對(duì)球囊菌菌絲和孢子混合樣品進(jìn)行了深度測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)lncRNA的數(shù)量、種類(lèi)、結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了初步分析，鑒定到379個(gè)lncRNA，包括242個(gè)反義lncRNA、123個(gè)基因間區(qū)lncRNA（lincRNA）、13個(gè)正義鏈 lncRNA（sense lncRNA）和 1個(gè)內(nèi)含子 lncRNA（intronic transcript lncRNA）[26]；并對(duì)部分lncRNA的真實(shí)表達(dá)進(jìn)行了分子驗(yàn)證[26]；此為球囊菌lncRNA的首次研究報(bào)道?；谝勋@得的高質(zhì)量lncRNA組學(xué)數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)一步探究球囊菌lncRNA的順式作用、反義lncRNA作用和ceRNA作用，發(fā)現(xiàn)lncRNA在球囊菌的物質(zhì)和能量代謝、遺傳信息傳遞、環(huán)境刺激應(yīng)答、信號(hào)通路、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程中具有潛在的調(diào)控功能。

3.1 LncRNA對(duì)球囊菌生長(zhǎng)發(fā)育以及物質(zhì)能量代謝具有潛在的順式調(diào)控作用

LncRNA發(fā)揮順式作用主要是通過(guò)影響同一染色體上的鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控功能[9]。CAI等[37]利用RNAi技術(shù)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)7周齡的興化雌雞各組織和器官進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)位于Six1基因上游432 bp處的lncRNA-Six1可編碼一個(gè)約7.26 kD的小肽，進(jìn)而通過(guò)順式作用影響Six1的表達(dá)以促進(jìn)雞肉細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞分裂。FENG等[38]利用lncRNA-seq技術(shù)對(duì)長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）的白色、黑色、金色和正常外殼進(jìn)行深度測(cè)序，預(yù)測(cè)出1 157個(gè)lncRNA及潛在調(diào)控的24 057個(gè)上下游基因，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示427個(gè)DElncRNA可靶向2 088個(gè)上下游基因，這些上下游基因涉及RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，以及ECM-受體相互作用、Jak-STAT信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路，作者推測(cè)相關(guān)DElncRNA通過(guò)順式作用調(diào)節(jié)牡蠣殼的色素沉淀。本研究中，371個(gè)lncRNA共預(yù)測(cè)出5 852個(gè)上下游基因，其中分別有1 705、64、31和61個(gè)上下游基因注釋到代謝進(jìn)程、發(fā)育進(jìn)程、生長(zhǎng)和繁殖。還發(fā)現(xiàn)分別有1 163、1 163和795個(gè)上下游基因注釋到細(xì)胞、細(xì)胞組件和細(xì)胞器，表明lncRNA可能通過(guò)順式作用調(diào)節(jié)球囊菌的細(xì)胞生命活動(dòng)。

碳代謝在真菌生長(zhǎng)和發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色，其中一碳代謝在機(jī)體代謝活動(dòng)發(fā)揮重要作用；而中心碳代謝是生物體所需能量的主要來(lái)源，并為其他代謝提供前體反應(yīng)物，糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑都屬于中心碳代謝[39]。WANG等[40]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)手段對(duì)野生型和突變型的谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）進(jìn)行深入分析，通過(guò)13C代謝通量分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子gntR1-E70K和ramA-A52V可促進(jìn)突變型谷氨酸棒桿菌的糖酵解和磷酸戊糖途徑相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子加快了谷氨酸棒桿菌的中心碳代謝。本研究中，分別有81、39和21個(gè)上下游基因注釋到碳代謝、糖酵解/糖異生途徑和磷酸戊糖途徑，表明相應(yīng)的 lncRNA可能通過(guò)順式作用調(diào)控球囊菌的一碳代謝和中心碳代謝。此外，分別有57、21和11個(gè)上下游基因注釋到氧化磷酸化、甲烷代謝和硫代謝等能量代謝途徑，說(shuō)明相應(yīng)的lncRNA可能通過(guò)順式作用調(diào)控上述能量代謝通路。

3.2 LncRNA對(duì)球囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與降解以及過(guò)氧化物酶體具有潛在的順式調(diào)控作用

生物體能夠以糖類(lèi)、氨基酸和核苷酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對(duì)于生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如苯丙素類(lèi)、萜類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物[41-42]。本研究中，分別有30、27、20、16、13、12和7個(gè)上下游基因涉及氨基糖和核苷糖代謝、纈氨酸和亮氨酸及異亮氨酸的降解、果糖和甘露糖代謝、煙酸和煙酰胺代謝、賴氨酸降解、鞘脂類(lèi)代謝和維生素B6代謝，表明相應(yīng)的lncRNA通過(guò)調(diào)控上述初級(jí)代謝產(chǎn)物的加工，合成必要的次級(jí)代謝產(chǎn)物供球囊菌的生長(zhǎng)和發(fā)育；此外，分別有233、15、7、4、1和1個(gè)lncRNA上下游基因涉及次級(jí)代謝物生物合成、萜類(lèi)化合物生物合成、泛醌和其他烯萜類(lèi)生物合成、酮體的合成與降解、碳青霉烯類(lèi)生物合成和倍半萜三萜類(lèi)生物合成，再次說(shuō)明相關(guān)lncRNA通過(guò)調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與降解參與對(duì)球囊菌生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)節(jié)。HUARTE-BONNET等[43]利用含烷烴培養(yǎng)基培養(yǎng)球孢白僵菌（Beauveria bassiana），發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體生物合成途徑相關(guān)的Bbhyd1和Bbhyd2兩個(gè)基因被激活，在過(guò)氧化物酶活性高的菌絲團(tuán)形成菌絲球過(guò)程中，球孢白僵菌表現(xiàn)出過(guò)氧化物酶體增多和表面明顯增厚的現(xiàn)象。本研究中，有32個(gè)上下游基因注釋到過(guò)氧化物酶體，說(shuō)明相關(guān)lncRNA（MSTRG.4299.3、MSTRG.6298.3和MSTRG.6220.4等）對(duì)該通路具有潛在的順式調(diào)控作用。

3.3 LncRNA對(duì)球囊菌的環(huán)境適應(yīng)及細(xì)胞生化反應(yīng)具有潛在的順式調(diào)控作用

應(yīng)激反應(yīng)是生物體對(duì)外界刺激的一種適應(yīng)性機(jī)制，真菌在面對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、溫度脅迫、物理化學(xué)因子刺激和機(jī)械損傷時(shí)可在一定環(huán)境壓力范圍內(nèi)通過(guò)自身應(yīng)激調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)和生存[44]。金屬伴侶蛋白是一類(lèi)胞內(nèi)可溶性金屬結(jié)合蛋白，可以將金屬離子準(zhǔn)確地交付給目標(biāo)蛋白，促使機(jī)體激活金屬酶，同時(shí)也保證細(xì)胞免受金屬危害[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，分別有1 796、247、106、19、3和3個(gè)上下游基因涉及催化活性、應(yīng)激反應(yīng)、結(jié)構(gòu)性分子活性、信號(hào)傳感器活性、分子傳感器活性和金屬伴侶蛋白活性，說(shuō)明相應(yīng)的lncRNA可能通過(guò)順式作用參與調(diào)控球囊菌的環(huán)境適應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)，以及保護(hù)細(xì)胞抵御外界不良因素的影響。

3.4 球囊菌反義lncRNA對(duì)核孔復(fù)合體蛋白的合成等生物學(xué)過(guò)程具有潛在調(diào)控作用

有些 lncRNA能夠與一些距離較遠(yuǎn)的基因序列互補(bǔ)配對(duì)，也可以攜帶某些調(diào)控因子到互補(bǔ)的靶mRNA上，通過(guò)影響基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控功能[9,28]。CHACKO等[46]基于Northern blot、單分子熒光原位雜交和RNA-seq等技術(shù)對(duì)新型隱球酵母（Cryptococcus neoformans）進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)lncRNARZE1影響新型隱球酵母的關(guān)鍵基因ZNF2的轉(zhuǎn)錄，RZE1可以調(diào)控新型隱球酵母菌絲的形成。本研究預(yù)測(cè)到 7個(gè)lncRNA（MSTRG.3576.1、MSTRG.2795.1、MSTRG.1238.1、MSTRG.5393.1、MSTRG.1387.1、MSTRG.1672.1和 MSTRG.3829.1）與7個(gè)靶 mRNA（gene1316、gene548、gene1194、gene3444、gene4650、gene5233和gene1554）之間存在序列互補(bǔ)；分析發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)靶mRNA對(duì)應(yīng)的蛋白在eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為假定蛋白（表 2），說(shuō)明球囊菌的基因注釋信息尚不完善，基因組質(zhì)量偏低和分子生物學(xué)研究滯后是主要原因。僅有g(shù)ene3444對(duì)應(yīng)的蛋白注釋為核孔復(fù)合體蛋白（表2），表明相應(yīng)的lncRNA（MSTRG.5393.1）通過(guò)與相應(yīng) mRNA序列互補(bǔ)調(diào)控球囊菌核孔復(fù)合體蛋白的合成，可能會(huì)影響核苷酸、酶和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)出細(xì)胞核，以及遺傳信息的傳遞。然而，本研究并未發(fā)現(xiàn)可以作為miRNA前體的lncRNA。鑒于本研究的組學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室條件下的球囊菌純培養(yǎng)，而lncRNA的表達(dá)具有細(xì)胞、組織、發(fā)育階段和脅迫時(shí)期特異性[47]，因此對(duì)于球囊菌 lncRNA是否能通過(guò)作為miRNA前體發(fā)揮更為廣泛而靈活的調(diào)控作用，仍需要進(jìn)一步研究。下一步將利用鏈特異性建庫(kù)的lncRNA-seq技術(shù)對(duì)球囊菌侵染的不同日齡蜜蜂幼蟲(chóng)腸道進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)連續(xù)比對(duì)核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)、宿主基因組和球囊菌基因組篩濾得到純凈的病原lncRNA數(shù)據(jù)，進(jìn)而開(kāi)展處于侵染過(guò)程的球囊菌的lncRNA調(diào)控作用研究。

3.5 球囊菌lncRNA對(duì)物質(zhì)能量代謝以及生長(zhǎng)發(fā)育具有潛在的ceRNA調(diào)控作用

ceRNA假說(shuō)認(rèn)為，具有 MRE的不同種類(lèi) RNA如lncRNA、circRNA和假基因等，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)[48]。目前，該假說(shuō)已被越來(lái)越多的研究證實(shí)。周丁丁等[28]研究發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)（Nosema ceranae）的lncRNA通過(guò)ceRNA作用調(diào)控孢子中的物質(zhì)和能量代謝等基本生命活動(dòng)。筆者團(tuán)隊(duì)前期系統(tǒng)分析和探討了意蜂工蜂中腸發(fā)育過(guò)程的lncRNA差異表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[30]、意蜂工蜂中腸響應(yīng)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)脅迫的lncRNA差異表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[49]，發(fā)現(xiàn)相關(guān)DElncRNA可能通過(guò)ceRNA作用參與意蜂工蜂中腸、意蜂幼蟲(chóng)腸道的發(fā)育及真菌病原脅迫應(yīng)答過(guò)程。氧化磷酸化是提供真菌生命活動(dòng)所需能量的基礎(chǔ)代謝途徑[50]。MAPK信號(hào)通路在酵母等真菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答和致病性等方面起到關(guān)鍵作用[51]。本研究中，球囊菌的 227個(gè)lncRNA與92個(gè)miRNA及96個(gè)mRNA之間形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，因此針對(duì)氧化磷酸化通路和MAPK信號(hào)通路相關(guān)的 lncRNA、靶 miRNA和靶mRNA構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析發(fā)現(xiàn) MSTRG.2597.1、MSTRG.4497.1和MSTRG.1789.9等球囊菌lncRNA靶向結(jié)合 miRNA數(shù)量較多；共有 217個(gè) lncRNA（MSTRG.1135.4、MSTRG.2904.2和 MSTRG.5757.1等）同時(shí)參與上述兩個(gè)通路的調(diào)控；表明相關(guān)的球囊菌lncRNA可能作為ceRNA間接調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶mRNA可注釋到碳代謝和脂肪酸代謝等18條物質(zhì)能量代謝通路，以及細(xì)胞周期和減數(shù)分裂。上述結(jié)果說(shuō)明相應(yīng)的球囊菌lncRNA可能通過(guò)ceRNA作用對(duì)物質(zhì)和能量代謝以及生殖進(jìn)行調(diào)控。本研究中，MSTRG.3576.1、MSTRG.1238.1和MSTRG.3829.1同時(shí)參與了順式作用、反義lncRNA作用和ceRNA作用，說(shuō)明這3個(gè)lncRNA作為多功能的調(diào)控因子，可通過(guò)多種方式對(duì)球囊菌的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行靈活調(diào)控。

4 結(jié)論

球囊菌的371個(gè)lncRNA通過(guò)順式作用潛在調(diào)控5 852個(gè)上下游基因的表達(dá)，227個(gè)lncRNA可通過(guò)92個(gè) miRNA間接調(diào)控 96個(gè)靶 mRNA的表達(dá)，部分lncRNA可能通過(guò)順式作用和ceRNA作用調(diào)節(jié)球囊菌的生長(zhǎng)發(fā)育及物質(zhì)能量代謝；球囊菌的7個(gè) lncRNA可作為反義RNA調(diào)控7個(gè)互補(bǔ)配對(duì)的mRNA的表達(dá)，MSTRG.5393.1潛在參與調(diào)控球囊菌的核孔復(fù)合體的蛋白合成。