彭 芳，胡擎鵬

許多研究[1]表明，氧化應(yīng)激參與了癲癇的病理生理過程，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的升高是癲癇誘發(fā)神經(jīng)元損傷的主要原因。最近研究[2]表明，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)開放后線粒體膜電位發(fā)生改變，促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和細(xì)胞色素C(Cytc)等蛋白釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，提示線粒體可能在癲癇損傷中起重要作用；葛根素是從草藥葛根中提取的一種黃酮類化合物，具有抗感染、抗氧化、抗凋亡等多種藥理作用[3]。據(jù)研究[4]報道，葛根素對體外缺氧缺糖細(xì)胞和體內(nèi)缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而，葛根素對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響尚不清楚，該研究旨在探討葛根素能否減輕匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元的凋亡以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料匹羅卡品購自美國 Sigma 公司；ROS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 羅丹明123購自美國 Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；組織線粒體分離試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Bax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)、Mito-CytC(1 ∶1 000)、Cyto-CytC(1 ∶1 000)、Cl-caspase3(1 ∶500)抗體購自英國Abcam公司。

1.2 動物及模型建立30只成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自南華大學(xué)實驗動物中心[SCXK(湘)2016-0023]。所有大鼠均飼養(yǎng)在室溫下并自由獲取水和食物。實驗經(jīng)南華大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2019-105)。

給予Wistar大鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，18～24 h后腹腔注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，30 min后腹腔注射匹羅卡品(30 mg/kg)致癲癇。參考Racine規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，4～5級癲癇發(fā)作，被納入實驗組。癲癇持續(xù)60 min，然后注射安定(10 mg/kg，靜脈注射)以降低死亡率。對照組大鼠接受相同體積的0.9%生理鹽水。大鼠在癲癇發(fā)作消失后第2、8、24、72 h被處死。

1.3 動物分組將大鼠隨機(jī)均分為5組：① 對照組；② 匹羅卡品組；③ 溶劑組：匹羅卡品給藥前10 min給予溶劑(2.5 ml生理鹽水)；④ 50 mg/kg葛根素組；⑤ 25 mg/kg葛根素組。葛根素溶于生理鹽水中，濃度為5 mg/ml，腹腔注射。

1.4 海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元Nissl染色[5]72 h后，將大鼠麻醉處死，取出腦組織置于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，脫蠟至水，采用甲苯胺藍(lán)Nissl染色法，對大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞(0.5 mm長)進(jìn)行盲法計數(shù)。

1.5 海馬CA3錐體神經(jīng)元TUNEL染色[6]參照試劑盒說明書，進(jìn)行TUNEL染色測定凋亡神經(jīng)元數(shù)量。在高倍顯微鏡下計數(shù)雙側(cè)大腦半球海馬CA3錐體細(xì)胞數(shù)(0.5 mm長)。

1.6 線粒體分離分離海馬組織，迅速放入預(yù)冷分離介質(zhì)，徹底清洗組織，用玻璃勻漿器制成勻漿液，650 r/min離心10 min沉淀細(xì)胞核及細(xì)胞碎片，收集上清液，以10 000 r/min離心10 min，沉淀的線粒體用3%Ficoll溶解后鋪于6%Ficoll界面上，并在6 500×g離心10 min，將最終的線粒體顆粒懸浮在分離培養(yǎng)基中并在-80 ℃下保存。所有步驟在0～4 ℃下預(yù)冷離心機(jī)中進(jìn)行，蛋白質(zhì)濃度由雙辛酸(bicinchoninic acid，BCA)分析。

1.7 線粒體膜電位測定將線粒體蛋白懸浮液(10 μg)加入2.5 ml反應(yīng)緩沖液中，再加入40 μl Rh-123使其終濃度為26 μmol/L，37 ℃下孵育5 min，然后10 ℃下10 000×g離心10 min，在503 nm激發(fā)波長和527 nm發(fā)射波長下測定上清液熒光強(qiáng)度。

1.8 線粒體中ROS水平檢測線粒體(0.4 mg/ml)與熒光探針 2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)(2 μmol/L)在25 ℃孵育30 min，在485 nm激發(fā)波長和530 nm發(fā)射波長條件下測量DCF熒光，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。ROS水平以熒光強(qiáng)度單位表示。

1.9 Western blot檢測Bax、Bcl-2、Mito-CytC、Cyto-CytC、Cl-caspase3表達(dá)取海馬組織50 mg，加入裂解液，BCA法測定總蛋白濃度，將等量蛋白(30 μg)上樣，通過SDS-PAGE 凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后，二抗孵育2 h，ECL顯色、曝光、洗片，采用Image Lab 4.0軟件測定各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值表示蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察對照組CA3區(qū)錐體神經(jīng)元正常呈圓形，而匹羅卡品組神經(jīng)元凋亡呈核固縮狀。匹羅卡品組存活神經(jīng)元數(shù)量較對照組降低(P<0.01，F(xiàn)=1.787)。25、50 mg/kg葛根素組能減輕癲癇誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡(P<0.05)，見圖1。

2.2 TUNEL法觀察葛根素對癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的影響對照組腦切片中未檢測到TUNEL陽性細(xì)胞，匹羅卡品組和溶劑組切片中觀察到大量TUNEL陽性細(xì)胞。與匹羅卡品組相比，25、50 mg/kg葛根素組癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡數(shù)下降(P<0.05，F(xiàn)=2.487)，見圖2。

2.3 葛根素對癲癇發(fā)作后線粒體膜電位的影響與對照組相比，2 h時匹羅卡品組線粒體膜電位無明顯差異(P>0.05，F(xiàn)=3.112)，而癲癇發(fā)作后8 h線粒體膜電位下降，并持續(xù)下降至72 h(P<0.05，F(xiàn)=2.459)；與匹羅卡品組或溶劑組相比，25、50 mg/kg葛根素組線粒體膜電位上升(P<0.05，F(xiàn)=1.490)，見圖3。

圖1 Nissl染色觀察海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元 ×200

圖2 TUNEL染色觀察海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元凋亡 ×200

圖3 葛根素對癲癇大鼠線粒體膜電位影響

2.4 葛根素對癲癇大鼠線粒體ROS產(chǎn)生的影響與對照組相比，匹羅卡品組線粒體ROS水平在癲癇發(fā)作后8 h開始增加，并在72 h達(dá)到最大水平(P<0.001，F(xiàn)=3.585)。而與溶劑組或匹羅卡品組相比，25、50 mg/kg葛根素組線粒體ROS水平下降(P<0.05，F(xiàn)=2.335)，見圖4。

圖4 葛根素對癲癇大鼠線粒體ROS生成影響

2.5 葛根素對Bax、Bcl-2、Mito-CytC、Cyto-CytC、Cl-caspase3表達(dá)的影響與對照組比較，溶劑組或匹羅卡品組Bax、Cyto-CytC、Cl-caspase3表達(dá)升高，而Bcl-2、Mito-CytC表達(dá)降低；而與溶劑組或匹羅卡品組相比，25、50 mg/kg葛根素組Bcl-2、Mito-CytC表達(dá)升高，Bax、Cyto-CytC、Cl-caspase3表達(dá)降低，見圖5。

圖5 Bax、Bcl-2、Mito-CytC、Cyto-CytC、Cl-caspase3蛋白表達(dá)

1：對照組； 2：匹羅卡品組； 3：溶劑組： 4：50 mg/kg葛根素組；5：25 mg/kg葛根素組；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與溶劑組或匹羅卡品組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

癲癇是一種陣發(fā)性腦功能障礙疾病，持續(xù)性發(fā)作可導(dǎo)致腦神經(jīng)元變性，雖然在癲癇發(fā)作后致神經(jīng)元損傷方面的研究已取得很大進(jìn)展，但其機(jī)制仍不清楚，且防治損傷發(fā)生發(fā)展的方法有限。本研究顯示葛根素對癲癇引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。線粒體功能障礙被認(rèn)為是癲癇的一個重要促發(fā)因素[7]，鑒于線粒體在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用，假設(shè)靶向線粒體信號通路的藥物可能具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。

越來越多的研究表明[8]，氧化應(yīng)激作為一個關(guān)鍵因素不僅是癲癇發(fā)作的后果,而且可能參與了癲癇發(fā)生。在癲癇患者大腦中，過量ROS產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。線粒體除了合成ATP外，還具有多種極為重要的功能，是細(xì)胞內(nèi)生成ROS的主要部位，也是ROS誘發(fā)氧化損傷的主要靶點[9]。線粒體功能失調(diào)會產(chǎn)生更多ROS，同時ROS介導(dǎo)的線粒體氧化損傷也會導(dǎo)致更多ROS產(chǎn)生[10]。癲癇發(fā)作產(chǎn)生大量ROS，隨后ROS引發(fā)的氧化損傷會導(dǎo)致MPTP開啟，這使線粒體釋放諸如CytC及凋亡誘導(dǎo)因子等成分依次啟動凋亡[11]，因此使用抗氧化劑調(diào)節(jié)線粒體功能可能是癲癇的潛在治療方法。Nissl染色顯示，25、50 mg/kg葛根素組能減輕癲癇誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡(P<0.05)，這說明葛根素對癲癇誘發(fā)神經(jīng)元死亡具有保護(hù)作用；葛根素對線粒體膜電位及ROS影響：經(jīng)25、50 mg/kg葛根素治療后，線粒體產(chǎn)生的ROS明顯減少，而膜電位增加，這可能是葛根素抗氧化作用的結(jié)果，ROS減少可能會調(diào)節(jié)線粒體功能從而減少細(xì)胞凋亡；在本研究中，葛根素預(yù)處理能顯著減少癲癇發(fā)作后大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量，這提示葛根素通過保護(hù)線粒體功能發(fā)揮抗凋亡作用，可能與其抗氧化作用具有潛在關(guān)系。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，如Bax和Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和CytC的關(guān)鍵分子[12]。Bcl-2能促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制各種刺激引起細(xì)胞凋亡，其過表達(dá)能減少線粒體釋放CytC[13]。而Bax是一種促凋亡因子，它可以插入線粒體外膜從而開啟MPTP，釋放CytC，而CytC釋放會最終激活caspase-3，導(dǎo)致DNA斷裂、核染色質(zhì)濃縮和凋亡[14]。Western blot結(jié)果顯示，匹羅卡品組大鼠Mito-CytC表達(dá)較對照組明顯下降，這可能是由于匹羅卡品能上調(diào)Bax表達(dá)、抑制Bcl-2表達(dá)，而25、50 mg/kg葛根素預(yù)處理后上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，從而抑制Cyto-CytC以及caspase-3的激活。

ROS誘導(dǎo)的DNA損傷可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯甚至凋亡。還有研究[15]表明，ROS參與了癲癇介導(dǎo)神經(jīng)元變性過程中凋亡機(jī)制的觸發(fā)。因此，ROS可能參與了一些癲癇模型中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。Western blot結(jié)果顯示，葛根素組Bcl-2、Mito-CytC表達(dá)升高，Bax、Cyto-CytC、Cl-caspase3表達(dá)降低，這可能是葛根素抗氧化作用的結(jié)果，葛根素能有效地減少癲癇大鼠海馬線粒體ROS的生成，恢復(fù)線粒體功能，進(jìn)而通過抑制Bax誘導(dǎo)的線粒體CytC釋放而減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究首次證明葛根素對癲癇大鼠海馬損傷的治療作用，盡管其可能機(jī)制和長期使用效果仍需確定，但葛根素是一種很好的抗氧化劑，它通過保護(hù)線粒體功能從而對癲癇損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用，具有潛在的治療價值。