［（6-取代-嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基-丙烯酸甲酯的合成與抑菌活性

陶 樂， 李玉江， 郭曉河， 王 強(qiáng)， 董黎紅， 張 倩

（河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，鄭州 450002）

病害常年損失在10%以上，農(nóng)作物由此平均每年減少產(chǎn)量約500 Mt. 如果不及時(shí)防治，病害在短時(shí)間內(nèi)發(fā)展很快，受害面積逐步擴(kuò)大. 由于農(nóng)作物上的病菌在抗藥性上越來越強(qiáng)，所以高效、低毒農(nóng)藥的研制是迫在眉睫的問題. 研制新型農(nóng)藥既能有效延緩病原群體抗藥性的產(chǎn)生，也能對(duì)植物病害防治起到關(guān)鍵作用.嘧菌酯［1-4］是殺菌劑中的一類低毒、高效、廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，其來源于天然產(chǎn)物Strobilurin，是線粒體呼吸抑制劑. 它對(duì)幾乎所有真菌類（子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、卵菌綱、半知菌類）病害都顯示出很好的活性，具有保護(hù)、治療、鏟除、滲透、內(nèi)吸活性等特點(diǎn)；同時(shí)，嘧菌酯還具有高度選擇性，對(duì)作物具有很高的安全性［5-7］，對(duì)環(huán)境基本無污染，可以莖葉噴霧、種子處理等方式使用［8］，它具有保護(hù)、治療和鏟除三重功效［9-10］，可通過結(jié)合色素b絡(luò)合物，抑制電子鏈磷酸化產(chǎn)生能量［11］. 但是嘧菌酯難溶于水，不易被吸收［12］. 天然化合物的發(fā)現(xiàn)為新的化學(xué)合成打開了一扇大門，科學(xué)家正是基于此才成功地人工合成了許多結(jié)構(gòu)類似的具有生物活性的殺菌劑. 在創(chuàng)制新農(nóng)藥的方法中，以天然化合物為基礎(chǔ)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定的修飾是一條非常有效的途徑［13-17］.本文為了豐富抗菌化合物庫，改善化合物的溶解性，提高吸收率，合成了一系列［（6-取代-嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯化合物（化合物6～11）. 通過體外抗菌活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)［（6-取代-嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯都有一定的抑菌活性，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)的新型抑菌分子提供了新的思路.［（6-取代-嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯的合成路線如下所示：

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

鄰羥基苯乙酸（1）購自上海源葉生物科技有限公司，二甲基亞砜、吐溫、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，所用其他試劑均為市售分析純.

質(zhì)譜儀為高分辨質(zhì)譜儀Bruker micro TOF-Qii；核磁共振波譜儀為Agilent-NMR-vnmrs400型，TMS為內(nèi)標(biāo).

1.2 合成

1.2.1 苯并呋喃-2-（3 氫）-酮（2）的合成 依次將鄰羥基苯乙酸（1）（304 g，2 mmol）、甲苯（2 L）、冰醋酸（0.5 L）、五氧化二磷（500 g）加入反應(yīng)器中，加熱回流反應(yīng)6 h后，冷至室溫，慢慢加入冰水，用乙酸乙酯萃取3 次，合并有機(jī)相，再用飽和食鹽水萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干，無須提純可直接用于下一步反應(yīng). 取出小部分柱層析得到化合物2 白色針狀結(jié)晶. 熔點(diǎn)：48～50 ℃，1H NMR（CDCl3，400 Hz），3.72（s，2H，CH2），7.08～7.32（m，4H，Ph-H）.

1.2.2 3-α-甲氧基）亞甲基苯并呋喃-2（3氫）-酮（3）的合成 取上一步原料，加入原甲酸三甲酯（265 g，2.5 mmol）和氯化鋅（13.6 g，0.1 mol），升溫至110 ℃繼續(xù)反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后降溫. 反應(yīng)體系中加入乙酸乙酯和水洗滌，分出有機(jī)相，減壓濃縮，得到化合物3. 產(chǎn)物無須提純，直接用于下一步反應(yīng). 取出小部分柱層析得到化合物3 為黃綠色固體，熔點(diǎn)：27～29 ℃，1H NMR（CDCl3，400 Hz），4.13（S，3H，CH3），7.06～7.13（m，2H，Ph-H），7.18～7.21（m，1H，CH），7.53～7.56（m，2H，Ph-H）.

1.2.3 2-（2-羥基苯基）-3，3-二甲氧基丙酸甲酯酚鈉鹽（4）的合成 將上步原料加入甲醇（2 L），冰鹽浴下加入甲醇鈉（130 g，2.4 mmol），繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h后，反應(yīng)液減壓濃縮直接用于下一步反應(yīng). 取少量濃縮物加入稀鹽酸中和至pH=6，然后用乙酸乙酯和水萃取，有機(jī)相減壓濃縮至干，柱層析提純得到無色透明油狀物化合物4.1H NMR（CDCl3，400 Hz）：3.38（s，3H，OCH3），3.68（s，3H，OCH3），4.95（s，1H，CH），6.76～6.85（m，2H，Ph-H），7.15～7.18（m，2H，Ph-H）.

1.2.4 2-［2-（6-氯嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯（5）的合成 室溫條件下，依次將碳酸鈉（106 g，1 mol）、4，6-二氯嘧啶（300 g，2 mol）、1，4-二氧六環(huán)（2 L）加入到反應(yīng)瓶里，攪拌一會(huì)兒后向上述反應(yīng)液中慢慢加入化合物4的酚鈉鹽，加熱反應(yīng)至60 ℃，繼續(xù)反應(yīng)6 h，趁熱減壓濾掉鹽，冷至室溫后加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到淺黃色固體5.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.59（s，3H，OCH3），3.73（s，3H，OCH3），3.95（s，3H，OCH3），6.06（s，1H，CH），7.15～7.44（m，4H，Ph-H），7.44（s，1H，Pyr-H），8.44（s，1H，Pyr-H），13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：171.586，170.721，167.397，160.346，157.705，150.344，132.456，128.942，125.876，125.382，121.899，107.099，90.828，61.730，54.035，51.363；HRMS：m/z［M+H］+.

1.2.5 2-［2-（6-甲氧基嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯（6）的合成 將化合物5（1.03 g，3.4 mmol）、甲醇（10 mL）、甲醇鈉（0.18 g，3.4 mmol）依次加入到反應(yīng)器內(nèi)，加熱回流攪拌反應(yīng)完全后，冷至室溫，加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，減壓蒸出有機(jī)相，柱層析得到白色結(jié)晶性粉末化合物6（0.84 g，83%）.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.60（s，3H，CH3），3.87（s，3H，CH3），6.46（s，1H，CH），6.62（s，1H，Pyr-H），7.18～7.73（m，8H，Ph-H），8.37（s，1H，Pyr-H），13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：171.397，170.076，165.355，15，9.330，157.834，154.032，150.670，134.178，133.541，131.917，129.040，129.002，126.194，125.534，115.152，107.274，107.046，92.854，62.565，51.454；HRMS：m/z［M+H］+305.113 2.

1.2.6 （E）-［2-［6-苯氧基）嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯（7）的合成 將化合物5（3.1 g，10 mmol）、甲苯（25 mL）、苯酚（1.1 g，12.0 mol）、碳酸鉀（1.38 g，10 mmol）、DMF（2 mL）、三乙烯二胺（DABCO）（0.2 g）組成的混合物攪拌，在100 ℃反應(yīng)6 h. 冷至室溫后，加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，柱層析得到淺黃色固體7（3.51 g，96%）.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.64（s，6H，OCH3），3.78（s，6H，OCH3），6.24（s，2H，CH），7.17～7.52（m，9H，Ph-H），7.45（s，1H，Pyr-H），8.42（s，1H，Pyr-H）.13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：171.442，170.843，167.397，160.483，158.039，153.159，150.169，132.539，130.300，129.033，125.845，125.663，121.929，118.666，115.235，107.062，92.035，61.836，51.447；HRMS：m/z［M+H］+367.128 8.1.2.7 （E）-［2-［6-對(duì)-硝基-苯氧基）嘧啶-4-基氧］苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯（8）的合成 將化合物5（3.1 g，10 mmol）、甲苯（25 mL）、對(duì)硝基-苯酚（1.7 g、12.0 mol）、碳酸鉀（1.38 g，10 mmol）、DMF（2 mL）、三乙烯二胺（DABCO）（0.2 g）組成的混合物攪拌，在100 ℃反應(yīng)6 h. 冷至室溫后，加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，柱層析得到黃色固體（8）（3.78 g，92%）.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.62（s，3H，OCH3），3.78（s，3H，OCH3），6.18（s，1H，CH），7.19～7.43（m，6H，Ph-H），7.48（s，1H，Pyr-H），8.29～8.32（m，2H，Ph-H），8.42（s，1H，Pyr-H），13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：171.655，169.939，167.382，160.559，157.888，157.311，150.048，144.857，132.623，129.109，125.838～125.921，125.382，121.823～121.921，115.493，106.948，92.756，61.882，60.288，51.469，20.922，14.069；HRMS：m/z［M+H］+.

1.2.8 （E）-［2-［6-對(duì)-氨基-苯氧基）嘧啶-4-基氧］苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯（9）的合成 在裝有化合物（8）（2.0 g，5 mmol）的反應(yīng)瓶里分別加入鐵粉（0.56 g，10 mmol）、濃鹽酸（2 mL）、乙醇（10 mL）和水（2 mL），60 ℃條件下攪拌反應(yīng)2 h，補(bǔ)加濃鹽酸（2 mL），繼續(xù)反應(yīng)5 h，冷至室溫，加入水和乙酸乙酯，分出水相用碳酸鈉飽和溶液中和至堿性，乙酸乙酯萃取，減壓濃縮至干，柱層析得到黃色化合物（9）（1.74 g，94%）.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.62（s，3H，OCH3），3.78（s，3H，OCH3），6.18（s，1H，CH），7.19～7.43（m，6H，Ph-H），7.48（s，1H，Pyr-H），8.29～8.32（m，2H，Ph-H），8.42（s，1H，Pyr-H），13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：172.057，171.192，167.389，160.392，158.063，150.199，144.204～144.318，132.418，128.911，125.458～125.747，121.982，115.789，107.046，91.245，61.753，51.378；HRMS：m/z［M+H］+412.113 9.

1.2.9 （E）-［2-［6-｛（E）-［2-［6-（2-氰基苯氧基）嘧啶-4-基氧］苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯基｝嘧啶-4-基氧］苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯（10）的合成 依次將化合物5（3.0 g，10 mmol）、甲苯（30 mL）、鄰羥基苯酚（1.90 g，5 mol）、碳酸鉀（1.38 g，10 mmol）、DMF（2 mL）、三乙烯二胺（DABCO）（0.2 g）加入到反應(yīng)瓶里，在110 ℃攪拌反應(yīng)6 h. 冷至室溫后，加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，柱層析得到微黃色固體（10）.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.60（s，6H，OCH3），3.75（s，6H，OCH3），6.28（s，2H，CH），7.06～7.48（m，12H，Ph-H），7.46（s，2H，Pyr-H），8.42（s，1H，Pyr-H），13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：171.503，170.903，167.473，160.529，158.115，153.228，150.230，132.600，130.353，129.093，125.898，125.731，121.977，118.719，115.296，107.137，92.095，61.905，51.522；HRMS：m/z［M+H］+655.203 5.

1.2.10 （E）-［2-［6-萘氧基）嘧啶-4-基氧］苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯化合物（11）合成 將化合物5（3.1 g，10 mmol）、甲苯（25 mL）、萘酚（1.73 g，12.0 mol）、碳酸鉀（1.38 g，10 mmol）、DMF（2 mL）、DABCO（0.2 g）組成的混合物攪拌，在120 ℃反應(yīng)6 h. 冷至室溫后，加入水和乙酸乙酯，分出有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，柱層析得到淺黃色固體11（2.7 g，65%）.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：3.59（s，3H，OCH3），3.74（s，3H，OCH3），6.18（s，1H，CH），6.70～7.40（m，11H，Ph-H），7.46（s，1H，Pyr-H），8.41（s，1H，Pyr-H），13C NMR（CDCl3，400 MHz），δ：171.928，171.472，167.405，160.453，158.305，150.215，148.325，134.846，132.516，128.995，128.076，126.908，126.566，126.468，126.088，125.769，125.587，125.526，122.055，121.383，117.702，107.084，91.458，61.798，51.439，20.952，14.099；HRMS：m/z［M+H］+417.144 5.

1.3 化合物體外抗菌活性測(cè)試

離體抑菌活性測(cè)試方法：離體抑菌活性測(cè)試方法采用菌絲生長(zhǎng)速率法［18］.

一定量的測(cè)試化合物溶于二甲基亞砜中，配成一定濃度的溶液，用吐溫將該溶液稀釋成濃度500 mg/L的測(cè)試液. 吸取1 mL上述溶液，加入到9 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基完全凝固后接入供試菌種，在（25±1）℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)72 h之后，對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，并與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，得到離體抑制率.

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-藥劑處理菌落增長(zhǎng)直徑）/空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

本文采用鄰羥基苯乙酸（1）為起始原料，經(jīng)水解、閉環(huán)、甲氧基亞甲基化、開環(huán)、醚化、消除和縮合七步反應(yīng)合成出嘧菌酯類似物，以鄰羥基苯乙酸（1）為原料，在合成水楊酸內(nèi)酯（2）、化合物3、化合物4的過程中，每一步不需要分離提純，可以直接用于下一步反應(yīng)，工藝簡(jiǎn)單，收率較高. 特別是以化合物5為起始原料，將甲苯、不同的取代基萘酚溶于適用的溶劑中，采用1，4-二氮雜雙環(huán)［2.2.2］辛烷（DABCO）這個(gè)功能特殊的有機(jī)堿做催化劑，以較高的產(chǎn)率生成了目標(biāo)產(chǎn)物. 本合成方法避免了以往嘧菌酯類似物合成方法普遍存在的合成成本高、操作步驟復(fù)雜、反應(yīng)在高溫下進(jìn)行、操作難度大、能耗高、催化劑價(jià)格高、催化能力弱等問題.

2.2 目標(biāo)化合物的抑菌活性

目標(biāo)化合物［（6-取代-嘧啶-4-基氧）苯基］-3-甲氧基丙烯酸甲酯的抑菌活性初篩結(jié)果（表1）表明，當(dāng)藥劑濃度為50 μg/mL，這些化合物對(duì)花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥紋枯病菌的抑制率均較高，其中化合物6 對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率較高；化合物8、化合物10 對(duì)花生褐斑病菌抑制率較高；化合物10 對(duì)蘋果輪紋病菌抑制率較高；化合物10、化合物9、化合物6、化合物8 和化合物7 對(duì)小麥紋枯病菌抑制率較高；化合物7對(duì)玉米小斑病菌抑制率較高；化合物7對(duì)西瓜炭疽病菌抑制率較高；化合物6、化合物9和化合物7對(duì)水稻惡苗病菌抑制率較高. 因此，該類化合物可以有效抑制農(nóng)作物上的致病菌，對(duì)于目前農(nóng)作物耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重的情況具有潛在應(yīng)用價(jià)值，開發(fā)前景良好.

表1 化合物6～11在50 μg/mL濃度下有關(guān)離體抑菌活性測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The experimental results of in vitro antibacterial activity test at the concentration of 50 μg/mL for compounds 6～11

從初篩結(jié)果可以看出，化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10和化合物11對(duì)黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥紋枯病菌、玉米小斑病菌、西瓜炭疽病菌、水稻惡苗病菌都有一定的抑制活性，尤其對(duì)花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥紋枯病菌的抑制效果較好，進(jìn)一步研究正在進(jìn)行.