常佳麗，張元勤，江 滔，馬旭光

(樂山師范學院 化學與資源環(huán)境學院，四川 樂山614000)

0 引言

亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, n-damo)是由一類特殊功能菌介導完成、在厭氧條件下耦合甲烷氧化與亞硝酸鹽還原的酶促反應過程[1-2]。Ettwig等通過厭氧富集培養(yǎng)和宏基因組學技術手段，在河流底泥中檢測到n-damo功能菌的存在，并命名為CandidatusMethylomirabilis oxyfera (M.oxyfera)[3-5]。該類菌在厭氧條件下，通過新型胞內(nèi)自產(chǎn)氧途徑氧化甲烷，并獲取生長代謝的能量[5]。甲烷單加氧酶是甲烷氧化代謝途徑的關鍵酶，編碼甲烷單加氧酶ɑ亞基的pmoA基因可作為鑒定n-damo細菌的遺傳分子標記[6]。

在污水厭氧生物處理領域，存在厭氧段溫室氣體甲烷無序排放、出水總氮不達標等問題，限制了厭氧技術在水處理領域的大規(guī)模推廣應用。N-damo過程可利用原位產(chǎn)生的甲烷進行脫氮，無需外源添加其他碳源，同時實現(xiàn)溫室氣體的減排和出水總氮的達標，是兼具環(huán)境友好型和經(jīng)濟節(jié)約型的新型脫氮工藝，具有潛在應用前景[7-8]。

近年來，越來越多研究證實n-damo功能菌在自然界中分布廣泛，河流底泥、濕地、河口沉積物、淹水稻田土、剩余污泥等生態(tài)系統(tǒng)中均不同程度檢測到n-damo細菌的存在[9-15]，但鮮有研究報道酸性環(huán)境中該類菌的賦存情況。此外，n-damo細菌生長代謝速率低、代時長，富集培養(yǎng)耗時久，限制了n-damo在實際污水處理中的推廣應用[16]。因此，從其他生境中尋找更多n-damo菌源進行富集培養(yǎng)馴化是未來該領域發(fā)展的重要方向之一，也是突破應用瓶頸的關鍵所在。

基于此，本研究重點關注酸性厭氧生境典型代表——發(fā)育自酸性紅壤的淹水稻田土，借助微生物分子生態(tài)學檢測手段，解析其中n-damo細菌的多樣性和豐度，以期為后續(xù)的富集培養(yǎng)研究提供菌源。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集及理化性質(zhì)的測定

本研究選取四川眉山(經(jīng)緯度：E 103°14′20″；N 45°51′58.87″)稻田土作為研究對象，采用五點隨機采樣法采集三塊不同點位的稻田土壤樣品(分別命名為MS-I，MS-II和MS-III)。采樣時間為2019年6月，正值水稻種植晚期，稻田為淹水狀態(tài)，自水土交界面向下延伸20 cm采集表層土樣。采集的土樣經(jīng)充分混勻后，無菌條件下，取0.5 g置于2 mL bead-beating離心管中，低溫運輸至實驗室，-80℃保存，用于后續(xù)分子生物學檢測。剩余土樣風干后，剔除植物殘體、石礫，研磨過篩，常溫保存，用于土壤理化性質(zhì)的測定。土壤有機質(zhì)和全氮含量采用國家標準檢測方法(GB9848-44和HJ-717-2014)進行測定，土壤分別用去離子水和1 mol/L KCl浸提后，采用酸度計(雷磁，PHS-25)測定pH值。

1.2 土樣核酸DNA的提取

采用土壤核酸提取試劑盒(MP FastDNASpin Kit for Soil)，參照試劑盒方法說明書，提取土壤樣品的核酸DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測土樣DNA的提取情況，采用超微量分光光度計(Biofuture，MD2000D)測定核酸濃度和純度。

1.3 基于n-damo細菌16S rRNA基因和pmoA基因的聚合酶鏈式反應和克隆測序

以1.2提取的DNA為模板，采用巢式聚合酶鏈式反應(nested-polymerase chain reaction, nested-PCR)擴增樣品中n-damo細菌的16S rRNA基因和pmoA基因，PCR擴增引物參見表1；采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化)純化目標基因的擴增產(chǎn)物；利用DNA T4連接酶將純化后的目標基因連接至pMD19-T質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌JM109的感受態(tài)細胞中，利用藍白斑篩選，得到含有目標基因的陽性克隆子；分別隨機挑選30個含有n-damo細菌16S rRNA基因和pmoA基因的陽性克隆子，送樣至上海生工測序平臺進行一代Sanger法測序。

續(xù)表

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測序結果上傳至NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，獲取相應參比序列，利用MEGA 5.0軟件，經(jīng)Neighbor-joining計算方法比對建樹后，明確待測菌株的遺傳學分類。

1.5 基于n-damo細菌16S rRNA基因和pmoA基因的定量PCR

以1.2提取的DNA為模板，采用定量PCR技術(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測樣品中n-damo細菌的豐度，qPCR檢測試劑為Power SYBR Green PCR Master Mix(Promega)，檢測儀器為實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)，qPCR引物詳見表1。

2 結果與討論

2.1 眉山稻田土理化性質(zhì)分析

本研究共采集3份土樣，去離子水浸提pH值均小于6.0，1 mol/L KCl浸提pH值均小于5.5，有機質(zhì)和總氮含量分別在20～30 g/kg和1.0～2.0 g/kg范圍內(nèi)波動(表2)。根據(jù)2015年洪雅縣土肥站的土壤養(yǎng)分調(diào)研報告[17]，本研究所涉及土樣均屬于微酸性中等養(yǎng)分水平土壤。已知n-damo細菌在中性環(huán)境分布廣泛[9-15]，但鮮有研究報道酸性環(huán)境中該類群的多樣性及豐度，故解析酸性土樣中n-damo菌的賦存情況，對開辟新的菌源意義重大。此外，尋找特殊生境條件下的n-damo細菌，有助于富集培養(yǎng)具有獨特生理代謝功能的微生物，例如嗜酸性的n-damo細菌，用于低pH污水的深度脫氮處理。

表2 土樣的基本理化性質(zhì)

2.2 N-damo細菌的定性檢測

根據(jù)文獻可知，巢式PCR第二段擴增反應的目標基因長度分別為460 bp(16S rRNA基因)和389 bp(pmoA基因)[4,6]。本研究成功擴增得到n-damo細菌特異性的16S rRNA基因和pmoA基因，如圖1所示，泳道1、3和5為核酸DNA Marker(100 bp ladder，自下而上依次為100 bp ～ 600 bp)，2和4分別對應n-damo細菌特異性pmoA基因和16S rRNA基因片段，擴增條帶清晰、亮度高、無非特異性擴增條帶、擴增長度與文獻報道相吻合，可進行后續(xù)克隆測序分析。

圖1 n-damo細菌16S rRNA和pmoA基因巢式PCR第二段擴增產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 酸性稻田土中n-damo細菌的多樣性

本研究分別對n-damo細菌特異性的16S rRNA基因和pmoA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分類鑒定，以便更客觀準確地反映n-damo細菌的多樣性賦存情況?；趎-damo 16S rRNA和pmoA基因序列相似度的聚類分析結果得出，樣品中的n-damo細菌分別聚為4和3個OTUs(Operational taxonomic units，可操作分類單元)，如圖2和圖3中的紅色圓圈所示。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究檢測到的n-damo細菌位于CandidatusMethylomirabilis oxyfera系統(tǒng)發(fā)育分支，絕大多數(shù)酸性稻田土中的n-damo細菌與其它中性生境中檢測到的n-damo細菌親緣關系較近。例如，圖2的OTU1與太湖底泥環(huán)境樣品克隆子TH4-27相似度達98%以上[12]，其余OTUs與西溪濕地、紅樹林濕地沉積物、黃河河口底泥、中性稻田土壤等環(huán)境樣品中的n-damo細菌均具有較高的相似度(圖2和圖3)[9-11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結果均指示，酸性稻田土中存在未知OTU(圖2的OTU4和圖3的OTU3)，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的序列均不匹配，推測本研究土樣中可能含有獨特的n-damo細菌。后續(xù)研究工作可增加樣本量，采集更多酸性環(huán)境土壤樣本，以驗證本研究的檢測結果。

圖2 基于n-damo細菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

基于n-damopmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹樹根為好氧甲烷氧化菌Methylomonas，從圖3可知，本研究擴增所得pmoA基因序列全部歸屬于CandidatusMethylomirabilis oxyfera系統(tǒng)發(fā)育分支，未見好氧甲烷氧化菌，證實了cmo182-cmo586這對引物的專一性，利用該引物對能夠靶向鑒定環(huán)境樣品中n-damo厭氧甲烷氧化菌的賦存情況[6]。

圖3 基于n-damo細菌pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 酸性稻田土中n-damo細菌的豐度

本研究采用針對n-damo細菌16S rRNA基因和pmoA基因的定量PCR，檢測酸性稻田土中n-damo細菌的豐度。研究共檢測了三塊樣田，MS-I、MS-II和MS-III樣田中n-damo 16S rRNA基因拷貝濃度分別可達1.25 × 108、2.31 × 108和1.34 × 108拷貝每克干重，pmoA基因拷貝濃度分別為8.66 × 106、2.54 × 107和1.55 × 107拷貝每克干重。其中，pmoA基因普遍比16S rRNA基因豐度低一個數(shù)量級，可能的原因在于n-damo細菌單個細胞中含有多個16S rRNA基因拷貝，但通常pmoA基因為單拷貝。對比其他研究發(fā)現(xiàn)，不同生境中的n-damo細菌16S rRNA基因豐度值波動較大，其中， 三峽江水水位波動帶最低，僅為4.70 ×102copies /g， 長江河口沉積物最高，可達9.77×107copies / g[18]。本研究16S rRNA基因拷貝濃度與長江河口沉積物生境的豐度相當，甚至更高，暗示酸性稻田土可能是n-damo功能菌的適宜生境。

圖4 基于n-damo細菌16S rRNA和pmoA基因的定量分析

3 結論與展望

本研究利用分子克隆和定量PCR技術對眉山稻田土壤中亞硝酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化細菌進行定性定量檢測，得出以下結論：

a)采集自眉山洪雅縣的稻田土樣為弱酸性中等養(yǎng)分水平土壤；

b)酸性稻田土中存在n-damo細菌，且含有潛在的嗜酸性n-damo功能菌；

c)酸性稻田土n-damo細菌豐度較高，與其它中性環(huán)境樣品n-damo細菌豐度相當。

結合本研究結果和該領域最新進展，對后續(xù)研究工作做出下列展望：

a)可針對嗜酸性n-damo功能菌的富集培養(yǎng)開展系列試驗；

b)除酸性稻田土，還可采集茶園土、酸性尾礦、酸性泥炭沼澤地等其它低pH生境樣品，擴大對酸性環(huán)境中n-damo細菌分布多樣性的認知；

c)針對多種酸性生境中n-damo細菌群落的分布模式、結構特征以及生理生態(tài)影響機制展開研究，篩選富集得到最優(yōu)功能菌；

d)采用先進的組學技術深度挖掘n-damo細菌的生理代謝功能，為實現(xiàn)其在實際廢水深度脫氮中的應用奠定基礎。