李艷榮，牟桐，黃莉莉，徐繼林，周成旭，嚴(yán)小軍

( 1. 寧波海洋研究院，浙江 寧波 315832；2. 寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，浙江 寧波 315832)

1 引言

甜菜堿脂是一類不含磷的甘油脂類，由兩分子的脂肪酸和一分子的極性頭部組成，Dembitsky[1]對甜菜堿脂的生化結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能做了詳細的報道。海洋微藻中的甜菜堿脂主要包括3 大類：二酰甘油-N-三甲基高絲氨酸（diacylgycerol-N-trimethylhomoserine，DGTS），二酰甘油-羥甲基-N,N,N-三甲基-β-丙氨酸（diacylglyceryl-hydroxymethy-N,N,N- trimethylβ-alanine，DGTA）和二酰甘油-O-羧羥甲基膽堿（diacylglyceryl-carboxyhydroxymethylcholine， DGCC）， 是海洋微藻中的三大膜脂之一。甜菜堿脂的組成和代謝對于微藻的化學(xué)分類具有重要的意義，甜菜堿脂的脂肪酸組成和完整極性脂分子可以作為營養(yǎng)標(biāo)記，可進一步確認初級生產(chǎn)者在食物網(wǎng)中的作用[2–3]。Banskota等[4]在微綠球藻(Nannochloropsis granulata)中分離出6 種 DGTS， 即 (2S)-1,2-bis-Oeicosapentaenoylglyceryl-3-O-4′-(N,N,N-trimethyl)-homoserine, (2S)-1-O-eicosapentaenoyl-2-O-arachidonoylglyceryl-3-O-4 ′-(N,N,N-trimethyl)-homoserine, (2S)-1-Oeicosapentaenoyl-2-O-myristoylglyceryl-3-O-4′-(N,N,N-trimethyl) -homoserine, (2S)-1-O-eicosapentaenoyl-2-O-palmitoylglyceryl-3-O-4′-(N,N,N-trimethyl)-homoserine, (2S)-1-O-eicosapentaenoyl-2-O-palmitoleoylglyceryl-3-O-4′-(N,N,N-trimethyl)-homoserine 和(2S)-1-O-eicosapentaenoyl-2-O-linoleoylglyceryl-3-O-4′-(N,N,N-trimethyl)-homoserine。這些DGTS 可以通過下調(diào)一氧化氮合成酶的表達來抑制RAW264.7 巨噬細胞中NO 的產(chǎn)生，首次表明DGTS 或許具有抗炎活性。此外，甜菜堿脂與微藻的生長和耐鹽性有關(guān)，DGTS 的含量測定有助于了解微藻生長或耐鹽的機制，進而有益于培養(yǎng)出更多使用性微藻[5–6]。

海洋微藻是海洋中最主要的光合生物，硅藻、綠藻、甲藻和定鞭藻是4 種常見的微藻種類，其季節(jié)、種類的變化在海洋生態(tài)環(huán)境、海區(qū)生產(chǎn)力、全球碳循環(huán)等方面起著重要作用[7–8]。甜菜堿脂是一類極性脂，是生物膜的重要組成成分，在磷脅迫時，甜菜堿脂可以替代磷脂酰膽堿（PC）維持藻類細胞正常的生命活動[9–10]。對于甜菜堿脂的研究，大多數(shù)研究者是將甜菜堿脂經(jīng)過復(fù)雜的衍生化或酸化后用液相色譜、氣相色譜或氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定甜菜堿脂的組成[11–13]。近年來，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)為海洋微藻中甜菜堿脂的研究提供了一種新的方法[3,14–15]。本文利用超高效液相色譜?四級桿?飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)（UPLC-Q-TOF MS）建立了一種同時檢測海洋微藻中3 類甜菜堿脂的分析方法，對4 個微藻門中的14 種微藻的甜菜堿脂分子結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)脂肪酸的組成及分布進行分析。為海洋微藻生態(tài)學(xué)研究提供理論依據(jù)，是進一步闡明脂質(zhì)代謝必然要做的一項工作，有助于更好地了解甜菜堿脂在人類健康領(lǐng)域的作用；另一方面，對不同種類海洋微藻中甜菜堿脂分布的研究，也可以為微藻的系統(tǒng)發(fā)育及化學(xué)分類提供新的見解。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

DGTS 標(biāo)品1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-O-4-(N,N,N-trimethyl) homoserine (16:0-16:0 DGTS) 以及DGTS 的同位素標(biāo)準(zhǔn)品（1,2-di-palmitoyl-sn-glycero-3-O-4'-[N,N,N-trimethyl（D9）-homoserine）均購買自美國Avanti Polar Lipids 公司；所有用于樣品提取、液質(zhì)分析的試劑均為色譜級；純水來自于Milli-Q 純水儀；抗氧化劑2，6-二叔丁基對甲酚（BHT，>99.9%），購自美國Sigma公司。

2.2 樣品的培養(yǎng)和收集

表1 所示的14 種微藻均由寧波大學(xué)浙江省海洋生物重點實驗室微藻種質(zhì)庫提供。用于微藻培養(yǎng)的海水均經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸消毒，所有容器均高溫滅菌。培養(yǎng)液采用f/2 配方[16]，藻種在5 000 mL 錐形瓶中（20±2）℃自然光培養(yǎng)，每天搖動數(shù)次，并用顆粒粒度計數(shù)分析儀（上海求精生化試劑儀器有限公司）測量藻類密度，14 種微藻均在平臺期收獲，將收獲的藻液在5 000 r/min 的條件下高速離心10 min 獲取藻泥，冷凍干燥機（美國Labconco 公司）干燥后備用。樣品平行培養(yǎng)3 份。

表1 14 種海洋微藻的種名和種質(zhì)編號Table 1 The strain number and species name of 14 species of microalgae

2.3 樣品制備

分別稱取各藻類細胞50 mg 干粉，加入氯仿/甲醇（1∶1，V/V）混合溶液提取總脂，氮氣濃縮儀（美國ATR 公司）吹干，甲醇復(fù)溶后經(jīng)孔徑為0.22 μm 的超濾膜（美國Mil-lipore 公司）離心過濾，然后進行UPLC-Q-TOF-MS（美國Waters 公司）分析。所有溶劑中均加入50 μg/mL BHT。

2.4 UPLC-Q-TOF 分析

用于樣品分析的液相色譜和質(zhì)譜條件見參考文獻[17]。

2.5 甜菜堿脂的半定量分析

甜菜堿脂的半定量：分別在每一種微藻樣品中加入5 μg/mL 的1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-O-4’-[N,N,Ntrimethyl(D9)] homoserine DGTS 同位素內(nèi)標(biāo)（由于目前市場上只有DGTS 的同位素內(nèi)標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)品，微藻中所有甜菜堿脂的半定量分析參照相應(yīng)DGTS 內(nèi)標(biāo)的峰面積）對樣品進行半定量分析。根據(jù)流動相比例的改變，獲得相應(yīng)甜菜堿脂的離子化效果，從低碰撞能量下的色譜圖中提取樣品中每一種甜菜堿脂的離子色譜圖；根據(jù)不同流動相比例下的甜菜堿脂的離子化效果，獲得相應(yīng)峰面積積分值。根據(jù)峰面積與濃度的線性關(guān)系，利用同位素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積半定量樣品中每毫克干藻粉中甜菜堿脂含量，取3 個平行結(jié)果的均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 甜菜堿脂質(zhì)譜規(guī)律及鑒定方法研究

由于目前市場上購買不到DGCC 的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，文中選用文獻已報道過的富含DGCC 的微藻進行DGCC 結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎裂規(guī)律的分析。據(jù)文獻[15]報道，假微型海鏈藻中可檢測到分子組成為16:0/22:6 DGCC，其母離子質(zhì)荷比為799.59。利用UPLC-Q-TOF MS 對假微型海鏈藻中16:0/22:6 DGCC 的分子離子峰進行一級和二級質(zhì)譜掃描。ESI 源正離子模式的一級質(zhì)譜圖上(圖1a)，m/z=800.61 代表的是16:0/22:6 DGCC的[M+H]+的母離子峰；在碰撞能量為45 eV 時的二級質(zhì)譜圖中（圖1b），m/z=104.11、m/z=132.10 和m/z=178.11的碎片離子的元素組成分別為[C5H14NO]+、[C6H14NO2]+和[C7H16NO4]+，這與Kato 等[18]的研究結(jié)果一致，其中m/z=104.11 碎片離子的豐度較高，可以作為DGCC 的特征碎片離子，用于DGCC 的定性。此外，m/z=472.37（[M+H-R2COOH]+）和m/z=544.36（[M+H-R2COOH]+）的碎片離子峰，可用于DGCC 脂肪酸鏈的分析。

圖1 正離子MSE 模式，假微型海鏈藻中16:0/22:6 DGCC ([M+H]+，m/z=800.61)低能量下提取離子流色譜圖 （a）；正離子模式下假微型海鏈藻保留時間為12.98 min16:0/22:6 DGCC [M+H]+（m/z=800.61）二級質(zhì)譜圖（b）Fig. 1 EIC of 16:0/22:6 DGCC ([M+H]+, m/z= 800.61) in T. pseudonana at the low collision energy of 6 V in the positive mode with the MSE technique (a); the MS2 spectrum of the[M+H]+ ion at m/z=800.61 of 16:0/22:6 DGCC at retention time 12.98 min extracted from T. pseudonana (b)

基于已總結(jié)的DGCC 的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，采用MSE技術(shù)對微藻樣品中的DGCC 進行分析，可以在一次進樣全掃中通過高低能量轉(zhuǎn)換得到樣品中每一個物質(zhì)的母離子和對應(yīng)子離子精確質(zhì)量數(shù)。在MSE的二級質(zhì)譜圖中，母離子和子離子可以同時存在，從高碰撞能量掃描的總離子流圖中提取含有m/z=104.11 的特征碎片離子的色譜圖；然后在相同保留時間點，從低碰撞能量掃描的總離子流圖中找到相應(yīng)碎片離子的[M+H]+的母離子；最后針對每一個母離子進行二級質(zhì)譜分析，進一步確定DGCC 的結(jié)構(gòu)。例如，在顆石藻的高碰撞能量掃描的總離子流圖中提取m/z=104.11碎片離子的色譜峰（圖2b），從低碰撞能量掃描的總離子流圖的對應(yīng)保留時間找到每一個DGCC 的母離子（圖2a），然后針對每一個母離子分別進行二級質(zhì)譜分析，對每一個DGCC 的分子組成進行鑒定。通過進一步的二級質(zhì)譜分析，在顆石藻中一共檢測到17 種DGCC 甜菜堿脂（表2）。

圖2 正離子MSE 模式，顆石藻總脂混合物的低能量總離子流色譜圖（a）；高能量MSE 色譜圖中提取DGCC 特征碎片離子m/z=104.11 的離子流色譜圖（b）Fig. 2 TIC of the lipid mixture extracted from P. carterae at the low collision energy of 6 V in the positive mode with the MSE technique (a); EIC of m/z=104.11 for characteristic product ion of DGCC in P. carterae from high collision energy scans (ramp of 30–60 V) in the positive mode with the MSE technique (b)

DGTS 和DGTA 是兩種同分異構(gòu)體，[M+H]+的二級質(zhì)譜碎裂方式非常相似，均可以產(chǎn)生特征碎片離子m/z=236.15 和m/z=144.10。為了更有效地鑒定和區(qū)分這兩種甜菜堿脂的分子組成，本文采用[M+H]+和[M+Li]+兩種加合形式相結(jié)合的方法。在流動相中加入0.01% LiCl 和0.1% HCOOH，可以同時檢測到DGTS和DGTA 的[M+H]+和[M+Li]+的母離子峰。首先在[M+H]+的條件下通過特征碎片離子和脂肪酸鏈的碎片離子鑒定出DGTS 或DGTA 的分子組成，然后在[M+Li]+的二級質(zhì)譜圖中根據(jù)碎片離子區(qū)分DGTS 和DGTA。關(guān)于DGTS 和DGTA 具體的二級碎裂規(guī)律及詳細鑒定方法參照本實驗室已發(fā)表文獻[17]。

3.2 14 種海洋微藻中甜菜堿脂的組成和分布

根據(jù)以上研究的甜菜堿脂的特征碎片離子及其分析鑒定方法，對4 個門的14 種微藻中的甜菜堿脂組成進行分析。共鑒定出133 種甜菜堿脂，包括53 種DGCC、41 種DGTS 和39 種DGTA（表2 至表4）。本研究基于MSE技術(shù)建立的系統(tǒng)分析海洋微藻中甜菜堿脂的檢測方法靈敏度更高，檢測到甜菜堿脂的種類更多。Ca?avate 等[15]在假微型海鏈藻中共檢測到8 種DGCC，而本研究在假微型海鏈藻中共檢測出26 種DGCC 分子，其中還包括6 種只含有一條脂肪酸鏈的甜菜堿脂，該方法鑒定的種類和數(shù)量具有明顯優(yōu)勢。

Armada 等[3]對兩種定鞭金藻Pseudoisochrysis paradoxaVLP（等鞭金藻綱，Isochrysidaceae）和Diacronema vlkianumVLP（巴夫藻綱，Pavlovaceae）中的甜菜堿脂的研究發(fā)現(xiàn)，等鞭金藻綱的P. paradoxaVLP可以同時檢測到3 種類型的甜菜堿脂，而巴夫藻綱的D. vlkianumVLP 中僅檢測到DGCC 和DGTS 兩種類型的甜菜堿脂，且14:0/18:1 DGTS 占D. vlkianumVLP中總DGTS 的90.9%以上。本研究的3 種定鞭金藻中，湛江等鞭金藻和球等鞭金藻屬于等鞭金藻綱，而顆石藻屬于顆石藻綱，在湛江等鞭金藻和球等鞭金藻中除了DGCC 外均檢測到14:0/18:1 DGTS，這與Armada 等[3]的研究結(jié)果一致，而顆石藻種檢測到的DGTS 脂肪酸鏈組成為16:0/22:6。研究結(jié)果表明，等鞭金藻綱主要的甜菜堿脂為DGCC，且僅含有或主要含有14:0/18:1 DGTS，進一步證明14:0/18:1 DGTS 及其含量占比可以作為等鞭金藻綱的特征甜菜堿脂，為等鞭金藻門等鞭金藻綱藻的系統(tǒng)分類提供一種新的依據(jù)。

假微型海鏈藻中發(fā)現(xiàn)26 種DGCC，威氏海鏈藻中發(fā)現(xiàn)25 種DGCC 和1 種DGTS，角毛藻中發(fā)現(xiàn)16 種DGCC；在小新月菱形藻和三角褐指藻中沒有發(fā)現(xiàn)DGCC，但分別檢測到27 種和30 種DGTA。由結(jié)果可知，中心硅藻綱（centric ditom）的3 種硅藻，即假微型海鏈藻、威氏海鏈藻和角毛藻中檢測到的甜菜堿脂主要為DGCC，沒有檢測到DGTA，而在羽紋硅藻綱（pennate diatom）的兩種硅藻小新月菱形藻和三角褐指藻中檢測到甜菜堿脂僅有DGTA。根據(jù)Vogel 和Eichenberger[11]的研究，DGTS 是DGTA 合成的前體，即DGTA 是通過DGTS 極性頭部脫羧基和重新形成羧基，以及甘油分子脫?；驮脔；纬傻?。因此，所有含有DGTA 的微藻原則上都應(yīng)含有少量或痕量的DGTS，DGTS 的水平取決于它轉(zhuǎn)換成DGTA 的速率。而小新月菱形藻和三角褐指藻中僅檢測到DGTA，可能是因為DGTS 含量太低，沒有達到相應(yīng)分析的檢測限。雙眉藻（Amphorasp.）屬于羽紋硅藻綱的硅藻，Li 等[17]在雙眉藻（Amphorasp.）中共檢測到16 種DGTA和9 種DGTS，沒有檢測到DGCC，且DGTA 的種類和含量多于DGTS。說明這種生化組成的不同有助于鑒別硅藻的兩個不同綱，相關(guān)的研究也證明了這一結(jié)論[9–10,15,18]。因此，海洋微藻進化過程中兩個不同綱的硅藻甜菜堿脂的合成機制仍需要大量的研究去探索。

綠藻門的3 種微藻中檢測到的甜菜堿脂僅為DGTS，其種類和含量遠遠高于其他門微藻中的DGTS。目前關(guān)于甲藻門中甜菜堿脂分布的研究較少，Ca?avate 等[15]在環(huán)溝藻中僅檢測到1 種DGCC（16:0/16:0），F(xiàn)laim 等[19]和Anesi 等[20]在甲藻中僅檢測到DGCC 存在。本研究中，東海原甲藻和微小亞歷山大藻分別發(fā)現(xiàn)3 種和10 種DGCC，而在卡羅藻中同時檢測到3 種甜菜堿脂的存在，即11 種DGCC、2 種DGTS 和2 種DGTA。根據(jù)已有報道，本研究的卡羅藻是目前唯一報道過的同時含有3 種甜菜堿脂的甲藻。

表2 9 種海洋微藻中DGCC 的組成及含量（nmol/mg 干藻粉）Table 2 The composition and content of DGCC in 9 microalgae（nmol/mg dry microalgae）

續(xù)表2

Ca?avate 等[15]利用主坐標(biāo)分析（PCO）方法對微藻中的甜菜堿脂進行研究，結(jié)果表明綠藻綱、共球藻綱和大眼藻綱的微藻聚在第一坐標(biāo)軸，與DGTS 含量成正相關(guān)；DGTA 和DGCC 在第二坐標(biāo)軸上分開，隱藻門和硅藻門的甜菜堿脂主要是DGTA，間藻門和甲藻門唯一的甜菜堿脂為DGCC。包括本研究在內(nèi)的甜菜堿脂的研究都僅是一個初步的研究，還不能全面了解甜菜堿脂在微藻中的分布，但可以將甜菜堿脂作為完整極性脂的生物標(biāo)記物，用于評估浮游植物天然的種群結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)[21]。

3.3 微藻中甜菜堿脂的脂肪酸組成

為了更好地了解不同門的微藻中甜菜堿脂分子的脂肪酸組成特點，將本研究中甜菜堿脂的脂肪酸組成檢測結(jié)果與部分文獻資料[3,15,18,22]報道過的微藻中甜菜堿脂的脂肪酸組成相結(jié)合，對甲藻門、綠藻門、定鞭藻門和硅藻門四大類微藻中甜菜堿脂的脂肪酸組成進行了總結(jié)（表5）。由結(jié)果可知，硅藻門的甜菜堿脂DGTS 中脂肪酸組成主要是C14?C18 偶數(shù)個碳原子的飽和以及低不飽和短鏈脂肪酸，而DGTA和DGCC 中的脂肪酸組成除了短鏈脂肪酸外，還含有多不飽和的脂肪酸和長鏈的多不飽和脂肪酸，如C20:4、C20:5 和C22:6，該結(jié)果與Li 等[17]對雙眉藻Amphorasp.的脂肪酸組成研究結(jié)果一致。定鞭藻門3 種類型甜菜堿脂的脂肪酸組成差別不大，基本為C14 脂肪酸、C16 脂肪酸、C18 脂肪酸以及C20:5 脂肪酸和C22:6 脂肪酸；甲藻門中DGCC 脂肪酸組成為C14 飽和短鏈脂肪酸、C16 飽和短鏈脂肪酸、C17 飽和短鏈脂肪酸和C18 飽和短鏈脂肪酸以及C20:5 多不飽和脂肪酸和C22:6 多不飽和脂肪酸，而DGTA 和DGTS 中僅含有短鏈脂肪酸。

此外，對不同門微藻中同一種類型甜菜堿脂的脂肪酸分布進行了分析，結(jié)果表明，硅藻門、甲藻門和定鞭藻門中均含有DGCC，但是甲藻門C14?C18 脂肪酸鏈均為飽和的，而硅藻門中含有C19 奇數(shù)碳原子的脂肪酸鏈。對于DGTS，硅藻中主要含有C14?C18的脂肪酸，甲藻中只含有C18 的脂肪酸，C20 的脂肪酸僅在綠藻門中檢測到，而C22:6 脂肪酸僅在定鞭藻中發(fā)現(xiàn)，這些特殊的脂肪酸組成的甜菜堿脂可在水產(chǎn)食物網(wǎng)研究中用作營養(yǎng)標(biāo)記。

以上研究結(jié)果表明，不同門的微藻甜菜堿脂的脂肪酸組成有其各自的特點，同一個門內(nèi)的不同微藻間甜菜堿脂脂肪酸的組成差別不大。相關(guān)研究表明，海洋大型植物中脂肪酸分布在科的水平上就可以很好地區(qū)分[23]，而微藻中甜菜堿脂的脂肪酸分布的特點與海洋大型植物中脂肪酸分布存在不同。Dalsgaard 等[24]研究表明，微藻的脂肪酸組成在較高的分類水平上表現(xiàn)出一定的特點，在水產(chǎn)食物網(wǎng)研究中被廣泛用作營養(yǎng)標(biāo)記；Thomas 等[25]研究也表明不同微藻脂肪酸組成差異只能限制在門和綱的水平上，在較低的分類水平上差異不明顯。甜菜堿脂作為一種完整的極性脂已用于浮游植物自然群落結(jié)構(gòu)的研究[26–27]，對甜菜堿脂脂肪酸組成的研究有望提高不同物種區(qū)分的分辨度，可以為微藻的系統(tǒng)發(fā)育及化學(xué)分類提供新的見解。

表3 8 種海洋微藻中DGTS 的組成及含量（nmol/mg 干藻粉）Table 3 The composition and content of DGTS in 8 microalgae（nmol/mg dry microalgae）

表4 3 種海洋微藻中甜菜堿脂的組成及含量（nmol/mg 干藻粉）Table 4 The composition and content of betaine lipid in 3 microalgae（nmol/mg dry microalgae）

表5 4 個門的微藻中甜菜堿脂脂肪酸的組成特點Table 5 Characteristics of fatty acids of betaine lipids in marine microalgae

4 結(jié)論

本研究運用超高效液相色譜?四級桿?飛行時間質(zhì)譜建立了海洋微藻中甜菜堿脂的分析鑒定方法，對4 個微藻門中的14 種微藻的甜菜堿脂分子結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)脂肪酸的組成及分布進行了研究。研究結(jié)果表明，這種簡單快速的方法可以同時檢測出微藻中3 種類型的甜菜堿脂。不同門的微藻中甜菜堿脂分布的種類不同，定鞭藻和甲藻中主要的甜菜堿脂是DGCC，綠藻中主要的甜菜堿脂為DGTS，而在硅藻中的甜菜堿脂主要包括兩種，即DGCC（中心硅藻綱）和DGTA（羽紋硅藻綱）。不同門的微藻甜菜堿脂的脂肪酸組成有其各自的特點，根據(jù)脂肪酸組成特點對微藻分類只能限制在門和綱的水平上，在較低的分類水平上差異不明顯。本研究對微藻中甜菜堿脂的種類和分布特性進行了研究，對于進一步研究這些缺磷極性脂類的生理、生態(tài)作用和功能特性具有重要的意義，也可以為微藻的系統(tǒng)發(fā)育及化學(xué)分類提供新的見解。