小葉白蠟成熟胚離體快繁技術(shù)研究

陳清霖

(遼寧林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110036)

小葉白蠟為木犀科白蠟屬落葉喬木，是第三紀闊葉殘遺樹種，擁有“闊葉林活化石”的美譽。樹干筆直，枝葉茂盛，樹形優(yōu)美，為速生樹種，極具觀賞價值，是園林綠化的優(yōu)良樹種[1]。隨著城市園林綠化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，小葉白蠟成為城市綠化的一道靚麗風景線，因此對小葉白蠟優(yōu)質(zhì)苗木的需求也逐年增加。但采用傳統(tǒng)方法播種育苗，培育周期長，且苗木易發(fā)生變異。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快，繁殖系數(shù)高，且不受季節(jié)限制，可廣泛應(yīng)用于一些特殊品種及瀕危樹種等，可以挽救瀕危樹種，滿足園林綠化生產(chǎn)苗木需求。近年來，關(guān)于白蠟屬植物的研究主要集中在器官發(fā)生途徑[2-10]、體胚發(fā)生途徑等方面[11-13]。為解決園林生產(chǎn)綠化用苗，快速獲得小葉白蠟優(yōu)質(zhì)苗木，本研究以小葉白蠟成熟種子的胚為外植體，通過不同消毒處理確定最適消毒時間，篩選出初代、增殖、生根階段的最佳培養(yǎng)基，建立小葉白蠟快繁體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為小葉白蠟成熟種子的胚。2018年9-10月在遼寧省北票市采種，種子去除其它雜質(zhì)后放在4 ℃冰箱中貯藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

成熟種子去翅后用洗衣粉水洗凈，清水浸泡種子1～2 h，然后流水沖洗0.5～1 h。將種子置于超凈工作臺上用70%酒精浸潤30 s，0.1%HgCl2消毒8、10、12 min，無菌水清洗5～7次，置于無菌濾紙上取出胚，分別接種于MS、WPM、DKW誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個處理20粒種子，重復(fù)3次，7 d后統(tǒng)計污染率和成活率。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

將長勢良好的無菌苗接種至繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基為WPM，分別附加6-BA(0.5、1.5、2.5 mg·L-1)、NAA(0.05、0.15、0.25 mg·L-1)、蔗糖20 g·L-1、瓊脂6 g·L-1。2周后觀察無菌苗生長情況，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)的無菌試管苗接種在生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。以WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加IBA 1.0 mg·L-1，IBA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1，光照條件下培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計生根率。

1.2.4 煉苗移栽

將小葉白蠟生根苗用流水沖洗掉根部瓊脂，然后快速蘸取多菌靈，移栽至草炭土∶蛭石=1∶1混合基質(zhì)中，2周后統(tǒng)計移栽苗成活率及生長狀況。

1.2.5 培養(yǎng)條件

光照強度1 500～2 000 lx，每天光照14 h，溫度(25±2)℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件處理，用SPSS 22.0軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對小葉白蠟無菌外植體的影響

從表1可以看出，隨著消毒時間延長，污染率均下降，消毒10 min的污染率最低15.2%，成活率最高84%，因此小葉白蠟種子最適宜的消毒方法為70%酒精消毒30 s、0.1%HgCl2消毒10 min。

表1 消毒時間對小葉白蠟外植體的影響

2.2 基本培養(yǎng)基種類對小葉白蠟誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

從表2可以看出，接種在WPM培養(yǎng)基內(nèi)的胚啟動較快，接種3～5 d后開始萌動，下胚軸開始出現(xiàn)白色胚根，然后逐漸伸長并逐漸轉(zhuǎn)綠，培養(yǎng)4周后開始展開為兩片綠色子葉，葉色正常，誘導(dǎo)率最高90%，因此WPM培養(yǎng)基為后續(xù)試驗的最佳基本培養(yǎng)基。

表2 基本培養(yǎng)基對小葉白蠟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.3 激素組合對繼代培養(yǎng)的影響

從表3可以看出，6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1處理的增殖系數(shù)最大，無菌苗生長狀況明顯優(yōu)于其他處理。因此，小葉白蠟增殖培養(yǎng)最佳激素組合為6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1。

表3 激素種類及濃度對小葉白蠟繼代培養(yǎng)的影響

2.4 激素組合對小葉白蠟生根培養(yǎng)的影響

從表4可以看出，添加NAA 0.5 mg·L-1、IBA 1.0 mg·L-1的生根率最高93%，平均生根數(shù)5.68條。添加IBA 1.0 mg·L-1處理的生根時間雖早，但主根細弱，后期生長緩慢。添加6-BA 0.5 mg·L-1可能抑制了根的生長。因此小葉白蠟最佳生根培養(yǎng)基為 WPM+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂6 g·L-1。

表4 激素組合對小葉白蠟無菌苗生根培養(yǎng)的影響

2.5 煉苗移栽

在培養(yǎng)室將組培瓶打開，讓無菌生根苗適應(yīng)外界環(huán)境，煉苗2～3 d后，用鑷子將無菌苗取出，用流水沖洗掉根部瓊脂，然后快速蘸取多菌靈，移栽至草炭土·蛭石=1·1基質(zhì)中，成活率82.3%，苗較高，葉片大而綠，無萎蔫及黃化現(xiàn)象，植株健壯。

3 結(jié) 論

小葉白蠟成熟種子用70%酒精浸潤30 s，然后用0.1%HgCl2消毒10 min，外植體污染率較低，成活率較高。選擇MS、WPM、DKW培養(yǎng)基對胚進行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)接種于WPM培養(yǎng)基的成熟胚誘導(dǎo)率達90%，葉色健康，苗生長正常。最佳增殖培養(yǎng)基WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1，增殖系數(shù)6.5，無菌苗長勢最好。最佳生根培養(yǎng)基為WPM+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1，無菌苗主根健壯，須根較多，平均生根數(shù)5.68條；將試管苗移栽至草炭土∶蛭石=1∶1基質(zhì)中，成活率可達82.3%，成功獲得小葉白蠟再生植株。