張洋洋，張偉國 ，徐建中，錢 和，馬雄承，朱幸煒

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 上海大陸釀造有限公司，上海 202150）

米酒是中國傳統(tǒng)釀造酒之一，以糯米為主要原料經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵而成[1]，因其風(fēng)味獨(dú)特、醇香誘人，具有養(yǎng)胃、活血通脈、防病御寒等保健功能，深受廣大消費(fèi)者喜愛[2]。米酒多為傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵[3]，該方法生產(chǎn)效率低，產(chǎn)品品質(zhì)難以控制；而液態(tài)發(fā)酵因其適用廣泛、節(jié)能、品質(zhì)易控等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛[4]。但液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)米酒存在酒體和風(fēng)味寡淡等問題[5]。目前國內(nèi)外對(duì)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)米酒研究多集中在工藝部分，劉幼強(qiáng)等通過分析原料米品種選擇、不同程度加工和打磨精度，粉碎后制備米粉，研究米酒釀造新工藝[6]；鄒凌波建立酶法釀造米酒新工藝[7]，但對(duì)米酒液態(tài)發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律研究較少。

試驗(yàn)在前期優(yōu)化米酒液態(tài)發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，采用GC-TOFMS 和游離氨基酸專用高效液相色譜動(dòng)態(tài)分析米酒液態(tài)發(fā)酵不同階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸，并測定基本理化指標(biāo)和感官品評(píng)，獲得米酒發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律。本研究對(duì)精確控制液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)米酒以及提高米酒質(zhì)量具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米（市售）；安琪高活性釀酒酵母、安琪白酒曲（安琪酵母股份有限公司）；耐高溫a-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶（諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）；樣品取自不同發(fā)酵階段：A-主發(fā)酵中期，發(fā)酵時(shí)間4.5 d，發(fā)酵溫度27 ℃；B-主發(fā)酵期結(jié)束，發(fā)酵時(shí)間9 d，發(fā)酵溫度27 ℃；C-后發(fā)酵中期，發(fā)酵時(shí)間2.5 d，發(fā)酵溫度15 ℃；D-后發(fā)酵期結(jié)束，發(fā)酵時(shí)間5 d，發(fā)酵溫度15 ℃；E-低溫靜置期，發(fā)酵時(shí)間2 d，發(fā)酵溫度4 ℃。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus BT氣相-高通量飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國力可公司）；游離氨基酸分析專用高效液相色譜（美國安捷倫科技有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；PL2002型電子分析天平、PB602-N 型分析天平（瑞士Mettle-Toledo公司）；HYL-B 型全溫?fù)u瓶柜（太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)室條件下工藝流程

糯米原料→清洗、除雜→浸泡→打漿→液化→糖化→發(fā)酵→過濾→原酒。

1.3.2 基本理化指標(biāo)測定

總酸、酒精度和氨基態(tài)氮含量測定：參照文獻(xiàn)[8]方法；還原糖含量測定：采用2, 3, 5-三硝基水楊酸比色法[7]；酵母數(shù)目測定：參照文獻(xiàn)[9]方法。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

頂空固相微萃取條件：取8.0 mL酒樣至20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入3.0 g NaCl，充分溶解后加入27.92 μg·L-1己酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)。

GC-TOFMS 條件：色譜條件：DB-FFAP 色譜柱；高濃度載氣He，流速1 mL·L-1；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，以10 ℃·min-1速率升溫至230 ℃，保持5 min；質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度210 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃；全掃描模式（SCAN），質(zhì)量掃描范圍35～400 aum。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性與定量：定性采用樣品質(zhì)譜與NIST 2.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)鑒定；定量采用內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)下面公式計(jì)算：

式中，Ci-樣品中各揮發(fā)性化合物濃度（μg·L-1）；Cs-內(nèi)標(biāo)己酸甲酯濃度（μg·L-1）；Ai-樣品中待測物質(zhì)對(duì)應(yīng)色譜峰面積；As-內(nèi)標(biāo)色譜峰面積。

1.3.4 游離氨基酸含量測定

用裝備有安捷倫ZORBAX SB Aq 柱（250 mm×4.6 mm）游離氨基酸分析專用高效液相色譜檢測米酒中游離氨基酸組成。

色譜條件：柱溫25 ℃；流動(dòng)相A，甲醇；流動(dòng)相B，50 mmol · L-1醋酸鈉緩沖液（pH 6.5）； 梯度洗脫程序：A：25%，B：75%，0～3 min；A：35%，B：65%，8 min；A：45%，B：55%，23～25 min； A：25%，B：75%，30 min。

1.3.5 感官分析

感官培訓(xùn)參考文獻(xiàn)[5, 10]方法，選擇10名（5男5 女）至少經(jīng)半年米酒感官評(píng)價(jià)訓(xùn)練研究生作為品評(píng)員，所有感官訓(xùn)練均在20 ℃感官品評(píng)室中完成。10 名品評(píng)員通過觀察、嗅聞和品嘗米酒，確定米酒描述性特征，包括外觀、香氣（酒香、米香）、風(fēng)味（酸、甜、苦、辣）、口感（澀、酒體豐滿）、風(fēng)格。品評(píng)人員對(duì)每個(gè)特征評(píng)分范圍為0～10（0：無；1～3：非常弱；4～5：普通；6～7：中等；8～9：強(qiáng)；10：非常強(qiáng)）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2016、Origin 2018、R 語言（ggplot2、pheatmap、ggradar 包）、Adobe Illustrator CC2018、SPSS 25.0等軟件處理數(shù)據(jù)及繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)

不同發(fā)酵階段總酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮、酒精度、酵母數(shù)目如表1所示?？偹崾蔷祁惍a(chǎn)品重要指標(biāo)，對(duì)酵母生長、成品酒酒體和風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[11-12]，A-D 階段總酸逐漸升高，因酵母代謝旺盛，在一系列酶作用下將代謝生成的部分丙酮酸轉(zhuǎn)化為酸類等物質(zhì)以及產(chǎn)酸菌大量繁殖，但在DE階段總酸下降，因?yàn)樵诘桶l(fā)酵溫度下，部分產(chǎn)酸菌受抑制以及緩慢酯化反應(yīng)，與Li 等研究結(jié)果一致[12]。

表1 不同發(fā)酵階段基本理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indices of different fermentation stages

由于蛋白酶分解以及酵母自溶使氨基酸態(tài)氮升高，酵母不斷利用糖發(fā)酵使酒精度逐漸升高，因此，還原糖含量逐漸下降，氨基酸態(tài)氮和酒精度逐漸上升。酵母數(shù)目在A-B 階段升高，在B 階段達(dá)最大，進(jìn)入C階段后數(shù)目開始減少，由于A-B階段酵母快速繁殖滿足發(fā)酵需要，隨溫度條件改變酵母進(jìn)入C-E 階段，酵母活性減弱及自溶，數(shù)目減少。

2.2 不同發(fā)酵階段揮發(fā)性組分變化

2.2.1 不同發(fā)酵階段共有組分分析

米酒發(fā)酵過程中全部風(fēng)味物質(zhì)含量見表2，為進(jìn)一步研究和表征發(fā)酵過程中揮發(fā)性組分變化，選取不同發(fā)酵階段共有組分作熱圖分析。由圖1可知，不同發(fā)酵階段共有揮發(fā)性物質(zhì)72 種，其中酯類27種、醇類19種、酸類9種、醛類8種、酚類2種、呋喃1種，其他6種。

表2 不同發(fā)酵階段揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Volatile substances in different fermentation stages

續(xù)表2

續(xù)表2

本研究檢測到27 種酯類物質(zhì)，包括20 種乙酯類和4種乙酸酯類，在發(fā)酵過程中，含量較高的酯類為乙酸異戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯（見表2）。乙酸異戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯在A階段含量較高，B-D階段呈下降趨勢。由于發(fā)酵條件改變影響酯水解酶活力，促使酯水解成相應(yīng)醇和酸，與過表達(dá)IAH1編碼的酯降解酶導(dǎo)致酯濃度顯著下降一致[13]。辛酸乙酯有白蘭地酒香味，在A階段含量較高，隨發(fā)酵呈下降趨勢，而乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯等則呈波動(dòng)變化，丁二酸二乙酯在發(fā)酵過程中一直呈上升趨勢。

由圖1 可知，除辛醇、2-辛醇、1-辛烯-3-醇外，幾乎所有醇類物質(zhì)在A階段含量較高，在B-E階段呈波動(dòng)變化。其中，苯乙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇是米酒中主要醇類。適量苯乙醇、異丁醇、異戊醇可增加酒協(xié)調(diào)性，主要通過氨基酸降解途徑（Ehrilich途徑）和糖合成代謝途徑（Harris 機(jī)制）[14]生成。A-C 階段其含量快速下降，D-E階段則緩慢上升，原因一方面為醇類物質(zhì)與酸發(fā)生酯化反應(yīng)，生成相應(yīng)酯；另一方面，氨基酸通過Ehrilich 途徑生成相應(yīng)高級(jí)醇，如苯丙氨酸降解生成苯乙醇、纈氨酸降解生成異丁醇、亮氨酸降解生成異戊醇。2,3-丁二醇是酒類中極少數(shù)呈香多元醇之一，呈黃油和奶油香氣[15]，主要在A 階段生成，與陳青柳等對(duì)黃酒發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)變化研究一致[16]。另外，米酒中檢測到1-辛烯-3-醇，但含量較少，呈波動(dòng)變化，同時(shí)清酒[17]、石榴汁[18]、黃酒[19]中均有檢測。

米酒中檢測到9種酸類，乙酸、異丁酸、辛酸是主要酸類（見表2）。乙酸又稱醋酸，在發(fā)酵初期含量較高，含量呈先降后升趨勢。異丁酸有輕微酸氣味和奶酪香，發(fā)酵過程中呈上升趨勢，賦予酒體協(xié)調(diào)的口感。如圖1所示，在發(fā)酵過程中辛酸含量A階段較高，B-D階段呈波動(dòng)下降趨勢，E階段有所上升。

醛類、酚類、呋喃類、酮類、醚類以及萜類，不同階段含量變化較為明顯，如縮醛中1,1-二乙氧基戊烷在不同階段波動(dòng)較為明顯，由于縮醛類化合物來源于醇和醛可逆縮合反應(yīng)[20]，發(fā)酵條件改變發(fā)酵體系中酸性環(huán)境，其又水解成相應(yīng)醛和醇。2,4-二特丁基苯酚、2,3-二氫苯并呋喃、2-庚酮、乙烯基乙醚在A-D階段呈逐漸下降趨勢，E階段上升，最終含量趨于穩(wěn)定。

2.2.2 不同發(fā)酵階段揮發(fā)性物質(zhì)種類動(dòng)態(tài)變化

由圖2 可知，不同發(fā)酵階段醇類、酯類、酸類、醛酮類、酚類、呋喃類等種類數(shù)量動(dòng)態(tài)變化，醇和酯種類先增后趨于穩(wěn)定，而酸、呋喃以及其他物質(zhì)在發(fā)酵過程中變化小，在一定程度上表明酒體趨于穩(wěn)定。米酒醇酯比是評(píng)估風(fēng)味特征重要指標(biāo)，3～4 適宜，超過5之后，醇類物質(zhì)起主導(dǎo)作用。由圖2 可知，A-B 階段醇酯比較為適宜，C-D階段升高，醇類開始占主導(dǎo)作用，但E階段反而下降，達(dá)到6 左右，與Yang 等對(duì)黃酒研究相似[5]，說明黃酒研究在一定程度上可為米酒研究提供參考，同時(shí)醇酯比在E階段下降，說明低溫靜置可能有利于酯形成，為進(jìn)一步提高米酒品質(zhì)提供思路，即適當(dāng)減少后發(fā)酵時(shí)間增加低溫靜置時(shí)間。

2.3 游離氨基酸動(dòng)態(tài)分析

米酒中氨基酸含量豐富，主要來源于原料中蛋白質(zhì)酶解及酵母自溶，常見17 種氨基酸又可分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和澀味氨基酸[21]，在發(fā)酵過程中一部分氨基酸被酵母利用，一部分轉(zhuǎn)變?yōu)楦呒?jí)醇，其余則作為米酒一部分。

圖3是發(fā)酵過程中各階段氨基酸富集圖，從圖3 中可清晰看出， Leu、 Glu、 Arg、 Pro、 Ala、Phe、Vla 是米酒中主要氨基酸，17 種氨基酸含量隨發(fā)酵呈上升趨勢，苦味氨基酸Leu、鮮味氨基酸Glu、甜味氨基酸Pro 含量分別達(dá)（369.99±3.24）、（325.14±9.62）、（266.59±5.04） mg?L-1。

圖4顯示米酒發(fā)酵過程中不同類別氨基酸總量及總氨基酸動(dòng)態(tài)變化，苦味氨基酸是其主要氨基酸。發(fā)酵過程中，總氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鮮味氨基酸、澀味氨基酸呈上升趨勢，原因可能是原料酶解與酵母自溶。在對(duì)中國濁酒研究中發(fā)現(xiàn)，隨發(fā)酵時(shí)間增加，總氨基酸含量、甜味氨基酸、苦味氨基酸、鮮味氨基酸、澀味氨基酸也逐漸增加[21]，但發(fā)酵結(jié)束時(shí)，濁酒各氨基酸含量均低于米酒[38]，說明米酒口感更豐富飽滿。

2.4 動(dòng)態(tài)感官分析

由圖5可知，在發(fā)酵初期A階段，甜味、米香突出，但風(fēng)格欠缺，酸甜苦澀等味覺指標(biāo)較強(qiáng)。B-E階段酒香增強(qiáng)而米香減弱，風(fēng)格逐漸形成，酒體趨于豐滿，酸、甜、苦、澀等味覺指標(biāo)減弱，不同發(fā)酵階段層次分明，辛辣感雖逐漸增強(qiáng)，但區(qū)別不明顯，酒中辛辣多由醛類物質(zhì)產(chǎn)生，與圖1醛類物質(zhì)變化一致。

3 討論與結(jié)論

米酒風(fēng)味源于酯、醇、酸等物質(zhì)相互作用[22]。酯類由米酒中酵母代謝產(chǎn)生的醇與酸發(fā)生酯化反應(yīng)而生成，形成水果味和花香[23]，是米酒中重要風(fēng)味物質(zhì)之一。本研究中乙酯類如己酸乙酯、乳酸乙酯在發(fā)酵過程中呈下降趨勢，可能與發(fā)酵體系中相應(yīng)菌特定酶活有關(guān)，因此可通過檢測相應(yīng)菌酶活，改善米酒質(zhì)量。辛酸乙酯和丁二酸二乙酯變化趨勢分別與李紅蕾等[24]對(duì)黃酒研究和陳青柳等[16]對(duì)紹興機(jī)械黃酒發(fā)酵一致，說明米酒與黃酒存在一定相似性，因此黃酒部分規(guī)律可為米酒液態(tài)發(fā)酵研究提供參考。

醇類也是米酒中主要風(fēng)味物質(zhì)之一，賦予米酒醇香[25]。唐柯等研究石榴酒發(fā)酵過程中香氣動(dòng)態(tài)變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，苯乙醇、異戊醇、異丁醇呈先降后升趨勢[18]，與本研究結(jié)果一致。酸類作為米酒中重要呈味物質(zhì)，其含量直接影響米酒口感，如低含量辛酸可賦予酒水果香和花香，但含量較高則產(chǎn)生腐敗味和澀味[11]，本研究中辛酸含量后期增加，可能對(duì)米酒風(fēng)味產(chǎn)生不利影響。

米酒中風(fēng)味物質(zhì)種類也影響米酒質(zhì)量，蘇佳佳等分析發(fā)酵各階段糙米酒釀風(fēng)味變化發(fā)現(xiàn)，醇、酯、醛、酸類等風(fēng)味化合物隨糙米酒釀發(fā)酵時(shí)間增加種類先增后趨于穩(wěn)定[26]，但本研究中醛酮類種類前期呈上升趨勢，后期下降，可能是后期低溫環(huán)境有利于減少醛酮類物質(zhì)產(chǎn)生。與醇酯比研究結(jié)果相似，可通過延長后期低溫發(fā)酵時(shí)間改善米酒質(zhì)量。

米酒中氨基酸一方面豐富酒體顏色，另一方面作為營養(yǎng)物質(zhì)為酵母生長提供氮源且是風(fēng)味前體物質(zhì)，為米酒提供豐富口感[21]。Wang 等研究紹興地區(qū)黃酒風(fēng)味變化發(fā)現(xiàn)，Ala、Arg、Asp、Glu、Gly、Leu、Pro 是紹興黃酒中主要氨基酸[27]，與本研究不同，體現(xiàn)不同工藝下風(fēng)味特色。感官分析是對(duì)米酒產(chǎn)品質(zhì)量最直觀評(píng)價(jià)，本研究結(jié)果表明，米酒生產(chǎn)中可根據(jù)不同發(fā)酵階段感官品評(píng)及時(shí)調(diào)控生產(chǎn)。