朱 慧， 李嘉文， 繩秀珍**， 唐小千， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌, 2

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003;2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)隸屬于弧菌屬(Vibrio)，是一種致病性革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于海水和海洋環(huán)境中，可引起海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物流行病并導(dǎo)致暴發(fā)性死亡，已成為海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌之一，給海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。海產(chǎn)品中的副溶血弧菌也是常見的引起食物中毒或食源性疾病的重要病原菌[4-6]。副溶血弧菌的快速檢測(cè)是預(yù)防和控制該病原菌傳播及食源性中毒或疾病發(fā)生的關(guān)鍵。

目前，已見報(bào)道的副溶血弧菌檢測(cè)方法主要有檢測(cè)病原核酸的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR等[7-10]，這些技術(shù)各有優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)用性上有一定的局限，耗時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜，需要專業(yè)設(shè)備，基層的普通養(yǎng)殖人員難以完成檢測(cè)操作。近年來發(fā)展起來的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，有學(xué)者建立了副溶血弧菌Real-time RPA技術(shù)[11]，該技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短，但是需要提取檢測(cè)病原的核酸，仍然不能滿足現(xiàn)場(chǎng)使用的需求。副溶血弧菌免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)已有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫熒光抗體技術(shù)[12-13]，也需要操作經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)儀器設(shè)備。膠體金免疫層析試紙具有易于攜帶、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果肉眼可見、不需要專業(yè)設(shè)備、適用于現(xiàn)場(chǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種十分有發(fā)展前景的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)，已在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，但是，水產(chǎn)動(dòng)物病原的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試紙尚未得到很好地開發(fā)，關(guān)于副溶血弧菌膠體金快速檢測(cè)試紙的資料較少[14]。

細(xì)菌是多種抗原成分組成的復(fù)合體，不同病原菌之間可能存在的共同抗原蛋白會(huì)導(dǎo)致交叉免疫反應(yīng)性，因此，排除交叉反應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果判定的干擾是免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)病原時(shí)需要解決的關(guān)鍵問題。我們前期曾制備了魚類病原性溶藻弧菌快速檢測(cè)試紙[15]，能夠準(zhǔn)確鑒別溶藻弧菌感染及其與其他菌的交叉反應(yīng)。為了滿足副溶血弧菌快速檢測(cè)的需求，本文制備了兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，標(biāo)記20 nm膠體金后制得金標(biāo)墊，提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白，將不同濃度的4種抗原蛋白作為4條檢測(cè)線，特別在T4線設(shè)置全菌蛋白，以羊抗兔IgG作為質(zhì)控線，基于競(jìng)爭(zhēng)免疫層析技術(shù)制備了副溶血弧菌膠體金快速檢測(cè)試紙，對(duì)患病牙鲆組織的檢測(cè)結(jié)果顯示其能夠準(zhǔn)確鑒別副溶血弧菌感染。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、魚腸道弧菌(V.ichthyoenteri)、鰻弧菌(V.anguillarum)、哈維氏弧菌(V.harveyi)由本實(shí)驗(yàn)室保存。6周齡純種雌性新西蘭大白兔購自青島市藥品檢驗(yàn)所。

1.2 副溶血弧菌多抗制備及效價(jià)測(cè)定

1.2.1副溶血弧菌兔多抗制備與純化 副溶血弧菌使用LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后用福爾馬林滅活。用0.01 mol·mL-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH= 7.4)調(diào)整菌體濃度至1.0×108cfu·mL-1，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩缁罹悍?次免疫純種新西蘭大白兔，初次免疫將滅活菌液混入弗氏完全佐劑(1∶1, v/v)，背部6點(diǎn)皮下注射；1周后，將滅活菌液與弗氏不完全佐劑混勻(1∶1)，背部皮下注射免疫；間隔2周后重復(fù)免疫1次，然后在1周后耳緣靜脈注射滅活菌液。最后一次免疫1周后取血，將血液置于離心管中，室溫靜置1 h后，4 ℃過夜。次日，3 500×g離心15 min，取上清即為抗血清。

運(yùn)用辛酸-硫酸銨法對(duì)兔抗血清進(jìn)行純化?？寡逵?.06 mol·mL-1乙酸緩沖液(pH=4.0；1∶4，v/v)稀釋， 然后用0.1 mol·mL-1NaOH調(diào)整血清稀釋液pH至4.5；室溫下，用電磁攪拌器邊攪拌邊緩慢滴加辛酸，1 mL血清稀釋液中加入25 μL辛酸，攪拌30 min。將混合液離心，收集上清并用45 pm微孔濾膜過濾，加入10%的無菌PBS，用5.0 mol·mL-1NaOH調(diào)整pH至7.4。冰浴條件下，按0.277 g·mL-1的終濃度緩慢加入硫酸銨粉末并攪拌均勻，4 ℃靜置過夜。次日，在4 ℃下離心，收集沉淀并用少量無菌PBS溶解，超純水中透析24 h；凍干后，將粉末用無菌PBS重懸至合適濃度并通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析純化的兔多抗，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 副溶血弧菌兔多抗效價(jià)測(cè)定 利用ELISA技術(shù)測(cè)定兔抗副溶血弧菌多抗的效價(jià)。在96孔酶標(biāo)板中加入100 μL濃度為5×107cfu·mL-1副溶血弧菌菌液，包被過夜，次日用含0.05% Tween-20的PBST洗滌，每孔加入200 μL的3%牛血清白蛋白(BSA)，37 ℃封閉1 h；PBST再次洗滌后，每孔加入100 μL梯度稀釋的副溶血弧菌兔多抗，設(shè)置3個(gè)平行， PBS為陰性對(duì)照，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌后，每孔加入100 μL堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌，再加入200 μL底物顯色液，避光發(fā)色5 min后酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值。

1.3 副溶血弧菌抗原組分的提取

1.3.1 外膜蛋白的提取 副溶血弧菌外膜蛋白的提取參考熊焰等的方法[16]。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的副溶血弧菌離心，無菌PBS洗滌后重懸至原菌液體積1/25，加入少量10%蔗糖，室溫下混勻后，置于-20 ℃下作用15 min；取出混合液，加入等體積0.4% Triton-X100，攪拌混勻作用30 min，10 000 ×g離心30 min，取上清并用0.45 pm微孔濾膜過濾，冰浴條件下緩慢加入2.5倍體積冷無水乙醇(4 ℃)，-20 ℃靜置過夜；次日，混合液于4 ℃、10 000×g離心30 min，沉淀經(jīng)過Tris-NaCl洗滌重懸后，加入等體積0.6 mol·L-1碘化鉀溶液，37 ℃作用1 h后離心，取上清于冰浴條件下加入2.5倍體積4 ℃的無水乙醇， -20 ℃靜置過夜。次日，將混合液4 ℃下離心，無菌PBS重懸沉淀，采用上述 SDS-PAGE分析外膜蛋白。SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠放在CuCl2可逆染色液中染色，黑背景光照條件下觀察蛋白帶，切取主要蛋白條帶，于脫色液中脫色，超純水沖洗膠條3次。將膠條切成小塊后裝入透析袋中，加入洗脫緩沖液，置于水平電泳儀中恒流40 mA電泳8 h。電泳結(jié)束后，逆轉(zhuǎn)電流電泳5 min，吸出洗脫緩沖液，超純水中透析24 h。凍干后，無菌PBS溶解，Bradford法[17]測(cè)定濃度，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鞭毛蛋白的提取 副溶血弧菌鞭毛蛋白的提取參考張曉佩等[18]方法并略有改動(dòng)。將培養(yǎng)的副溶血弧菌離心后，用無菌0.01 mol·mL-1PBS洗滌并重懸至原菌液體積的1/20；用1.0 mol·mL-1鹽酸將菌液的pH調(diào)整至2.0，室溫?cái)嚢?0 min，然后4 ℃、1 500 ×g離心30 min，取上清液4 ℃、533 000×g離心1 h，用1 mol·mL-1NaOH調(diào)整上清液pH至7.2。在冰浴條件下，加入硫酸銨粉末至終濃度為2.67 mol·mL-1，攪拌30 min，4 ℃靜置過夜。次日，4 ℃下再次離心15 min，取沉淀溶于無菌PBS中，SDS-PAGE分析后，切膠回收主要條帶蛋白，洗脫收集蛋白，超純水中透析24 h。凍干后，粉末溶于PBS中，Bradford法測(cè)定濃度。

1.3.3 胞外產(chǎn)物的提取 根據(jù)Inamura等[19]的方法提取副溶血弧菌的鞭毛蛋白。副溶血弧菌于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL的液體培養(yǎng)物在每個(gè)預(yù)先放置了一層賽璐玢的LB瓊脂平板上涂布均勻，37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h；每個(gè)平板用無菌PBS洗下菌體；收集菌懸液，在4 ℃下7 000×g離心30 min，收集上清。冰浴條件下，加入硫酸銨粉末至終濃度為2.0 mol·mL-1，攪拌后4 ℃放置過夜。次日，4 ℃下10 000×g離心1 h，無菌PBS重懸沉淀，SDS-PAGE分析后，切膠回收主要條帶蛋白，洗脫收集蛋白，用超純水透析24 h。凍干后，無菌PBS調(diào)至合適濃度，Bradford法測(cè)定濃度，-80 ℃凍存。

1.3.4 全菌破碎蛋白的制備 將副溶血弧菌濃度調(diào)至1×108cfu·mL-1，超聲波破碎儀破碎(Sonics & Materials；振幅39%；pulse on，3 s；pulse off，3 s)至液體澄清，即為副溶血弧菌破碎蛋白。然后，超純水中透析、凍干，粉末用PBS溶解，Bradford法測(cè)定濃度，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA法分析免疫交叉反應(yīng)

為了分析副溶血弧菌兔多抗與其他弧菌的交叉反應(yīng)性，同樣方法提取了溶藻弧菌、魚腸道弧菌、哈維氏弧菌、鰻弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌破碎蛋白，運(yùn)用間接ELISA分析副溶血弧菌兔多抗與這些抗原蛋白的免疫反應(yīng)。將抗原蛋白分別于96孔酶標(biāo)板中4 ℃過夜，每種蛋白設(shè)3個(gè)平行，以無菌0.01 mol·mL-1PBS作為陰性對(duì)照；次日， PBST洗滌3次，加入3% BSA，于37 ℃封閉1 h，PBST洗滌后加入兔抗副溶血弧菌多抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后加入100 μL AP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶8 000)，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，加入底物顯色液，暗處反應(yīng)10～20 min，然后加入2 mol·mL-1NaOH溶液終止顯色反應(yīng)， 405 nm處檢測(cè)OD值。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔與陰性對(duì)照光吸收值之比(P/N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)為陽性。計(jì)算4種抗原蛋白間的P/N值，繪制“P/N值-抗原蛋白”直方圖，根據(jù)直方圖分析免疫交叉。

1.5 膠體金最適標(biāo)記蛋白濃度的確定及金標(biāo)抗體的制備

按照我們前期使用的方法制備膠體金[15]，透射電鏡觀察確定膠體金顆粒大小一致，形態(tài)呈橢球形或球形，無聚團(tuán)現(xiàn)象后用于實(shí)驗(yàn)。用0.1 mol·mL-1碳酸鉀溶液和0.1 mol·mL-1鹽酸將制得的20 nm膠體金pH調(diào)至8.4[15]，然后將膠體金設(shè)置10個(gè)濃度梯度(分別為1～10 μg·mL-1)，每個(gè)濃度取出1 mL膠體金，分別加入10 μL不同濃度的副溶血弧菌兔多抗，迅速混勻，室溫下靜置30 min后加入10 μL 5% 的NaCl，混勻后室溫靜置2 h。分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)濃度梯度在520 nm處的OD值，以O(shè)D值為縱軸、蛋白濃度為橫軸制作曲線圖，取曲線中OD值最大處對(duì)應(yīng)的兔多抗用量為穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量，在此基礎(chǔ)上加20%的蛋白標(biāo)記量即是最適合的蛋白標(biāo)記濃度。

用0.1 mol·L-1碳酸鉀將膠體金pH調(diào)至8.4[15]，按照確定的最合適標(biāo)記濃度加入副溶血弧菌兔多抗，攪拌20 min后于室溫下靜置10 min；用BSA調(diào)整使其終濃度為1%，然后攪拌15 min，室溫靜置10 min；4 ℃下1 200×g離心15 min，取上清液經(jīng)13 500×g(4 ℃)離心30 min。取沉淀，金標(biāo)多抗洗滌液(含1% BSA的0.01 mol·L-1PBS，pH=8.4)洗滌后離心，取沉淀，金標(biāo)多抗保存液(0.01 mol·L-1PBS中含3%蔗糖，1% BSA，0.2% Tween-20和0.02% NaN3，pH=8.4)重懸沉淀至原來體積的1/10，即為金標(biāo)兔抗副溶血弧菌多抗。

1.6 4條檢測(cè)線抗原蛋白特異性及劃線濃度的確定

利用間接ELISA法測(cè)定副溶血弧菌4種抗原蛋白在相應(yīng)檢測(cè)線上的劃線濃度。在96孔酶標(biāo)板中加入副溶血弧菌的4種抗原蛋白，每種蛋白設(shè)置3個(gè)平行，陰性對(duì)照為無菌PBS，4 ℃包被過夜；次日， PBST洗3次，然后用 3%的BSA于37 ℃封閉1 h；PBST洗滌后，加入副溶血弧菌兔多抗(1∶2 000)于37 ℃孵育1 h； PBST洗滌后，加入 AP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶8 000)于37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，加入底物顯色液放于暗處10～20 min，后加入NaOH溶液終止顯色反應(yīng)， 405 nm處檢測(cè)OD值。計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔與陰性對(duì)照孔的光吸收值之比(P/N)，P/N≥2.1顯示為陽性。計(jì)算4種抗原蛋白間的P/N比值，并根據(jù)P/N比值和蛋白包被濃度來確定劃線濃度。

1.7 副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

根據(jù)交叉反應(yīng)分析結(jié)果，將病原菌的多種抗原組分排列在一起時(shí)，它們能夠同時(shí)與該病原菌的抗體發(fā)生反應(yīng)，而其他菌只有共同抗原發(fā)生反應(yīng)。由此，將副溶血弧菌的4種抗原排列在一起作為4條檢測(cè)線(T1～T4，制備詳見1.8.1)，并將T4線設(shè)計(jì)為全菌蛋白，用金標(biāo)副溶血弧菌抗體制備金標(biāo)墊，羊抗兔IgG作為質(zhì)控抗體，設(shè)計(jì)副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙。利用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，待檢樣品中的副溶血弧菌會(huì)與檢測(cè)線上的抗原蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)墊上的金標(biāo)副溶血弧菌抗體，使檢測(cè)線上的抗原無法與金標(biāo)副溶血弧菌抗體反應(yīng)，檢測(cè)線全部不顯色；若待檢樣品中不含副溶血弧菌，檢測(cè)線上的抗原就會(huì)與金標(biāo)副溶血弧菌抗體結(jié)合，檢測(cè)線全部顯色；若待檢樣品中含有其他病原菌，只有其共同抗原與檢測(cè)線上的副溶血弧菌抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)抗體，部分檢測(cè)線不顯色。

1.8 副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙的制備

1.8.1 金標(biāo)墊及檢測(cè)層的制備 將玻璃纖維膜四周寬0.5 cm的邊緣整齊的裁剪掉，并將玻璃纖維膜裁成寬0.8 cm的小條。將新制備的金標(biāo)兔抗副溶血弧菌多抗用噴膜儀(Biodot，XYZ3060)均勻地噴涂在玻璃纖維膜小條上，冷凍干燥，避光封存?zhèn)溆谩?/p>

將副溶血弧菌4種抗原蛋白的濃度分別調(diào)至1.5節(jié)中所確定的劃線濃度，用噴膜儀將外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線T1、T2、T3和T4，4條檢測(cè)線之間相距1.5 mm。將0.5 mg·mL-1羊抗兔IgG噴涂于硝酸纖維膜上作為質(zhì)控線，與T4相距5 mm，靠近吸水墊，而檢測(cè)線T1靠近樣品墊(見圖1)。

1.8.2 試紙條的組裝 取出PVC底板，將準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊和吸水墊依次粘貼，組裝成試紙條整版。組裝示意圖如圖1所示，首先粘貼上硝酸纖維膜，其次是吸水墊和金標(biāo)墊，其中硝酸纖維膜的上端邊緣重疊于吸水墊邊緣之下，硝酸纖維素膜的下端邊緣覆蓋于金標(biāo)墊上端邊緣之下，最后組裝樣品墊(樣品墊的上端邊緣重疊在金標(biāo)墊的下端邊緣之上)。用切條機(jī)裁剪組裝好的試紙條，寬度設(shè)置為3.75 mm。裁剪好的試紙條裝入塑料卡盒中，密封于有干燥劑的鋁箔小袋中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(1.樣品墊；2.金標(biāo)墊；3～6.檢測(cè)線T1～T4(T線)，分別噴涂副溶血弧菌外膜蛋白(T1)、鞭毛蛋白(T2)、胞外產(chǎn)物(T3)和全菌蛋白(T4)；7. 硝酸纖維素膜(NC膜)；8. 質(zhì)控線(C線)；9. PVC底板；10.吸水墊。1. Sample pad；2. Glass fiber containing anti-V. parahaemolyticus polyclonal antibody；3～6. Outer membrane protein (T1), flagellum protein (T2), extracellular products (T3) and whole-cell bacterial protein (T4) of V. parahaemolyticus were used as test lines (T lines) respectively； 7. Nitrocellulose membrane；8. Control Line (C line); 9. PVC board；10. Absorption pad.)

1.9 檢測(cè)試紙的特異性

將副溶血弧菌、鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌分別離心純化，用無菌0.01 mol·mL-1PBS(pH=7.4)調(diào)至濃度為1×107cfu·mL-1，用PBS作為陰性對(duì)照，使用制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)，10 min后肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果并拍照，確定試紙的檢測(cè)特異性。

1.10 檢測(cè)試紙的靈敏性

用無菌0.01 mol·mL-1PBS(pH=7.4)將副溶血弧菌調(diào)至5×107、5×106、5×105、5×104cfu·mL-14個(gè)濃度，使用制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)，10 min后肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果并拍照，確定試紙的檢測(cè)靈敏性。

1.11 牙鲆組織中副溶血弧菌的檢測(cè)

取感染了副溶血弧菌發(fā)病的牙鲆肝、脾、腎組織混合，每1 g組織樣品用5 mL無菌PBS在冰浴條件下充分研磨3～5 min，用篩絹過濾得到的研磨液作為檢測(cè)樣品液，使用制備的副溶血弧菌檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)，健康的牙鲆組織液和無菌PBS分別作為陰性對(duì)照。

采用ELISA實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照，上述患病牙鲆的檢測(cè)樣品液為包被液，檢測(cè)牙鲆組織中的副溶血弧菌，確定快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 副溶血弧菌兔多抗的效價(jià)

純化的副溶血弧菌兔多抗包括IgG重鏈和輕鏈蛋白，說明純化抗體可用于膠體金檢測(cè)試紙的制備(見圖2 A的條帶)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(見表1)，副溶血弧菌兔多抗的稀釋倍數(shù)低于1×105時(shí)，其OD405值皆大于陰性對(duì)照PBS的OD405值的2倍，而當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為2×105時(shí)，OD405值小于陰性對(duì)照的OD405值的2倍，所以制備的副溶血弧菌兔多抗的效價(jià)為1×105。

(M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；A：副溶血弧菌兔多抗。M: Marker； A: Anti-V. parahaemolyticus polyclonal antibody.)

表1 副溶血弧菌兔多抗的效價(jià)

2.2 副溶血弧菌抗原組分SDS-PAGE分析結(jié)果

SDS-PAGE圖譜顯示(見圖 3)，副溶血弧菌外膜蛋白條帶主要位于42、38、36、32和26 kDa；鞭毛蛋白主要條帶位于72、 37和32 kDa；胞外產(chǎn)物主要條帶位于37、28、26、22和18 kDa。選取這些主要蛋白用作快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)線抗原蛋白。

(M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；A：外膜蛋白；B：鞭毛蛋白；C：胞外產(chǎn)物。M: Marker； A: Outer membrane protein； B: Flagellin protein； C: Extracellular products of V. parahaemolyticus.)

2.3 免疫交叉分析結(jié)果

副溶血弧菌兔多抗與副溶血弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白的免疫反應(yīng)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，與溶藻弧菌的外膜蛋白和全菌蛋白、魚腸道弧菌的全菌蛋白、哈維氏弧菌的胞外產(chǎn)物也呈現(xiàn)陽性或弱陽性，表明副溶血弧菌兔多抗與這些抗原有不同程度的免疫交叉反應(yīng)。副溶血弧菌兔多抗與鰻弧菌的4種抗原組分沒有明顯的交叉反應(yīng)(見圖4)。

(A1～A4：副溶血弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白；B1～B4：溶藻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白；C1～C4：鰻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白；D1～D4：魚腸道弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白；E1～E4：哈維氏弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白；虛線：P/N =2.1。 A1～A4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. parahaemolyticus; B1～B4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. alginolyticus; C1～C4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. anguillarum; D1～D4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. ichthyoenteri; E1～E4: Outer membrane protein, flagellum protein, extracellular products and whole-cell bacterial protein of V. harveyi; The dashed line represented P/N = 2.1.)

2.4 膠體金最適標(biāo)記蛋白濃度

OD值法測(cè)定副溶血弧菌兔多抗標(biāo)記膠體金的最佳蛋白量，結(jié)果顯示蛋白濃度小于3 μg·mL-1時(shí)，膠體金的OD值呈上升趨勢(shì)；蛋白濃度大于3 μg·mL-1時(shí)，OD值呈下降趨勢(shì)后趨于平緩，表明3 μg·mL-1為穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量，最佳標(biāo)記濃度為3.6 μg·mL-1(最低蛋白量基礎(chǔ)上加20%，見圖 5)。

圖5 OD值曲線法確定膠體金標(biāo)記副溶血弧菌兔多抗的最佳標(biāo)記濃度

2.5 4種抗原蛋白特異性及劃線濃度

副溶血弧菌4種蛋白的OD405值與PBS OD405值的比值(P/N值)皆大于等于2.1，表明4種抗原蛋白均可與副溶血弧菌兔多抗特異性結(jié)合(見表2)。根據(jù)4種抗原蛋白的濃度和P/N值確定副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙的4條檢測(cè)線T1、T2、T3和T4上的抗原蛋白劃線濃度，分別為外膜蛋白0.8 mg·mL-1、鞭毛蛋白0.3 mg·mL-1、胞外產(chǎn)物1.0 mg·mL-1、全菌蛋白0.4 mg·mL-1。

表2 ELISA法確定副溶血弧菌4種抗原蛋白的劃線濃度Table 2 The dispensed concentration of four antigens of V. parahaemolyticus determined by ELISA

2.6 檢測(cè)結(jié)果的判讀方法

根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法原理，副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙檢測(cè)結(jié)果的判讀方法如下(見圖6A)：(1)質(zhì)控線(C線)顯色，4條檢測(cè)線T1～T4全部不顯色，表明檢測(cè)樣品中含有副溶血弧菌與檢測(cè)線上的抗原蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)副溶血弧菌抗體，結(jié)果為陽性；(2)質(zhì)控線顯色，4條檢測(cè)線T1～T4全部顯色，表明檢測(cè)樣品中不含副溶血弧菌，金標(biāo)副溶血弧菌抗體與檢測(cè)線上的抗原結(jié)合而顯色，結(jié)果為陰性；(3)質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線T4線呈現(xiàn)紅色，而檢測(cè)線T1、T2、T3中個(gè)別條帶不顯色，表明檢測(cè)樣品中不含副溶血弧菌，但含有與副溶血弧菌具有共同抗原的其他病原菌，結(jié)果為其他菌的交叉反應(yīng)；(4)質(zhì)控線和檢測(cè)線T1～T4都不顯色，表明該試紙失效或操作出現(xiàn)問題。

2.7 試紙的特異性

對(duì)鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌使用制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6B所示，當(dāng)檢測(cè)鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌時(shí)(見圖6B 1～4)，質(zhì)控線和T1～T4檢測(cè)線皆顯色，表明結(jié)果為副溶血弧菌陰性，但是魚腸道弧菌(見圖6B-2)、溶藻弧菌(見圖6B-3)使T4檢測(cè)線較PBS組(見圖6B-5)變淺，哈維氏弧菌的T2、T3線較PBS組變淺，表明存在一定程度的交叉反應(yīng)；PBS使C線和4條T線皆顯色；檢測(cè)副溶血弧菌時(shí)，僅C線顯色，4條檢測(cè)線皆不顯色，即檢測(cè)結(jié)果為陽性(見圖6B-6)。

(A: Ⅰ. 陽性結(jié)果；Ⅱ. 陰性結(jié)果；Ⅲ. 交叉反應(yīng)；Ⅳ. 試紙失效。B: 1. 鰻弧菌檢測(cè)結(jié)果；2. 魚腸道弧菌檢測(cè)結(jié)果；3. 溶藻弧菌檢測(cè)結(jié)果；4. 哈維氏弧菌檢測(cè)結(jié)果；5. PBS陰性對(duì)照；6. 副溶血弧菌檢測(cè)陽性結(jié)果。A: Ⅰ. Positive results；Ⅱ. Negative results；Ⅲ. Cross reaction；Ⅳ. Invalid results. B: 1. V. anguillarum；2. V. ichthyoenteri；3. V. alginolyticus；4. V. harveyi；5. PBS；6. V. parahaemolyticus.)

2.8 試紙的靈敏性

使用制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙檢測(cè)5×107、5×106、5×105、5×104cfu·mL-1的副溶血弧菌，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)5×107、5×106、5×105cfu·mL-1的副溶血弧菌時(shí)，質(zhì)控線顯色而T1～T4線不顯色，濃度為5×104cfu·mL-1時(shí)，T1～T4線開始顯色，說明5×105cfu·mL-1即為該試紙的檢測(cè)限(見圖7)。

圖7 副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)靈敏性

2.9 試紙的檢測(cè)準(zhǔn)確性

使用副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙檢測(cè)人工感染副溶血弧菌發(fā)病的牙鲆肝、脾、腎混合樣品，發(fā)現(xiàn)T1～T4檢測(cè)線皆不顯色，只有質(zhì)控線顯色，結(jié)果判定為陽性；而健康牙鲆組織樣品和PBS使4條檢測(cè)線和質(zhì)控線皆顯色，結(jié)果判定為陰性(見圖8)。

(i：健康牙鲆組織樣品檢測(cè)結(jié)果；ii：PBS陰性對(duì)照；iii：患病牙鲆組織檢測(cè)結(jié)果。i： Negative control using the tissues of healthy flounder；ii： Negative control using PBS；iii： Positive results for V. parahaemolyticus in flounder.)

ELISA的結(jié)果顯示牙鲆組織樣品OD值與健康牙鲆組織陰性對(duì)照組OD值的比值(P/N值)大于2.1，表明為副溶血弧菌陽性(見圖9)，與試紙的檢測(cè)結(jié)果一致。

圖9 ELISA檢測(cè)牙鲆樣品中副溶血弧菌

3 討論

副溶血弧菌可引起水產(chǎn)養(yǎng)殖魚、蝦、蟹、貝等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的流行性和暴發(fā)性死亡[2-3]，是水產(chǎn)動(dòng)物特別是海水魚類弧菌病的主要致病菌，有時(shí)會(huì)與溶藻弧菌、哈維氏弧菌等發(fā)生混合感染[20]，而食用被副溶血弧菌污染的海產(chǎn)品可引起急性腸胃炎、敗血病等疾病[4-5]。傳統(tǒng)的副溶血弧菌核酸和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)多局限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，耗時(shí)長(zhǎng)、需要專業(yè)儀器和人員，不適用于現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果滯后無法滿足養(yǎng)殖者及時(shí)制定防控決策的需求，延誤治療時(shí)機(jī)，急需快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)診斷技術(shù)。免疫膠體金技術(shù)是一種很有發(fā)展前景的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)，但是排除病原菌之間免疫交叉反應(yīng)對(duì)結(jié)果判定的干擾是其需要解決的關(guān)鍵問題。本文使用副溶血弧菌4種抗原蛋白作為4條檢測(cè)線，4種檢測(cè)線抗原設(shè)置不同濃度，并在T4線設(shè)置全菌蛋白，采用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析原理制備了副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙，確定了4條檢測(cè)線同時(shí)不顯色判定為陽性，同時(shí)顯色判定為陰性，個(gè)別檢測(cè)線不顯色則為交叉反應(yīng)的結(jié)果判定方法，對(duì)患病牙鲆組織的檢測(cè)結(jié)果表明該試紙可以用于副溶血弧菌的準(zhǔn)確檢測(cè)。

為了解決免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在的免疫交叉反應(yīng)干擾檢測(cè)準(zhǔn)確性的問題，一般是通過篩選病原獨(dú)有的抗原或特異性抗體的策略，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本文制備了副溶血弧菌兔多抗，分析了副溶血弧菌抗體與5種弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物及全菌蛋白的免疫交叉反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌與其自身的4種抗原蛋白皆發(fā)生較強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)，但僅與其他弧菌的個(gè)別共同抗原發(fā)生較弱的交叉反應(yīng)，根據(jù)此現(xiàn)象，如果增加抗原蛋白種類數(shù)作為多條檢測(cè)線，可根據(jù)所有抗原蛋白同時(shí)與病原菌抗體反應(yīng)則為陽性結(jié)果，個(gè)別抗原反應(yīng)則為交叉反應(yīng)，從而將二者區(qū)分開。本文同時(shí)使用副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白作為4條檢測(cè)線，利用副溶血弧菌抗體作為金標(biāo)抗體，根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫層析原理，當(dāng)檢測(cè)樣品中含有副溶血弧菌時(shí)，則會(huì)與金標(biāo)副溶血弧菌抗體結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)線上4種抗原蛋白無法與金標(biāo)副溶血弧菌抗體的結(jié)合，從而4條檢測(cè)線同時(shí)不顯色；相反，則同時(shí)顯色；如果檢測(cè)樣品中含有其他菌，則其含有的共同抗原與檢測(cè)線上副溶血弧菌的相應(yīng)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)抗體，從而使該檢測(cè)線不顯色或著顏色變淺，可以判定為交叉反應(yīng)。為了避免其他菌含有多種共同抗原而出現(xiàn)所有檢測(cè)線皆不顯色的情況，本研究在T4線上特別設(shè)置了副溶血弧菌全菌蛋白，因全菌蛋白中一定含有除共同抗原以外的其他抗原蛋白，這些抗原蛋白與金標(biāo)副溶血弧菌抗體反應(yīng)而使T4線顯色，從而避免其他菌使4條檢測(cè)線同時(shí)不顯色而造成假陽性。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的膠體金快速檢測(cè)試紙一般設(shè)置一條檢測(cè)線，或者在多條檢測(cè)線上噴涂不同濃度的相同抗原/抗體從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)[21-22]，本文采用了將4種抗原作為4條檢測(cè)線來檢測(cè)一種病原菌的策略。另外，因?yàn)楦比苎【胁煌乖M分的含量不同，為了使4條檢測(cè)線能夠同時(shí)顯色或同時(shí)不顯色，本文利用ELISA測(cè)定了4種抗原組分與副溶血弧菌兔多抗反應(yīng)的OD值，計(jì)算其與陰性對(duì)照的P/N值，根據(jù)P/N值確定檢測(cè)線上外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白4種抗原蛋白的劃線濃度分別為0.8、0.3、1.0 和0.4 mg·mL-1。利用制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙對(duì)鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)，只有副溶血弧菌使4條檢測(cè)線同時(shí)不顯色，其他弧菌使部分檢測(cè)線顏色變淺，根據(jù)本文確定的結(jié)果判定方法，可以準(zhǔn)確區(qū)分副溶血弧菌感染及其他菌的交叉反應(yīng)，即其他弧菌的交叉反應(yīng)不會(huì)影響對(duì)副溶血弧菌檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確判斷，而對(duì)人工感染的牙鲆組織的檢測(cè)結(jié)果也與ELISA結(jié)果一致，表明制備的試紙具有很好的特異性和檢測(cè)準(zhǔn)確性。對(duì)于副溶血弧菌與其他病原菌混合感染的情況，使用該試紙只能檢測(cè)到副溶血弧菌陽性，其他菌的存在不會(huì)影響副溶血弧菌的準(zhǔn)確鑒定，但該試紙無法鑒別混合感染，需要聯(lián)合使用其他病原菌快速檢測(cè)試紙或者借助于多病原高通量檢測(cè)技術(shù)鑒別混合感染。本實(shí)驗(yàn)室前期曾研制了鰻弧菌、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、 熒 光 假 單 胞 菌(Psedomonasfluorescens)、 遲 緩 愛 德 華 氏 菌(Edwardsiellatarda)及海分支桿菌(Mycobacteriummarinum)6 種病原菌同步檢測(cè)免疫芯片[26]，以及副溶血弧菌、魚腸道弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌和河流弧菌(Vibriofluvialis)的血清學(xué)診斷抗原芯片[27]，適用于混合感染情況下的多病原同步鑒別。因此，該試紙可以用于副溶血弧菌感染的大量樣品的快速初篩，聯(lián)合使用其他病原菌的快速檢測(cè)試紙或者配合使用多病原高通量檢測(cè)技術(shù)可以解決混合感染情況下病原的準(zhǔn)確鑒別問題。

目前，檢測(cè)病原菌的膠體金免疫層析試紙的靈敏度一般在105～106cfu·mL-1[23-25]，本文制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙的靈敏度為5×105cfu·mL-1，達(dá)到了同類試紙的檢測(cè)水平。但是，樣品中副溶血弧菌濃度低于5×105cfu·mL-1時(shí)，4條檢測(cè)線會(huì)顯色，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，限制了其在感染早期的病原檢測(cè)中的應(yīng)用，因此，還有待于通過優(yōu)化抗體及其他實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)提高靈敏度。

4 結(jié)語

本文基于競(jìng)爭(zhēng)免疫層析原理制備的副溶血弧菌快速檢測(cè)試紙具有很好的檢測(cè)特異性和準(zhǔn)確性，制備試紙時(shí)僅需要制備副溶血弧菌兔多抗作為金標(biāo)抗體，提取其外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌蛋白作為4條檢測(cè)線(T1～T4)，無需篩選特異性抗原/抗體，即可實(shí)現(xiàn)副溶血弧菌的準(zhǔn)確檢測(cè)，不受其他菌交叉反應(yīng)的干擾。使用該試紙進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便快速，可以在10 min內(nèi)得到肉眼直視的檢測(cè)結(jié)果，適用于病原性副溶血弧菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有較高實(shí)用價(jià)值，研究結(jié)果為水產(chǎn)養(yǎng)殖中副溶血弧菌的快速檢測(cè)提供了有力工具。