液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量

王孝鋼 范津琿 江志訓(xùn) 劉彩飛

摘??? 要：為解決有機磷農(nóng)藥殘留量檢測分析過程中基質(zhì)效應(yīng)影響檢測結(jié)果的問題，本研究以電噴霧（ESI）為離子源，正離子模式多級反應(yīng)離子檢測（MRM）方式，建立了一種靈敏度高、選擇性強的基質(zhì)校正液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），以同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量。以洋蔥為試材，優(yōu)化選擇了乙酸/乙腈（1：100Vol）+6 g氯化鈉為最佳提取體系，并確定超聲提取30 min、快速混勻器振蕩1.5 min為最佳提取條件。利用該方法檢測洋蔥28種有機磷農(nóng)藥含量，在0.200～100 μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其與峰面積之間呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998 27～0.999 90;方法檢出限0.06～0.89 μg·kg-1，定量限0.24～3.6 μg·kg-1;28種有機磷農(nóng)藥殘留量在10.0，50.0，200 μg·kg-13個濃度水平的平均回收率為76.4%～102.6%，相對標準偏差為1.1%～9.0%。利用該方法檢測蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量在10 μg·kg-1濃度水平的平均回收率為74.7%～109.9%，相對標準偏差為0.61%～6.2%。綜合而言，所建立的新方法能滿足實際樣品分析檢測的要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;有機磷農(nóng)藥;洋蔥;蔥;姜;蒜;韭菜

中圖分類號：0657.63;S481.8???????? 文獻標識碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.12.012

Determination of 28 Organophosphorus Pesticide Residues in Onion， Scallion， Ginger， Garlic and Leek by LC/MS/MS

WANG Xiaogang1， FAN Jinhui1， Jiang Zhixun1， LIU Caifei2

（1. Qingdao Academy of Agricultural Sciences， Qingdao， Shandong 266109， China; 2. Agricultural and Rural Bureau of Jimo District， Qingdao， Shandong 266200， China）

Abstract： In order to solve the matrix effect in the detection process， the experiment developed a highly sensitive， selective， and matrix corrected LC-MS/MS method by electrospray ionization （ESI） as ion source and MRM in positive ion mode， which could simultaneously determine 28 organophosphorus pesticide residues of onion， scallion， ginger， garlic and leek. Using onion as material， the conditions of HPLC and MS for determination of 28 organophosphorus pesticides were optimized， the optimal extraction system were acetic acid /acetonitrile （1：100Vol） +6 g NaCl， and the optimal extraction process were 30 min of ultrasonic extraction and 1.5 min rapid mixer oscillation. The above method were used to detect? the 28 organophosphorus pesticides in onion， there was a good linear relationship between the organophosphorus pesticides content and peak area in the range of 0.200-100 μg·L-1， and the correlation coefficients were 0.998 27-0.999 90; the detection and quantitation limit were in the range of 0.06-0.89 μg·kg-1 and 0.24-3.6 g·kg-1， respectively; the recovery rate of 28 organophosphorus pesticides residues for 10， 50， 200 μg·kg-1 levels ranged from 76.4% to 102.6%， which the relative standard deviation were ranged from1.1% to 9.0%. The above method were used to detect the 28 organophosphorus pesticides residues in scallion， ginger， garlic， and leek， the recovery rate for 10 μg·kg-1 level were ranged from 74.7% to 109.9% ， which the relative standard deviation were ranged from 0.61% to 6.2%. Comprehensively， the new method could meet the requirements of actual sample analysis.

Key words： LC-MS/MS; organophosphorus pesticide residues; onion; scallion; ginger; garlic; leek

有機磷農(nóng)藥是一類廣泛用于防治植物病蟲害的高效廣譜殺蟲劑，同時對人畜也有較高的毒害性。在日常農(nóng)產(chǎn)品檢測中，常常在蔬菜、水果中能檢測出有機磷農(nóng)藥殘留。洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜等是一類具特殊香辛的鱗莖類蔬菜，該類蔬菜基質(zhì)中含有大量的含硫化合物，對準確測定有機磷農(nóng)藥殘留量的影響很大，易出現(xiàn)假陽性和假陰性，是農(nóng)藥殘留檢測公認的測定難題[1]。因此，研究洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中多種有機磷殘留檢測技術(shù)具有十分重要的意義。

測定鱗莖類蔬菜中有機磷農(nóng)藥的分析方法主要有氣相色譜法[2-4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-2，5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]和超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法[9]。由于有機磷農(nóng)藥種類很多，不同有機磷農(nóng)藥的性質(zhì)差別很大，一些有機磷農(nóng)藥如氧樂果、磷胺和辛硫磷等由于極性和熱不穩(wěn)定性問題，用氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜法無法測定或者靈敏度很低。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法通過采用多級反應(yīng)離子檢測（MRM），不但測定的靈敏度高，抗干擾能力強，而且能夠同時定性和定量，是測定有機磷農(nóng)藥較理想的方法。但用HPLC-MS/MS分析復(fù)雜基體時，樣品中共流出物質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)能夠抑制或增強待測物質(zhì)的響應(yīng)值，從而影響待測物質(zhì)濃度的測定。蘇建峰等[6]用乙腈渦旋提取，提取液經(jīng)Carb、C18和PSA 粉末分散固相萃取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定蔥、姜、蒜與辣椒醬中66種有機磷農(nóng)藥殘留，方法的回收率在52%～117%之間，其中5%的農(nóng)藥回收率在50～70%之間。有關(guān)同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量的研究較少，前期試驗也驗證了用氣相色譜-火焰光度檢測器測定，基質(zhì)干擾很大[1，6]，特別是大蒜基質(zhì)，即使選擇性好的火焰光度檢測器，色譜出峰前20 min 以內(nèi)仍出現(xiàn)很強的平頭峰，難以準確定量。為解決基質(zhì)效應(yīng)問題，本研究詳細探討了影響測定有機磷農(nóng)藥提取效率的主要因素，并采用基質(zhì)校正外標法定量，建立了同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent Technologies 6460? Triple Quad LC/MS 液相色譜/三重四極串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫公司）， 配有1200 Series G1312 B 二元泵，G1322A 脫氣機、G13670D 自動進樣器、G1316B柱溫箱。儀器操作系統(tǒng)為Mass Hunter軟件。碰撞氣為氮氣（純度99.999% ）。B 5500S-MTH超聲波清洗器（必能信超聲（上海）有限公司）。TDL-5-A臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠）。ZORBAX Eclipse? XDB C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm ）液相色譜柱 。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）。甲酸99%（色譜純，ROE Scientific INC.）;乙酸99.5%（天津博迪化工股份有限公司）;氯化鈉（分析純）：140 ℃烘4 h。屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。Nylon with Polypropylene Prefilters針式過濾頭濾膜0.22 μm，13 mm（Agela Technologies）。

1.2 標準樣品的配制

噻唑磷（fosthiazate）（純度93.0%）為固體物質(zhì)，購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，準確稱取適量標準物質(zhì)溶解于甲醇中配成濃度為1 150 mg·L-1的標準貯備溶液;甲胺磷（methamidophos）、乙酰甲胺磷（acephate）、氧樂果（omethoate）、久效磷（monocrotophos）、

樂果（dimethoate）、敵百蟲（trichlorfon）、硫環(huán)磷（phosfolan）、磷胺（phosphamidon）、敵敵畏（DDV）、殺撲磷（methidathion）、亞胺硫磷（phosmet）、內(nèi)吸磷（demeton）、馬拉硫磷（malathion）、三唑磷（triazophos）、滅線磷（ethoprophos）、稻豐散（phenthoate）、喹硫磷（quinalphos）、治螟磷（sulfotep）、倍硫磷（fenthion）、蠅毒磷（coumaphos）、地蟲磷（fonofos）、二嗪磷（diazinon）、辛硫磷（phoxim）、伏殺硫磷（phosalone）、丙溴磷（profenofos）、特丁硫磷（terbufos）、毒死蜱（chlorpyrifos）均購于國家標準物質(zhì)研究中心，此27種物質(zhì)為液體標準溶液（100～1 000 mg·L-1），上述標準配制后均貯存在-20 ℃冰箱中。使用時，先將貯備液用丙酮稀釋成100 mg·L-1和10 mg·L-1，再用甲醇稀釋成1 mg·L-1的中間工作溶液（內(nèi)含0.4%的甲酸），最后用乙腈+水（2+3）稀釋成一定濃度的工作溶液。

1.3 試驗所用樣品的準備及處理

1.3.1 試驗所用樣品的準備 試驗所用樣品均來自青島本地農(nóng)產(chǎn)品例行檢測過程中未檢出此28種農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果（含量低于所用方法的本實驗室檢出限）的樣品，檢測所用方法執(zhí)行農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行檢測工作要求，其中噻唑磷、內(nèi)吸磷、稻豐散和喹硫磷參照GB/T20769-2008方法進行檢測，其它24個參數(shù)用NY/T761-2008方法檢測。樣品勻漿后各約1 kg，每種樣品各分為10份，每份約100～150 g，于200 mL的帶蓋樣品盒中冷凍保存，其中4份為例行檢測過程中同類樣品的空白試驗備用，另外6份根據(jù)試驗進度分別作為本實驗中提取體系的選擇、提取效率影響因素的分析、溶劑置換對回收率的影響、線性方程和方法有效性評價等過程中的樣品或基質(zhì)使用，以減少基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響。在本試驗開始前，4份空白試驗備用樣品在使用過程中未發(fā)現(xiàn)對空白試驗有顯著影響，因此所選用的試驗樣品能滿足本試驗的要求（空白試驗結(jié)果見表1）。

1.3.2 試驗所用樣品的處理 稱取勻漿樣品10.00 g放入帶蓋子的50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入乙酸/乙腈（1∶100 Vol）溶液25.0 mL，擰緊蓋子，在超聲波清洗器上超聲提取30 min，提取液過濾后，往濾液中加入6 g氯化鈉，擰緊蓋子，混勻，在快速混勻器上混勻1.5 min，最后將含有樣品的聚四氟乙烯離心管放入臺式離心機中以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心后，分取上層乙腈提取液1.00 mL于干凈的小燒杯中，加入1.50 mL蒸餾水混勻，以0.22 μm針式過濾頭濾膜過濾，濾液供分析用。

1.4 液相色譜條件

選用ZORBAX Eclipse? XDB C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）為分析柱。流動相組成：含2.5 mmol·L-1甲酸銨的水（A）和含2.5 mmol·L-1甲酸銨的甲醇（B）。以梯度洗脫，分別為0 min：90/10（A/B）;2 min：85/15;4 min：60/40;10 min：40/60;15 min：25/75;23 min：15/85;25 min：5/95（1.00min）;27： 90/10（A/B），27～36 min： 90/10（A/B）。流速為0.40 mL· min-1，進樣5 μL，柱溫40 ℃。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧（ESI），采用正離子模式采集數(shù)據(jù)。掃描方式為反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），干燥氣溫度：300 ℃;干燥氣流速：8 L·min-1;霧化器壓力：25 psi;鞘氣溫度：330 ℃;鞘氣流速：9 L·min-1。電子倍增器電壓增量值：400 V; 噴嘴電壓為0 V。MRM離子對、裂解電壓、碰撞能量、毛細管電壓等參數(shù)見表2。根據(jù)28種有機磷農(nóng)藥的保留時間分8個時間段采集，見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取體系的選擇

測定蔬菜和水果中農(nóng)藥殘留最常用提取劑為乙腈。AOAC QuEChERS方法是用乙腈提取，并以乙酸鹽緩沖液促進分配。本文以洋蔥（10 g）為基質(zhì)，按照1.3.2的步驟，分別采用表3中的不同提取體系進行提取。樣品提取后分取1 mL乙腈提取液，自然揮干，加入1 mL甲醇和1.5 mL蒸餾水混勻，測定28種有機磷的回收率。結(jié)果（圖1）表明，敵敵畏（化合物9）在8種提取體系中回收率小于38%，在含有無水硫酸鈉體系中回收率小于10%;滅線磷（化合物16）在提取體系F和G中回收率小于50%;治螟磷（化合物19）、地蟲磷（化合物22）和特丁硫磷（化合物27）在體系E、F和G中回收率介于17%～46%之間;亞胺硫磷（化合物12）在體系F中回收率高達170%;其它22種有機磷在8種體系中的回收率介于50%～118%之間。綜合考慮，提取體系B即用乙酸/乙腈（1：100 Vol）溶液提取，提取效果最好，所以選擇此體系。

2.2 其他影響樣品提取效率因素的研究

對影響樣品提取效率的其他因素如冰乙酸的量、乙腈的體積，快速混勻器上混勻的時間，震蕩提取和超聲提取時間進行了優(yōu)化，這幾個因素優(yōu)化后的最佳量化值為乙酸/乙腈（1∶100 Vol）溶液25 mL，超聲30 min后，快速混勻器上混勻振蕩1.5 min。綜合本節(jié)與2.1的結(jié)果，以洋蔥10 g為基質(zhì)，按1.3.2步驟進行測定，28種有機磷的回收率均在70%～120%范圍內(nèi)。

2.3 溶劑轉(zhuǎn)換對28種有機磷農(nóng)藥回收率的影響

一般在進行HPLC-MS/MS分析樣品時，通常樣品提取后，需要將溶劑轉(zhuǎn)換成與流動相相同的溶劑，以取得最佳的色譜峰型。試驗表明，盡管用甲醇+水（2+3）做溶劑，有機磷農(nóng)藥的色譜峰最佳，但將提取體系的溶劑由乙腈轉(zhuǎn)換成甲醇后，敵敵畏、治螟磷、特丁硫磷、地蟲磷、滅線磷和二嗪磷6種農(nóng)藥的損失很大，回收率在15.8%～61.5%之間，特別是敵敵畏、治螟磷的回收率不足20%。但如果溶劑為純乙腈，甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果的總離子流峰會出現(xiàn)雙頭峰，為改善3種農(nóng)藥的色譜峰型，本文比較了用不同比例的乙腈水做溶劑對色譜峰型的影響。結(jié)果表明，乙腈水的比例為2+3時，色譜的峰型較好，盡管他們的色譜峰沒有甲醇+水（2+3）做溶劑的好，但6種農(nóng)藥的回收率有較大的提高。故本文最終選擇乙腈水（2+3）做溶劑。

2.4 線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

28種有機磷農(nóng)藥在不同的基質(zhì)中，表現(xiàn)出的基質(zhì)效應(yīng)也不一樣，為了減少基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，本研究采用基質(zhì)標準曲線作為定量曲線。在儀器的最佳測定條件下，洋蔥基質(zhì)中28種有機磷農(nóng)藥的線性回歸方程見表4，在0.200～100 μg·L-1的濃度范圍內(nèi)，權(quán)重采用（1/X），有機磷農(nóng)藥的含量與峰面積之間的相關(guān)系數(shù)在0.998 27～0.999 90范圍內(nèi)。

2.5 方法有效性的評價

分別稱取10.00 g未檢出28種有機磷農(nóng)藥殘留的洋蔥樣品，28種有機磷農(nóng)藥的加標濃度為10.0，50.0，200 μg·kg-13個水平，測定結(jié)果見表5，標準物質(zhì)的MRM質(zhì)譜圖和洋蔥加標樣品的MRM質(zhì)譜圖見圖2。由表5可知， 28種有機磷6次測定的平均回收率在76.4%～102.6%，相對標準偏差在1.3%～8.1%之間，試驗結(jié)果表明回收率符合農(nóng)藥殘留檢測實際要求。

向7個洋蔥樣品中分別添加濃度為3 μg·kg-1的28種有機磷農(nóng)藥，按照所建立方法的樣品全部分析步驟進行測定，計算方法檢出限（MDL）=S×3.143，式中的S為7次測定值的標準偏差。28種有機磷農(nóng)藥殘留的檢出限在0.06～0.89 μg·kg-1 范圍內(nèi)，定量限在0.24～3.6 μg·kg-1。根據(jù)GB2763-2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的規(guī)定，鱗莖等類蔬菜中28種有機磷農(nóng)藥有規(guī)定的最大殘留限量值均在0.01 mg·kg-1及以上（表1），因此，所建立的分析方法完全能夠滿足28種有機磷農(nóng)藥痕量殘留量分析的要求。

分別稱取蔥、蒜、韭菜及姜各8份樣品，2份樣品作為空白，6份樣品加入濃度水平為10.0 μg·kg-1的28種有機磷農(nóng)藥，利用所建立方法的提取、檢測步驟測定相關(guān)農(nóng)藥的量。結(jié)果（表6）表明，蔥、蒜、韭菜及姜4種基質(zhì)中28種有機磷農(nóng)藥的平均回收率均在74.7%～109.9%，相對標準偏差在0.54%～6.3%之間;其中，作為基質(zhì)的姜樣品中檢出了噻唑磷，2份空白樣品測定的平均含量為12.1 μg·kg-1，6份加標樣品測定的結(jié)果在扣除空白樣品的測定值后，平均回收率為101.7%，6份加標樣品測定結(jié)果的RSD 為1.8%，結(jié)果完全符合GB2763-2019的相關(guān)要求，這從側(cè)面證實了本方法的有效性和準確性，而且檢出限更低。

3 結(jié) 論

本研究以乙酸/乙腈（1：100 Vol）+6 g氯化鈉為提取體系，用基質(zhì)校正液相色譜三重四級串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時測定洋蔥、蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量的測定方法。試驗結(jié)果表明：28種有機磷農(nóng)藥在0.200～100 μg·kg-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.998 27～0.999 90;方法檢出限在0.06～0.89 μg·kg-1之間，方法定量限在0.24～3.6 μg·kg-1 范圍內(nèi)。洋蔥中28種有機磷農(nóng)藥殘留量在10.0，50.0，200 μg·kg-13個濃度水平的平均回收率在76.4%～102.6%之間，相對標準偏差在1.1%～9.0%之間;蔥、姜、蒜及韭菜中28種有機磷農(nóng)藥殘留量在10 μg·kg-1濃度水平的平均回收率在74.7%～109.9%之間，相對標準偏差在0.61%～6.2%之間。上述方法解決了基質(zhì)干擾問題和一些有機磷農(nóng)藥回收率低的問題，方法準確度高，靈敏度好，簡單、快速。

參考文獻：

[1] 李萍萍， 吳小芳， 萬瑤， 等. 固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大蒜中19種有機磷農(nóng)藥殘留量[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報， 2014， 16（6）： 720-727.

[2] 蘇建峰， 盧聲宇， 陳晶， 等. 溶劑轉(zhuǎn)移-氣相色譜-質(zhì)譜法和選擇洗脫-氣相色譜法測定大蒜中289種農(nóng)藥多殘留[J]. 色譜， 2011， 29（7）： 643-655.

[3] 應(yīng)興華， 徐霞， 胡敏駿， 等. 毛細管氣相色譜法測定韭菜中13種有機磷農(nóng)藥殘留的研究[J]. 分析測試學(xué)報， 2009， 28（10）： 1185-1188， 1193.

[4] 周華， 汪尤剛， 邊天斌， 等. 2009年-2012年衢州市售蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2013， 23（9）： 2144-2145.

[5] 蔣施， 徐宜宏， 趙穎， 等. 氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法確證姜中120種農(nóng)藥殘留量[J]. 農(nóng)藥， 2011， 50（9）： 672-676， 696.

[6] 蘇建峰， 趙建暉， 熊剛， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定蔥、姜、蒜與辣椒醬中的66種有機磷農(nóng)藥殘留[J]. 分析測試學(xué)報， 2011， 30（10）： 1094-1099.

[7] 王連珠， 周昱， 陳泳， 等. QuEChERS樣品前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中66種有機磷農(nóng)藥殘留量方法評估[J]. 色譜， 2012， 30（2）： 146-153.

[8] 黃和勇， 陳其煌. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定韭菜中 12種有機磷農(nóng)藥殘留效果研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2012（18）： 295-296， 298.

[9] 余璐， 宋偉， 呂亞寧， 等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法快速篩查茶葉中的204種農(nóng)藥殘留[J]. 色譜， 2015， 33（6）： 597-612.