何旺青，譚梓雅，陳鈺，周敏，常樂(lè)，姜淼，姜志勝

（1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)心血管疾病研究所，南華大學(xué)動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南華大學(xué)動(dòng)脈硬化性疾病湖南省國(guó)際科技合作創(chuàng)新基地，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站，湖南衡陽(yáng)421001；3.南華大學(xué)生物信息與醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)教研室，湖南衡陽(yáng)421001）

蛋白質(zhì)硝基化修飾指的是蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基硝化生成3-硝基酪氨酸（3-Nitrotyrosine，3-NT）。在各種病理?xiàng)l件下，炎性介質(zhì)可以誘導(dǎo)多種活性氧（O2-、OH-、H2O2、ONOO-等）和活性氮（NO、NO2-、N2O3等）的產(chǎn)生，其中超氧陰離子（O2-）與NO的反應(yīng)速度是正常情況下與超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）反應(yīng)速度的3倍以上，因此NO首先捕捉O2-以較快速度生成過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO-），其氧化能力比起單獨(dú)存在的O2-和NO均顯著提高。ONOO-可以與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝化反應(yīng)生成3-NT。3-NT的生成除了可通過(guò)非選擇性的ONOOˉ依賴途徑外，還可以通過(guò)各種過(guò)氧化物酶（如髓過(guò)氧化物酶）、過(guò)氧化氫酶依賴的途徑介導(dǎo)[1]。蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸硝基化修飾后，可能引起其功能受損或者酶活性下降。更嚴(yán)重的情況下可能導(dǎo)致線粒體、DNA損傷，抑制酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和壞死[2]。近年來(lái)，隨著對(duì)蛋白質(zhì)硝基化研究的深入，發(fā)現(xiàn)在許多臨床疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、肺癌等的病變組織中都可以檢測(cè)到3-NT水平升高，這提示3-NT與多種疾病密切相關(guān)。

1 蛋白質(zhì)硝基化修飾與臨床疾病的關(guān)系

1.1 動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的特點(diǎn)是受累動(dòng)脈的病變從內(nèi)膜開(kāi)始，先后出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積、纖維組織增生和鈣質(zhì)沉著，并伴有動(dòng)脈中層的逐漸退變和鈣化，在此基礎(chǔ)上并發(fā)有斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂、局部血栓形成。該病的病因尚未完全明確，研究表明為多因素作用于疾病發(fā)展的不同環(huán)節(jié)所致。同樣，有多種學(xué)說(shuō)從不同角度闡述AS的發(fā)病機(jī)制，目前主流學(xué)說(shuō)包括脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮損傷-反應(yīng)學(xué)說(shuō)、血小板和血栓形成假說(shuō)、平滑肌克隆學(xué)說(shuō)以及氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等。

臨床研究表明，體內(nèi)蛋白質(zhì)硝基化水平的升高，可以作為動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)性的獨(dú)立指標(biāo)，且AS患者組織細(xì)胞內(nèi)3-NT含量是正常人體內(nèi)的90倍，蛋白質(zhì)硝基化修飾通過(guò)多種途徑參與AS的發(fā)生發(fā)展。載脂蛋白A-Ⅰ（Apoliopoprotein A-Ⅰ，ApoA-Ⅰ）作為高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein，HDL）的主要組成蛋白質(zhì)之一，在AS患者血液中可以檢測(cè)到發(fā)生髓過(guò)氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）介導(dǎo)的硝基化修飾[3]，并且在AS患者胸主動(dòng)脈內(nèi)膜部位也可以檢測(cè)到硝基化修飾的HDL，實(shí)驗(yàn)證明硝基化修飾的HDL介導(dǎo)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的能力顯著降低[4]。硝基化修飾的低密度脂蛋白（Low-Density Lipoprotein，LDL）是氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）的主要成員之一，經(jīng)巨噬細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞清道夫受體攝取，是AS斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞的主要形成原因[5]。動(dòng)脈粥樣硬化的不同時(shí)期，在巨噬細(xì)胞豐富的損傷部位都可檢測(cè)到3-NT，且3-NT在不穩(wěn)定性斑塊中的表達(dá)較在穩(wěn)定性斑塊中的表達(dá)明顯增加[6]。血管平滑肌細(xì)胞的遷移是動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，有研究證實(shí)，游離的3-NT可以通過(guò)激活人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（AoSMC）的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶和ERK1/2信號(hào)通路，以及上調(diào)與細(xì)胞遷移緊密相關(guān)的一些因子（如血小板衍生生長(zhǎng)因子受體B、基質(zhì)金屬蛋白酶2等）的mRNA及蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)AoSMC的遷移 以及AS發(fā)生與發(fā)展[7]。

綜上，蛋白質(zhì)硝基化修飾參與AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，但多數(shù)實(shí)驗(yàn)均只證明了其與AS的相關(guān)性，3-NT是AS的成因還是其標(biāo)志，目前仍有很大的爭(zhēng)論。

1.2 糖尿病

糖尿病患者由于機(jī)體內(nèi)胰島素產(chǎn)生不足或利用障礙，導(dǎo)致機(jī)體糖代謝紊亂，出現(xiàn)持續(xù)性的高血糖。血糖升高會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)受損，產(chǎn)生過(guò)量的自由基。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在糖尿病動(dòng)物模型中，線粒體蛋白質(zhì)上發(fā)生硝基化修飾的酪氨酸含量明顯偏高，這種修飾后的蛋白質(zhì)可能通過(guò)多種途徑促進(jìn)糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化可以導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙。胰島內(nèi)抗硝基酪氨酸免疫陽(yáng)性的細(xì)胞群主要為胰島β細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，且Ⅱ型糖尿病患者胰島素相比非糖尿病患者胰島培養(yǎng)基中分泌的胰島素水平明顯減低，而3-NT表達(dá)顯著增高，提示Ⅱ型糖尿病患者分泌胰島素功能與3-NT水平關(guān)系密切[8]。

蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化還可引起胰島素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而影響功能，體外ONOO-處理胰島素后發(fā)現(xiàn)，硝基化修飾的胰島素與受體的結(jié)合能力以及降低血糖的能力均顯著下降[9]。

蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化還可加速糖尿病并發(fā)癥發(fā)展，心血管病變、視網(wǎng)膜病變和腎臟病變是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，血管病變是其重要原因[10]。3-NT主要通過(guò)促進(jìn)氧化/硝化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)兩個(gè)方面引起糖尿病大血管病變。TURKO等[12]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，糖尿病高血壓小鼠主動(dòng)脈中3-NT蛋白的表達(dá)要明顯高于正常血壓糖尿病小鼠，且硝基化修飾后的琥珀酸輔酶A（氧代酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶，SCOT）的催化能力也顯著下降，可能參與糖尿病心肌病變的過(guò)程[11]。此外，RNS可能部分通過(guò)激活經(jīng)典的β-catenin/Wnt信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)糖尿病微血管滲漏和視網(wǎng)膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.3 3-NT與腦功能改變

蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平的硝化導(dǎo)致構(gòu)象的改變，破壞細(xì)胞骨架，導(dǎo)致神經(jīng)退化，可在阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森病、亨廷頓病等疾病中作為神經(jīng)退行性病變的促進(jìn)因子發(fā)揮作用[13]。

氧化應(yīng)激可能作為神經(jīng)退行性病變的主要根源，隨著年齡的增加，促進(jìn)年齡相關(guān)神經(jīng)退化[14]。在AD患者活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，NO與O2-表達(dá)均顯著上調(diào)，產(chǎn)生的ONOO-損害患者蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸[15]。Tau蛋白作為AD神經(jīng)纖維纏結(jié)的重要組成部分，發(fā)生硝基化修飾后可以明顯降低其微管結(jié)合能力，且3-NT修飾水平與AD患者認(rèn)知能力減退正相關(guān)[16]。輕度遺忘性認(rèn)知障礙（MCI）是正常衰老與癡呆和AD之間的過(guò)渡，有研究表明蛋白質(zhì)硝基化損傷發(fā)生在MCI過(guò)程的早期，并且蛋白質(zhì)硝化對(duì)于MCI轉(zhuǎn)化為AD可能很重要[17]。腦白質(zhì)高信號(hào)（WMHs）合并認(rèn)知功能改變組患者血漿3-NT濃度明顯要高于僅WMHs組[18]。腦小血管病患者血清中也具有較高的3-NT表達(dá)，而同時(shí)伴有認(rèn)知障礙的患者中血清3-NT更高，提示血清3-NT與認(rèn)知障礙密切相關(guān)[19]。

1.4 3-NT與呼吸系統(tǒng)疾病

肺作為呼吸系統(tǒng)的核心器官，出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷是肺癌發(fā)生的主要原因之一。NO參與肺癌患者氣道炎癥的形成，負(fù)性調(diào)控表面活性蛋白基因表達(dá)損傷組織，誘導(dǎo)慢性炎癥，增加細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)[20]，NO介導(dǎo)的蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化也在這一過(guò)程發(fā)揮了重要作用[21]。肺癌患者血清3-NT濃度相對(duì)正常人群偏高，吸煙也可以明顯增加血漿中3-NT的產(chǎn)生[22]。免疫組化和蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)顯示，與非腫瘤部分相比，肺鱗狀細(xì)胞癌與腺癌的癌組織硝基化酪氨酸水平顯著增加，且蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到25個(gè)具有3-NT的蛋白質(zhì)，包括代謝酶類、結(jié)構(gòu)蛋白以及抗氧化損傷的蛋白[23]。此外，在哮喘病人呼吸道上皮細(xì)胞中，也存在3-NT高表達(dá)，甚至在哮喘病人呼出的氣體中，也能夠檢測(cè)到3-NT。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，對(duì)于呼吸道致敏的小鼠，在氣管上皮細(xì)胞以及致敏的肺中都可以檢測(cè)到3-NT[24]。

但是蛋白質(zhì)硝基化修飾當(dāng)前更多地被當(dāng)作氧化損傷的標(biāo)志物，其是否介導(dǎo)肺部疾病病理進(jìn)程的改變還需要更多的研究進(jìn)行證實(shí)。

2 結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化與各類臨床疾病關(guān)聯(lián)緊密，無(wú)論是哪種臨床性疾病，活性氧的增加是蛋白質(zhì)硝基化修飾水平增強(qiáng)的共同特征。蛋白質(zhì)發(fā)生硝基化修飾后可以改變其結(jié)構(gòu)與功能，例如硝基化修飾可以使脂蛋白質(zhì)更容易被細(xì)胞攝取，可以使部分酶（如胰島素）功能下調(diào)或失活，還可以降低微管蛋白結(jié)合能力等，這些效應(yīng)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中可以發(fā)揮巨大的作用。

但當(dāng)前大部分研究均只證明了3-NT與某一疾病的相關(guān)性，很少針對(duì)3-NT的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行深入研究，這主要是由于細(xì)胞內(nèi)發(fā)生酪氨酸硝基化修飾的蛋白質(zhì)相對(duì)較少，同時(shí)與大規(guī)模篩選的策略欠缺相關(guān)。盡管近年來(lái)以生物質(zhì)譜技術(shù)為代表的鑒定技術(shù)不斷更新，但研究蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化修飾的難點(diǎn)仍然存在，需要探索出更多針對(duì)研究蛋白質(zhì)硝基化修飾參與疾病的機(jī)制與策略，以期為防治各類疾病提供新思路。