(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，重慶 400010)

脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，C N V)也稱為視網(wǎng)膜下新生血管(subretina l neovascularization，SRNV)，可出現(xiàn)在許多眼底疾病中，如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，病理性近視和脈絡(luò)膜撕裂等[1]。由于新生血管管壁的通透性較正常血管高，可引起反復(fù)出血及滲出，最終造成瘢痕形成甚至視力喪失，但目前臨床上尚無特殊的有效治療措施。其發(fā)生機(jī)制目前尚未完全明確，主要與缺氧、炎癥、視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞的衰老、Bruch膜老化及破裂、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積、玻璃膜疣的形成以及各種細(xì)胞因子的刺激有關(guān)[2]。

轉(zhuǎn)醛醇酶(transaldolase，TAL)是磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)非氧化階段的關(guān)鍵酶[3]，其主要調(diào)控PPP產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和5-磷酸核糖，前者廣泛參與生物體內(nèi)多種代謝反應(yīng)，充當(dāng)供氫體和還原當(dāng)量的角色，可維持谷胱甘肽(glutathione，GSH)保持還原狀態(tài)。因此，TAL是生物新陳代謝所必需的。已有研究[4-9]表明，TAL對(duì)氧化應(yīng)激、淋巴細(xì)胞凋亡、神經(jīng)多發(fā)性硬化、炎癥和惡性腫瘤等病理過程中有著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)小組前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TAL在已確診發(fā)生CNV的濕性AMD患者的淚液中表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05；未發(fā)表資料)，但其機(jī)制尚不明確。本研究進(jìn)一步探討TAL，NADPH和GSH在實(shí)驗(yàn)性CNV中表達(dá)的變化及TAL活性變化，嘗試發(fā)現(xiàn)TAL與CNV機(jī)制上可能的聯(lián)系，為研究CNV的機(jī)制以及治療靶點(diǎn)提供新的思考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

采用重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)BN大鼠20只，雄性，6～8周齡，體重200～250 g。TAL活性測(cè)定試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，大鼠TAL，NADPH，GSH和內(nèi)參β-Actin引物購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司，人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存，siRNA試劑盒、高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，DMED培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司，胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Capricorn公司，垂直電泳槽Mini Protean Tatra、凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，海德堡激光掃描眼底血管造影機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，多波長(zhǎng)激光機(jī)為美國(guó)科醫(yī)人Novus Varia Dpss，光學(xué)顯微鏡為OlympusBX50。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模

隨機(jī)將20 只B N 大鼠分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組：每組10 只(20 只眼)，其中對(duì)照組未做干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行造模。7%水合氯醛現(xiàn)配現(xiàn)用，0.7 mL/100 g，腹腔注射。復(fù)方托品卡胺滴雙眼散瞳，檢查大鼠眼前節(jié)及眼底均正常，氪離子激光治療機(jī)光凝選用參數(shù)531 nm，曝光時(shí)間0.1 s，光斑直徑100 μm，激光功率150 mW，圍繞視盤距視盤等距離視網(wǎng)膜處光凝5個(gè)點(diǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，造模后第21天麻醉散瞳后，兩組大鼠腹腔內(nèi)注射20%熒光素鈉0.1～0.2 mL進(jìn)行眼底熒光造影，觀察新生血管生成情況后摘除眼球，去除眼前節(jié)及玻璃體。

1.2.2 TAL 酶活性測(cè)定

參照Lachaise等[9]描述的方法改良，TAL活性為讀取NADH光密度衰變率參照TAL標(biāo)準(zhǔn)品活性得出。配置反應(yīng)終體系含有5 mmol/L 6-磷酸果糖，0.5 mmol/L 4-磷酸赤蘚糖，1.75 U/mL α-磷酸甘油脫氫酶，0.15 mmol/L NADH，10 U/mL磷酸丙糖異構(gòu)酶，加樣10～50 μg總蛋白，室溫下在340 nm處連續(xù)讀取吸光度30～60 min，至吸光度降為0.1～0.2為止。比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中TAL活性，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠眼內(nèi)TAL，NADPH和GSH 水平

提取大鼠R PE-Br uch膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體蛋白后，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組取蛋白40 μg進(jìn)行凝膠電泳，250 mA轉(zhuǎn)膜120 min；5%脫脂牛奶室溫下封閉60 min，TBST洗膜，每次10 min，共3次；4 ℃下孵育一抗過夜，洗膜10 min，共3次；室溫下孵育二抗60 min，洗膜10 min，共3次。β-Actin作為總蛋白定量?jī)?nèi)參照。免疫印跡結(jié)果經(jīng)ChemiDoc XRS圖像分析系統(tǒng)作半定量分析。

1.2.4 細(xì)胞來源及分組

采用本實(shí)驗(yàn)保存的人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞。分組為正常對(duì)照組，陰性對(duì)照組(加入LipofectamineTM2000稀釋液)，實(shí)驗(yàn)組(加入TALsiRNA/LipofectamineTM2000復(fù)合物)。

1.2.5 siRNA 轉(zhuǎn)染

根據(jù)制造商Invirogen提供的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞接種到6孔板，細(xì)胞匯合度需達(dá)80%～90%。用適量不包含血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋siRNA 寡聚物，并輕輕混勻。使用LipofectamineTM2000前輕輕混勻，稀釋適量試劑加入DME M無血清培養(yǎng)基中，輕輕搖動(dòng)混勻后在室溫下孵育5 min。將稀釋后的LipofectamineTM2000和稀釋后的siRNA寡聚物輕輕混勻，在室溫下孵育20 min，以形成復(fù)合物。將siRNA寡聚物/LipofectamineTM2000復(fù)合物2 mL加入包含ARPE-19細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，輕輕搖動(dòng)使之充分混合。正常對(duì)照組不做干預(yù)，陰性對(duì)照組中加入scrambled-siRNA 2 mL，在轉(zhuǎn)染后4～6 h更換新鮮培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)上述3組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后TAL，NADPH和GSH的蛋白表達(dá)，方法及步驟同前。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，2組間差異采用Student’st-test，3組以上的組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFA 結(jié)果

已有研究[10]表明，光凝造模后7 d大鼠開始出現(xiàn)CNV，21 d達(dá)到高峰，之后CNV變化不明顯，因此本研究選擇造模后21 d進(jìn)行眼底熒光造影。正常大鼠眼底造影顯示視網(wǎng)膜血管粗細(xì)均勻、管壁完整，血管周圍無熒光素滲漏；實(shí)驗(yàn)組可見5個(gè)圍繞視盤的激光斑，每處均出現(xiàn)明顯熒光滲漏，造影早期呈現(xiàn)高熒光，晚期熒光斑擴(kuò)散并持續(xù)不退(圖1)。

2.2 TAL 活性比較

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TAL活性的比較見表1，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中TAL活性較對(duì)照組中TAL活性明顯增強(qiáng)(P＜0.001)。

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)造模后大鼠RPE-Bruch 膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體中TAL，NADPH 和GSH 蛋白表達(dá)的結(jié)果

軟件密度掃描分析顯示實(shí)驗(yàn)組TAL的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上升(P=0.005)，NADHP和GSH的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降(P＜0.05，圖2)。

表1 正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TAL活性比較Table 1 Comparison of TAL activity between the control and experimental groups

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)siRNA 轉(zhuǎn)染后ARPE-19 細(xì)胞中TAL，NADPH 和GSH 蛋白表達(dá)的結(jié)果

軟件密度掃描分析顯示實(shí)驗(yàn)組TA L 的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降(P ＜0.01)，N A D H P 和G S H 的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上升(P ＜0.05，圖3)。

3 討論

CNV作為濕性AMD的主要特點(diǎn)，迄今尚無早期確診及治愈方法[11]。CNV發(fā)生發(fā)展過程中有年齡、免疫、光損傷、氧化應(yīng)激和遺傳等多種因素參與其中，RPE細(xì)胞在其中起著重要調(diào)控作用[12]。正常情況下，Bruch膜是兩種細(xì)胞間的重要屏障，濕性AMD患者的RPE細(xì)胞由于衰老等眾多因素，其吞噬和代謝光感受器外節(jié)膜盤的功能下降，胞漿中累計(jì)脂褐素不斷沉積在Bruch膜上，形成玻璃膜疣。多種因素同時(shí)作用使Bruch膜破裂，各種刺激因素可直接或間接作用于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(choroidal microvascular endothelial cells，CEC)，從而促使新生血管由脈絡(luò)膜長(zhǎng)入RPE下，形成CNV。

TAL是PPP中非氧化階段重要的關(guān)鍵酶，主要通過調(diào)控PPP途徑氧化和非氧化階段之間的平衡，從而調(diào)控PPP途徑的兩大產(chǎn)物：5-磷酸核糖和NADPH。其中，NADPH作為供氫體參與生物體內(nèi)的多種代謝反應(yīng)，充當(dāng)還原當(dāng)量的角色，維持GSH保持還原狀態(tài)。研究[13]表明：非氧化階段產(chǎn)生的還原當(dāng)量NADPH至少占總量的44%。總而言之，TAL作為非氧化階段的關(guān)鍵酶對(duì)于保證細(xì)胞新成代謝所需要的NADPH的供應(yīng)具有重要意義。已有研究[4-9]表明，TAL對(duì)HIV引起的氧化應(yīng)激、白血病、神經(jīng)多發(fā)性硬化、惡性腫瘤和細(xì)胞凋亡等疾病和病理過程中有重要作用，但目前尚未有TAL在CNV中的研究文獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)小組前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TAL在已確診發(fā)生CNV的濕性AMD患者淚液中表達(dá)顯著上調(diào)，因此，深入研究TAL在CNV發(fā)生發(fā)展過程中的作用及可能的調(diào)控機(jī)制，將有助于揭發(fā)CNV的病理機(jī)制，并將為CNV的防治提供新思考。

本研究發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組大鼠TAL活性及蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并且NADPH和GSH的蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組。推測(cè)在CNV發(fā)生發(fā)展過程中，TAL可能通過影響PPP途徑減少NADPH和GSH的產(chǎn)生并增強(qiáng)眼底氧化應(yīng)激。Banki等[5,13]發(fā)現(xiàn)TAL的過表達(dá)降低了6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，從而減少了NADPH和GSH的產(chǎn)生，使細(xì)胞易對(duì)凋亡信號(hào)敏感而發(fā)生凋亡，增強(qiáng)了人Jurkat白血病T細(xì)胞系的氧化應(yīng)激。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)[5]證明，在TALsiRNA轉(zhuǎn)染后的ARPE-19細(xì)胞中，TAL蛋白表達(dá)下調(diào)的同時(shí)增強(qiáng)了NADPH和GSH的蛋白表達(dá)水平。由此推斷，TAL可通過PPP途徑影響NADPH和GSH的表達(dá)。

A MD的主要病變區(qū)在黃斑部，組織病理學(xué)研究[14]表明，患病早期病變區(qū)的光感受器就受到不同程度的損害。視錐細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rod derived cone survival factor，RdCVF)是一種硫氧還蛋白樣蛋白，Cronin等[15]發(fā)現(xiàn)RdCVF的破壞會(huì)導(dǎo)致光感受器功能障礙以及增加氧化應(yīng)激的易感性。而NADPH是硫氧還蛋白還原酶的輔助因子，對(duì)于還原RdCVF是必需的：RdCVF一旦被氧化，就只能被硫氧還蛋白還原酶還原[16]。因此推測(cè)TAL還可能通過PPP影響NADPH的生成，從而導(dǎo)致氧化型RdCVF還原障礙，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。還原型GSH是細(xì)胞質(zhì)中由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸殘基組成的一種三肽，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。已有研究[17]表明，還原型GSH在視網(wǎng)膜光損傷中起重要保護(hù)作用，保護(hù)細(xì)胞免受過量脂質(zhì)過氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組中GSH的含量明顯低于對(duì)照組，說明GSH的減少確實(shí)存在于CNV的發(fā)生發(fā)展過程中，而NADPH作為GSH還原酶的輔酶，其表達(dá)下調(diào)使氧化型GSH不能被還原，使視網(wǎng)膜失去GSH的保護(hù)作用，從而加劇CNV的發(fā)生發(fā)展。然而，在缺氧條件下RPE細(xì)胞中TAL，NADPH和GSH的蛋白表達(dá)是否有變化，需要進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TAL在大鼠CNV模型中蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)且活性有顯著提高，同時(shí)減少了眼內(nèi)NADPH和GSH的表達(dá)水平；在TALsiRNA轉(zhuǎn)染后的ARPE-19細(xì)胞中，TAL的表達(dá)下調(diào)同時(shí)增強(qiáng)了NADPH和GSH的表達(dá)水平。揭示TAL可能通過影響PPP途徑減少NADPH和GSH的表達(dá)，增強(qiáng)眼內(nèi)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，從而參與CNV的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)首次在大鼠CNV模型中研究TAL的活性及蛋白質(zhì)表達(dá)變化，結(jié)果與我們前期研究已確診發(fā)生CNV的濕性AMD患者淚液中TAL的蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致(未發(fā)表資料)，并驗(yàn)證了TAL與NADPH和GSH的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的關(guān)系，為探索CNV的發(fā)生機(jī)制及尋找治療靶點(diǎn)提供了新的思考。