孫志鵬，許光中，阿民布和，樊 慶，彭吉潤(rùn)，張能維

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的腫瘤，目前主要治療手段為手術(shù)治療，且放化療效果較差[1]。同大部分腫瘤一樣，HCC的早期診斷和手術(shù)的比例僅10%～20%，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已是晚期或終末期[2]。肝癌的發(fā)生由多種因素共同作用，通過(guò)多種途徑引起，具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找關(guān)鍵性的分子作為分子治療的靶點(diǎn)，對(duì)于肝癌的治療具有重要的意義。脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶-1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1，APE-1)是一種可以發(fā)揮DNA修復(fù)功能和氧化還原功能的蛋白，可調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)途徑的多種轉(zhuǎn)錄因子[3]。前期基于細(xì)胞水平研究[4]發(fā)現(xiàn)APE-1在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，且其高表達(dá)與TNM分期、組織病理分級(jí)存在差異，沉默APE-1表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞Hep 3B的增殖活性，提高細(xì)胞凋亡率。該研究基于動(dòng)物模型水平，進(jìn)一步探究APE-1對(duì)肝癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力的影響及機(jī)制探索。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及主要試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 20只4周齡SPF級(jí)BALB/c品系雄性健康裸鼠，體質(zhì)量17～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院(北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)。所有飼料、水、空氣、鋪墊物及各種用品均需經(jīng)過(guò)高溫高壓等滅菌處理。裸鼠處死取材后，用于免疫組化的樣品保存于組織固定液中，用于Western blot的組織立即轉(zhuǎn)入液氮保存。沉默APE-1表達(dá)的肝癌Hep 3B穩(wěn)定細(xì)胞株及其對(duì)照由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建后保存[4]。

1.1.2主要試劑 SP-0023-SP免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；APE-1(ab189474，免疫組化 1 ∶500；Western blot 1 ∶1 000)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)(ab92552，免疫組化 1 ∶500；Western blot 1 ∶2 000)、Ki-67(ab16667，免疫組化 1 ∶200；Western blot 1 ∶1 000)和PKM2(ab137852，免疫組化 1 ∶300；Western blot 1 ∶2 000)一抗抗體、GAPDH(ab181602，Western blot 1 ∶10 000)抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司；蛋白提取RIPA裂解液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑購(gòu)自江蘇碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與收集 復(fù)蘇沉默APE-1和對(duì)照組肝癌BEL-7402細(xì)胞，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)液(含10%FBS+1%雙抗)，在37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的瓶底時(shí)，用5%胰蛋白消化酶消化細(xì)胞，優(yōu)質(zhì)胎牛血清終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞全部離壁，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。再用生理鹽水洗滌細(xì)胞2次。洗滌完成后生理鹽水重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，備皮下成瘤用。

1.2.2模型制備 SPF條件下20只BALB/c-Nude裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，待到第三周時(shí)將裸鼠隨機(jī)均分為2組，分別編號(hào)。裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種注射1×107/ml細(xì)胞懸液200 μl。接種細(xì)胞懸液8周后脫臼處死裸鼠，計(jì)算成瘤率。完整剝離腫瘤組織，稱瘤體質(zhì)量并計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=1/2(長(zhǎng)徑×短徑×短徑)

1.2.3免疫組化檢測(cè)APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2在2組成瘤組織中表達(dá) 組織經(jīng)過(guò)切片、水化、抗原修復(fù)，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡拍照，采用IPP軟件對(duì)圖片進(jìn)行積分光吸光度(integrated option density，IOD)分析。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集2組成瘤組織，RIPA蛋白裂解液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后NC膜恒流濕法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜成功的NC膜轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉1 h。再將PVDF膜分別加入稀釋的APE-1、PCNA、Ki-67、PKM2和GADPH一抗，4 ℃輕搖過(guò)夜；隨后加入相應(yīng)的二抗(1 ∶2 000)，37 ℃恒溫?fù)u床孵育l h。蛋白的相對(duì)表達(dá)量用待測(cè)蛋白與GADPH的灰度值比值計(jì)算。

1.2.5基因表達(dá)相關(guān)性和生存曲線分析 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中374例肝癌患者數(shù)據(jù)，通過(guò)可視化GEPIA軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/panGeneCoExp.php)[5]分析APE-1和PKM2表達(dá)相關(guān)性及生存曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 APE-1沉默抑制肝癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力飼養(yǎng)至第8周，2組裸鼠成瘤率均為100%，且體質(zhì)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)趨勢(shì)，成瘤體積呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，結(jié)果顯示APE-1沉默組的裸鼠體質(zhì)量及成瘤體積均小于對(duì)照組(P<0.01)，見圖1。第8周末處死裸鼠，稱量瘤體重量并計(jì)算腫瘤體積，結(jié)果顯示APE-1沉默組和對(duì)照組瘤體重量分別為(0.203±0.028)、(1.00±0.105) g，腫瘤體積分別為(0.209±0.039)、(0.921±0.148) cm3；APE-1沉默組成瘤重量及體積均小于對(duì)照組(F=13.65、P<0.01，F(xiàn)=14.00、P<0.01)，見圖2。

圖1 成瘤過(guò)程中2組裸鼠體質(zhì)量及成瘤體積與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 成瘤組織中APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2表達(dá)檢測(cè)免疫組化和Western blot方法檢測(cè)2組成瘤組織中APE-1，細(xì)胞增殖標(biāo)志性蛋白PCNA、Ki-67和PKM2的表達(dá)，結(jié)果顯示APE-1沉默組中蛋白表達(dá)均小于對(duì)照組(P<0.05)，見圖3、圖4。

圖2 2組裸鼠成瘤瘤體質(zhì)量及體積比較

圖3 免疫組化檢測(cè)成瘤組織中APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2表達(dá) ×100

圖4 Western blot檢測(cè)成瘤組織中APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2表達(dá)

2.3 APE-1和PKM2表達(dá)相關(guān)性分析基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中374例肝癌患者數(shù)據(jù)，分析表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果表明，APE-1和PKM2在肝癌中表達(dá)正相關(guān)(R=0.33，P<0.001)，見圖5。

2.4 PKM2表達(dá)在肝癌患者中生存曲線差異結(jié)果顯示PKM2在肝癌患者中高表達(dá)組和低表達(dá)組整體生存曲線分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，低表達(dá)組生存期更長(zhǎng)，見圖6。

圖5 APE-1和PKM2表達(dá)相關(guān)性分析

圖6 PKM2表達(dá)在肝癌患者中生存曲線差異

3 討論

HCC是預(yù)后較差的腫瘤之一，其在分子水平上由多種遺傳、表觀遺傳和信號(hào)通路的失調(diào)，與腫瘤微環(huán)境相互作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[6]。氧化還原因子APE-1已經(jīng)被證實(shí)在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。Choi et al[8]通過(guò)檢測(cè)277例膀胱癌(BCa)患者尿液中APE-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BCa患者的APE-1水平顯著升高，并且與腫瘤分級(jí)和分期相關(guān)，暗示基于無(wú)創(chuàng)獲得的體液測(cè)量尿APE-1水平在臨床上可用于診斷BCa；這與Shin et al[9]研究成果血清APE-1可用作膀胱癌的潛在血清生物標(biāo)志物一致。

在肝癌研究中，Di Maso et al[10]通過(guò)臨床樣本證實(shí)APE-1 mRNA含量隨著肝病的進(jìn)展而增加，肝癌中APE-1轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)顯著增加。本課題組前期研究結(jié)果顯示APE-1在肝癌組織和細(xì)胞中均表達(dá)升高，其表達(dá)與TNM分期、組織病理分級(jí)存在差異。沉默APE-1表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞Hep 3B細(xì)胞增殖活性，提高細(xì)胞凋亡率。APE-1在肝癌細(xì)胞中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗腫瘤潛能[4]。與其它有關(guān)APE-1研究進(jìn)展一致。

裸鼠腫瘤模型由于其保留原發(fā)腫瘤本身的形態(tài)特征及遺傳性，是研究人類腫瘤生物特性以及腫瘤治療的常用手段；且因?yàn)槁闶竽[瘤模型具有成瘤率高、均一性好，能夠準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)特性等優(yōu)點(diǎn)，因此通過(guò)培養(yǎng)瘤細(xì)胞來(lái)建立裸鼠皮下移植瘤模型，可以為腫瘤治療的相關(guān)研究提供可靠的動(dòng)物模型。基于前期細(xì)胞水平研究，通過(guò)建立裸鼠成瘤模型探索APE-1對(duì)肝癌發(fā)生的影響。結(jié)果顯示在動(dòng)物體內(nèi)成瘤過(guò)程中，APE-1沉默組的裸鼠體質(zhì)量及成瘤重量/體積均小于對(duì)照組，表明APE-1沉默抑制肝癌細(xì)胞成瘤能力。增殖細(xì)胞核抗原PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[11]；Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中不可缺少，其表達(dá)越高，說(shuō)明細(xì)胞增殖越活躍，腫瘤生長(zhǎng)越快，組織分化越差，對(duì)化療也越敏感[12]。通過(guò)免疫組化檢測(cè)成瘤組織，顯示APE-1沉默組中細(xì)胞增殖標(biāo)志性蛋白PCNA、Ki-67表達(dá)均小于對(duì)照組，暗示成瘤抑制作用是由沉默APE-1降低肝癌細(xì)胞Hep 3B細(xì)胞增殖活性所導(dǎo)致的，與前期研究基礎(chǔ)一致[4]。

此外還顯示APE-1沉默組腫瘤組織中PKM2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組。丙酮酸激酶M2，也稱為PKM，是糖酵解過(guò)程最后一步的限速酶。PKM2以無(wú)活性單體、低活性二聚體和活性四聚體形式存在，通過(guò)高活性四聚體及低活性二聚體之間的轉(zhuǎn)換，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞能量和底物供給之間的平衡，對(duì)于腫瘤發(fā)生至關(guān)重要[13]。Dayton et al[14]通過(guò)構(gòu)建PKM2缺失小鼠，發(fā)現(xiàn)PKM2的喪失導(dǎo)致具有高滲透性的HCC的自發(fā)發(fā)展，并伴隨著以系統(tǒng)性葡萄糖穩(wěn)態(tài)，炎癥和肝脂肪變性改變?yōu)樘卣鞯娜泶x的逐步變化。基于癌癥和TCGA腫瘤標(biāo)本數(shù)據(jù)庫(kù)中374例肝癌患者數(shù)據(jù)，證明APE-1和PKM2表達(dá)線性正相關(guān)，且PKM2在肝癌患者中高表達(dá)組和低表達(dá)組整體生存曲線分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低表達(dá)組生存期更長(zhǎng)。暗示PKM2作為抑癌基因，APE-1可能通過(guò)影響PKM2抑制肝癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力。

綜上所述，APE-1在體內(nèi)同樣具有較強(qiáng)的抗腫瘤潛能，其可能通過(guò)影響PKM2抑制肝癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力。