候夢(mèng)賞，程雪芬，邱園妹，朱雅楠，趙必安，李志國(guó)，蘇松坤

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蜂學(xué)學(xué)院，福州，350002)

蜜蜂是重要的授粉性昆蟲，在生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要作用(Pottsetal., 2010)。自2006年末北美爆發(fā)蜂群崩潰失調(diào)癥(colony collapse disorder, CCD)以來(lái)(Cox-Fosteretal., 2007)，世界其它地區(qū)相繼出現(xiàn)蜂群數(shù)量大幅度減少的不正?，F(xiàn)象,(Normanetal., 2010)。大量研究顯示，造成這種現(xiàn)象的原因可能包括殺蟲劑濫用、寄生蟲、病毒、細(xì)菌等因素(Watsonetal., 2016; Magaletal., 2019)。新煙堿類殺蟲劑是全球使用量最多的品種，除了對(duì)靶標(biāo)昆蟲造成神經(jīng)性損傷以及死亡外，對(duì)全球重要授粉昆蟲——蜜蜂也具有高毒作用，嚴(yán)重威脅全球農(nóng)業(yè)環(huán)境生物安全(Peggetal., 2014)。

新煙堿類殺蟲劑的作用機(jī)制主要是通過(guò)與昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)煙堿型乙酰膽堿酯酶競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合位點(diǎn)，阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)(Masaru, 2005)。吡蟲啉作為典型的新煙堿類殺蟲劑，具有活性高、廣譜性的特點(diǎn)，能夠?qū)е旅鄯鋫€(gè)體表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力減弱、壽命縮短、生存活力降低等問(wèn)題(Armengaudetal., 2004; Carolinaetal., 2015; Zhangetal., 2015; Raymannetal., 2018)；在含有100 μg/kg吡蟲啉飼料喂養(yǎng)條件下蜂群群體表現(xiàn)蜂王交替時(shí)期過(guò)冬能力低下甚至有可能出現(xiàn)盜蜂現(xiàn)象(Ramirez-Romeroetal., 2005)；亞致死劑量吡蟲啉能夠降低蜜蜂的嗅覺(jué)靈敏性(Tanetal., 2017)；影響蜜蜂的定位功能從而弱化歸巢能力(Tosietal., 2017)。

近年來(lái)已有關(guān)于不同劑量吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂影響的相關(guān)研究。在低劑量吡蟲啉脅迫下，激活蜜蜂解毒基因、免疫基因、抗氧化基因表達(dá)(Gong and Diao, 2017)。連續(xù)5 d飼喂意大利蜜蜂幼蟲含吡蟲啉的蔗糖溶液后，幼蟲體內(nèi)多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)表達(dá)量顯著上調(diào)(Tesovniketal., 2019)；連續(xù)飼喂意大利蜜蜂0.02 μg/kg吡蟲啉7 d后，蜂王體內(nèi)CPY4G11，CYP6AS14表達(dá)顯著下調(diào)(Chaimaneeetal., 2016)。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GSTs)、乙酰膽堿酯酶(acetylchoinesterase, AChE)、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450)、PPO、羧酸酯酶(carboxylesterase，CE)超氧化物歧化酶(SDS)過(guò)氧化氫酶(CAT)是蜜蜂體內(nèi)重要解毒酶，參與蜜蜂對(duì)殺蟲劑解毒過(guò)程，在維持蜜蜂健康方面扮演重要角色(Boasetal., 2018)。然而目前關(guān)于亞致死劑量吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂影響的研究報(bào)道尚少。

本實(shí)驗(yàn)旨在探究在低劑量吡蟲啉脅迫下，意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)情況及免疫解毒酶系活力。探究飼喂含有低劑量吡蟲啉蔗糖溶液，對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂存活率的影響; 以及飼喂含有低劑量的吡蟲啉蔗糖溶液后，對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因PPOA3、ABA、GLD、CYP4506a2、CYB5612-like、UDP-glucuron-osyltransferase的表達(dá)量情況；以及飼喂含有低劑量的吡蟲啉蔗糖溶液后，對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂細(xì)胞色素P450酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶酶活力的影響。為后續(xù)進(jìn)一步探究亞致死劑量吡蟲啉對(duì)蜜蜂健康影響的分子機(jī)制打下一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

吡蟲啉純品(Sigma)，丙酮(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)，SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)，總蛋白提取試劑盒DE101(北京全式金生物科技有限公司)，TaKaRa Bradford Protein Assay Kit(TaKaRa)，昆蟲細(xì)胞色素P450試劑盒m1036261-J(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司)，昆蟲多酚氧化酶PPO試劑盒m1062744-J(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司)，昆蟲過(guò)氧化氫酶CAT試劑盒ml062687(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司)，昆蟲超氧化物岐化酶SOD試劑盒ml036253(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司)，NanoDrop 2000型分光光度計(jì)(Thermo Scientific)，梯度PCR儀(Applied Biosystems)，熒光定量PCR儀(BIORAD公司)。

1.2 蜜蜂

試驗(yàn)蜜蜂均取自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。從3個(gè)蜂群中取3張意蜂子脾，放進(jìn)限王產(chǎn)卵框中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度34.5℃，相對(duì)濕度70%)，每天使用熒光標(biāo)記筆標(biāo)剛出房意蜂，標(biāo)記后放入蜂群中進(jìn)行飼養(yǎng)。

抓取哺育蜂(8日齡)，在意蜂飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng)，每盒20頭意蜂，抓取6盒意蜂(對(duì)照組、處理組各3盒)，置于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度30℃，相對(duì)濕度70%)用于接受低劑量吡蟲啉處理。另抓取8日齡意蜂6盒(每盒20頭)，低劑量吡蟲啉處理，記錄意蜂每天死亡數(shù)量，用于測(cè)定低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂存活率的影響。

1.3 低劑量吡蟲啉處理

吡蟲啉純品0.02 g溶于50 mL丙酮中制成400 ng/μL的吡蟲啉母液，使用50%蔗糖溶液稀釋吡蟲啉母液，處理組意蜂飼喂含有0.1 ng/μL吡蟲啉的50%蔗糖溶液，對(duì)照組意蜂飼喂含有等量丙酮的50%蔗糖溶液。每天更換蔗糖溶液并清理死亡意蜂。連續(xù)處理3 d和9 d后，液氮凍斃收取樣本，并將樣本放入-80℃冰箱中儲(chǔ)存，用于后續(xù)免疫、解毒基因表達(dá)及酶活力實(shí)驗(yàn)。

1.4 提取RNA及cDNA的合成

從對(duì)照組、處理組每個(gè)日齡樣本中各取3頭意蜂，使用TRIZOL法提取意蜂總RNA。使用NanoDrop 2000檢測(cè)RNA濃度并稀釋至1 000 ng/μL。配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL；gDNA Eraser 1 μL；總RNA 1 μL；ddH2O 6 μL；42℃反應(yīng)2 min。然向分別加入：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL；RT Primer Mix 1 μL ；5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL；ddH2O 4 μL；混勻放入PCR儀中37℃，15 min；85℃，5 s；4℃保存。

1.5 熒光定量PCR

在384微孔PCR板上配制如下的反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 5 μL；PCR上游引物、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL(表1)；DNA模板1 μL；滅菌水3.2 μL，共10 μL反應(yīng)體系。所有操作在冰上進(jìn)行，每個(gè)樣本做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)；4℃保存。

1.6 免疫解毒酶系活力的測(cè)定

1.6.1總蛋白提取

1 mL冰預(yù)冷PBS充分清洗蜜蜂樣本2次，500 g離心5 min，棄上清液；加入1 mL TPEB(Total Protein Extraction Buffer)震蕩勻漿，冰上孵育30 min，每隔10 min震蕩搖勻一次；4℃，14 000 g離心10 min，收集上清液，保存于-80℃冰箱中。

1.6.2蛋白濃度測(cè)定

用PBS緩沖液將BSA Standard solution標(biāo)準(zhǔn)品(2 mg/mL)稀釋為1 000、750、500、250、125、25 μg/mL等，取4 μL稀釋后的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和檢測(cè)樣品溶液加入到96微孔板中；每孔各加入200 μL復(fù)溫的Bradford Dye Reagent，混勻后在室溫下反應(yīng)5 min；把96微孔板放入酶標(biāo)儀 595 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物對(duì)序列信息

1.6.3酶活力測(cè)定

采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定意蜂體內(nèi)CYP450含量，PPO酶活力，CAT酶活力和SOD酶活力，參考試劑盒方法進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 9.0軟件繪制生存函數(shù)Kaplan-Meier對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，構(gòu)建意蜂的生存曲線圖表。本研究以RP49為內(nèi)參基因，采用比較CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)定量(目的基因表達(dá)量=2-△△Ct)，并運(yùn)用SPSS軟件中獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)各組意蜂的基因相對(duì)表達(dá)量及酶活力進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂存活的影響

8日齡哺育蜂飼喂含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液3 d和9 d后與對(duì)照組存活率無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明哺育蜂自由取食3 d和9 d的含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液對(duì)其沒(méi)有造成致死毒性，8日齡工蜂飼喂含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液11 d后與對(duì)照組存活率有顯著差異(P<0.05)，表明長(zhǎng)期取食含吡蟲啉的蔗糖溶液會(huì)對(duì)其造成致死毒性。

圖1 0.1 ng/μL吡蟲啉處理不同時(shí)間后意大利蜜蜂哺育蜂的存活率Fig.1 Survival rate of nurse bees of Apis mellifera ligustica after exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for different time注：8日齡意蜂抓出籠養(yǎng)，處理組飼喂含0.1 ng/μL吡蟲啉的50%蔗糖溶液，對(duì)照組飼喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液。圖2和圖3同。Note：The 8 day-old adult bees were caught and raised in cages. In the treatment group, the bees were fed with 50% (w/v) sucrose solution containing 0.1 ng/μL of imidacloprid ad libitum, while in the control group the bees were fed with 50% (w/v) sucrose solution containing 0.1 ng/μL of acetone ad libitum. The same for Fig.2 and Fig.3.

2.2 低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液3 d后與對(duì)照組相比(圖2)，CYB5612-like、UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin、Glucosedehydrogenase、PPOA3均出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，其中UDP-glucuronosyltransferase2C1、Abaecin與GlucoseDehydrogenase有顯著上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)；8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液9 d后與對(duì)照組相比CYB5612-

圖2 0.1 ng/μL吡蟲啉處理3 d與9 d后意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因的表達(dá)Fig.2 Relative expression levels ofimmune and detoxification related genes in nurse bees of Apis mellifera ligustica exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for 3 d and 9 d注：A，CYB561 2-like；B，UDP-glucuronosyltransferase 2C1；C，CYP450 6a2；D，Abaecin；E，Glucose dehydrogenase；F，PPOA3. 圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)，圖形柱上星號(hào)表示兩組間差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。圖3同。Note：Data in the figure are mean±SE(n=3). The single asterisk indicate significant difference (P<0.05) between the two groups by T-test. The same for Fig.3.

like、UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin、Glucosedehydrogenase、PPOA3均出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，其中UDP-glucuronosyltransferase2C1、CYP4506a2、Abaecin與GlucoseDehydrogenase有顯著上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。

2.3 低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒酶系活力的影響

8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液3 d后與對(duì)照組相比(圖3)，CYP450含量出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，CAT酶與SOD酶活力均有顯著下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)；8日齡哺育蜂自由取食含0.1 ng/μL吡蟲啉的蔗糖溶液9 d后與對(duì)照組相比，CYP450含量，PPO，CAT與SOD酶活力均有顯著下調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。

圖3 0.1 ng/μL吡蟲啉處理3 d與9 d后意大利蜜蜂哺育蜂免疫解毒酶系活力Fig.3 Specific activity of immune and detoxification in nurse bees of Apis mellifera ligustica exposed to 0.1 ng/μL imidacloprid for 3 d and 9 d 注：A，PPO；B，CYP450；C，CAT；D，SOD.

3 結(jié)論與討論

隨著殺蟲劑的廣泛使用，其對(duì)蜜蜂影響的相關(guān)研究也逐步增多，殺蟲劑不僅影響采集蜂的健康，蜜蜂采集歸巢后，殺蟲劑還會(huì)影響幼蟲、內(nèi)勤蜂、蜂王的健康(Chaimaneeetal., 2016; Gong and Diao, 2017; Tesovniketal., 2019)，哺育蜂在蜂群中扮演重要角色，承擔(dān)著哺育幼蟲、飼喂蜂王的重任，哺育蜂的質(zhì)量關(guān)系到蜂群的群勢(shì)與健康(Winston, 1991)。本實(shí)驗(yàn)主要探究低劑量吡蟲啉脅迫對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂的影響，實(shí)驗(yàn)條件下0.1 ng/μL吡蟲啉連續(xù)飼喂8日齡意蜂3 d與9 d對(duì)意蜂的存活率沒(méi)有顯著影響，連續(xù)飼喂11 d對(duì)意蜂的存活率有顯著影響，與候夢(mèng)賞(2019)關(guān)于吡蟲啉對(duì)內(nèi)勤蜂的研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)室條件下，亞致死劑量吡蟲啉短期脅迫對(duì)意蜂哺育蜂的存活沒(méi)有顯著影響，長(zhǎng)期脅迫對(duì)意蜂哺育蜂的存活有顯著影響。

與哺乳動(dòng)物不同，昆蟲只存在先天免疫，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。二者在昆蟲免疫系統(tǒng)中扮演重要角色，昆蟲主要依賴這兩類免疫體系抵御外源性致病因子(Kleinoetal., 2014)。蜜蜂通過(guò)基因表達(dá)、蛋白酶反應(yīng)，共同參與對(duì)農(nóng)藥等外源性物質(zhì)的代謝(Mohamedetal., 2015；Cizeljetal., 2016)。CYB561 2-like是細(xì)胞色素b561家族基因中一員，其主要功能是參與細(xì)胞防御機(jī)制及應(yīng)答環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的刺激(Zamanianetal., 2012)。UDP-glucuronosyltransferase2C1編碼的酶在催化過(guò)程中，大大提高受體分子的水溶性，促進(jìn)葡萄糖醛酸從體內(nèi)的外排，參與體內(nèi)免疫機(jī)制。(Goonetal., 1992)，CYP450基因家族在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育及防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Dereckaetal., 2013)，Abaecin在脅迫狀態(tài)下能夠編碼特定抗菌肽，是體液免疫基因家族中重要組成部分。(Evansetal., 2006)；Glucosedehydrogenase能夠編碼葡萄糖脫氫酶，該酶能夠殺死病原菌，參與蜜蜂細(xì)胞免疫過(guò)程(Cox-Foster and Stehr, 1994)。PPOA3通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯多酚氧化酶，在蜜蜂生長(zhǎng)過(guò)程中扮演重要角色(Tesovniketal., 2019)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0.1 ng/μL吡蟲啉飼喂意蜂9 d后UDP-glucuronosyltransferase2C1，CYP4506a2，Abaecin，Glucosedorydrogenase表達(dá)量均具有顯著下調(diào)，這與Tesovnik等(2019)人的研究具有類似的結(jié)果。從基因水平揭示亞致死劑量吡蟲啉脅迫下，可以引起蜜蜂的解毒代謝機(jī)制，長(zhǎng)期的接觸則會(huì)負(fù)面影響意蜂的免疫解毒功能，進(jìn)而影響意蜂的生存健康。此外，吡蟲啉與其它生物性致病因子協(xié)同作用，加劇對(duì)蜜蜂的危害。亞致死劑量吡蟲啉脅迫下，意蜂體內(nèi)微孢子蟲感染量顯著增加，蜜蜂健康水平下降更顯著(Judyetal., 2012)。亞致死劑量吡蟲啉脅迫后，瓦螨對(duì)蜜蜂健康造成更大的危害，說(shuō)明在吡蟲啉脅迫下蜜蜂免疫機(jī)制受到損害，進(jìn)而影響意蜂的抗螨能力(Tesovniketal., 2019)。

細(xì)胞色素P450酶系、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是蜜蜂體內(nèi)重要的解毒酶系，在抵抗殺蟲劑的脅迫中發(fā)揮著重要功能。多酚氧化酶參與調(diào)節(jié)昆蟲各種生理活動(dòng)，包括變態(tài)發(fā)育、免疫機(jī)制等。(Andersen, 2010)，細(xì)胞色素P450酶系參與蜜蜂外源解毒，在昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育及防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Igaand Kataoka, 2012)。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶二者功能是清除昆蟲體內(nèi)過(guò)剩的活性氧，保護(hù)機(jī)體免遭環(huán)境脅迫的危害(Mccord and Fridovich, 1969; Bolter and Chefurka, 1990)，Li等(2017)使用亞致死劑量吡蟲啉處理意蜂，在48 h內(nèi)檢測(cè)解毒酶系活力的變化，而本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)到9 d，并且與對(duì)照組相比以上4種酶活性均顯著下調(diào)，進(jìn)一步說(shuō)明亞致死劑量吡蟲啉脅迫下抑制意蜂解毒酶系活力，導(dǎo)致蜜蜂對(duì)吡蟲啉的代謝能力下降，大量的吡蟲啉蓄積在體內(nèi)可能會(huì)影響蜜蜂的健康和行為表現(xiàn)。蜜蜂在吡蟲啉脅迫下出現(xiàn)嗅覺(jué)學(xué)習(xí)障礙，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂腦部細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)程度的細(xì)胞凋亡和自噬現(xiàn)象，對(duì)蜜蜂食欲行為的不同方面都有不良影響，以及對(duì)食物分配、嗅覺(jué)信息傳播和巢內(nèi)任務(wù)協(xié)調(diào)都有影響。(吳艷艷等, 2014; Lietal., 2019; Carolina Mengoni Goalons and Farina, 2019)

綜上，本研究通過(guò)存活率、免疫解毒相關(guān)基因表達(dá)和免疫解毒酶系活力3個(gè)層面探索低劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂哺育蜂的影響。結(jié)果表明低劑量吡蟲啉脅迫影響意蜂哺育蜂免疫解毒相關(guān)基因的表達(dá)及免疫解毒酶系活力，長(zhǎng)期脅迫影響意蜂生存。亞致死劑量吡蟲啉對(duì)意大利蜜蜂行為、代謝和生理影響仍需在自然條件下做進(jìn)一步研究。