密閉環(huán)境中空氣微生物檢測和監(jiān)測技術(shù)分析

許麗紅

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所 廣東省微生物分析檢測中心，廣東廣州 510070；2.華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

密閉環(huán)境狀態(tài)下，人們的活動(dòng)以及工作過程中機(jī)械、電子設(shè)備的操作施工會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)高溫、高濕的情況，普遍溫度達(dá)到45 ℃以上，濕度接近飽和。這種環(huán)境能夠提高微生物的繁殖速度，尤其是部分病毒微生物。長時(shí)間不進(jìn)行空氣流通，會(huì)使密閉環(huán)境中充滿受污染的空氣。長時(shí)間處在這種空氣環(huán)境下會(huì)對(duì)人體造成一定傷害。

1 密閉環(huán)境中空氣微生物的主要來源

現(xiàn)階段，關(guān)于密閉環(huán)境中空氣微生物種類的相關(guān)研究較多，但缺乏對(duì)于微生物來源的研究[1]。自然環(huán)境中的空氣微生物主要有細(xì)菌及真菌，分布濃度主要與環(huán)境清潔頻率、建筑物植被密度等相關(guān)。而密閉環(huán)境中的細(xì)菌濃度又與自然環(huán)境中的細(xì)菌濃度呈正相關(guān)[2]。另一方面，人為因素是密閉環(huán)境中空氣微生物的主要來源。人類在進(jìn)出密閉環(huán)境時(shí)，自身服裝、所攜帶的作業(yè)設(shè)備以及器具等都會(huì)附著一些直徑小于100 μm的懸浮顆粒物，其中大于10 μm的顆粒物會(huì)降落在地面上，而小于10 μm的顆粒物會(huì)飄浮在空中，這些懸浮物會(huì)攜帶一定的空氣微生物。且在密閉環(huán)境中，人體本身就是一個(gè)污染源，其新陳代謝所產(chǎn)生的皮屑、口腔分泌物、毛發(fā)等大多帶有致病微生物，夾雜在空氣中形成空氣微生物。人類患病咳嗽時(shí)會(huì)產(chǎn)生75 000個(gè)左右的顆粒物，其康復(fù)后咳嗽時(shí)的顆粒物為50 000個(gè)左右，這些顆粒物也是空氣微生物的來源之一。其他人體活動(dòng)也會(huì)成為空氣微生物的二次來源，如人體排泄時(shí)，排泄物中一半以上的固體都夾雜著細(xì)菌，在進(jìn)行沖廁時(shí)，這些細(xì)菌會(huì)霧化漂浮在空氣中，每次大約會(huì)產(chǎn)生15萬個(gè)氣溶膠顆粒，絕大多數(shù)的顆粒小于5 μm，并能夠在密閉環(huán)境中持續(xù)停留。

2 密閉環(huán)境空氣微生物檢測和監(jiān)測技術(shù)探討

2.1 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是在微電子加工技術(shù)的支持下，在微生物表面構(gòu)建微生物分析系統(tǒng)，針對(duì)蛋白質(zhì)、細(xì)胞等進(jìn)行準(zhǔn)確、高通量化研究，從而達(dá)到檢測密閉環(huán)境中空氣微生物的目的。生物芯片中匯集著大量的分子原件，能夠在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多方位生物分子檢測，其檢測效率遠(yuǎn)超于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，被科學(xué)家稱為20世紀(jì)繼大規(guī)模集成電路之后的又一次技術(shù)改革。生物芯片的應(yīng)用在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)方面都有著極高的研究價(jià)值，實(shí)現(xiàn)了空氣微生物檢測和監(jiān)測工作的多參數(shù)同步測定，完全符合密閉環(huán)境的特殊場景要求。此外，生物芯片技術(shù)還具備多種空氣微生物同時(shí)監(jiān)測的功能，可以分析微生物的存在狀態(tài)，據(jù)此采取相應(yīng)的滅菌手段，從而控制密閉環(huán)境中的空氣微生物數(shù)量。例如，SPR芯片檢測技術(shù)是利用化學(xué)還原法將樣本玻璃片制備成納米金單膜層，其對(duì)設(shè)備的要求較低，且能夠批量進(jìn)行樣本制備，有效控制檢測成本。實(shí)際工作中，設(shè)計(jì)合成特異的bis-PNA探針，并借助硫醇化合物表面單分子自組裝技術(shù)使探針牢固，可以提高SPR生物芯片的敏感性和空氣微生物檢測效果。同傳感器單一檢測方法相比，這種新型生物芯片檢測系統(tǒng)更具備實(shí)用性，且造價(jià)低廉，可在密閉環(huán)境中空氣微生物檢測和監(jiān)測工作中發(fā)揮極大的作用[3]。

2.2 生物衍生技術(shù)

生物衍生技術(shù)是一種新型空氣微生物檢測技術(shù)，主要應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)生產(chǎn)等方面，其主要優(yōu)點(diǎn)在于檢測工序簡單、檢測時(shí)間短、不會(huì)對(duì)樣本造成二次污染等。特別是對(duì)于密閉環(huán)境中的空氣微生物進(jìn)行活細(xì)胞檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)整個(gè)細(xì)胞系統(tǒng)的外源物質(zhì)回應(yīng)，從而滿足微生物種類及密度的高效化測定。將測定結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)密度進(jìn)行比對(duì)可以判斷是否需要進(jìn)行消毒作業(yè)。從原理來說，生物衍生技術(shù)的核心在于分析生物器件，通過對(duì)生物及生物衍生出來的敏感元件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到與微生物相關(guān)的數(shù)字化電子信號(hào)，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度對(duì)樣本進(jìn)行判斷。目前，生物衍生技術(shù)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中常見的敏感元件主要由生物自身成分構(gòu)成，其與樣本環(huán)境中的微生物濃度有很大關(guān)系。與傳統(tǒng)空氣微生物檢測技術(shù)手段相比，生物衍生技術(shù)的催化劑為固定化生物物質(zhì)，雖然反應(yīng)試劑的造價(jià)高昂，但可以多次重復(fù)使用，且自身工序簡單、檢測時(shí)間較短，能夠及時(shí)得到檢測結(jié)果。但其自身也存在著空氣微生物檢測種類及數(shù)量限制、檢測功能較為單一、不能實(shí)現(xiàn)密閉環(huán)境的長期監(jiān)測[4]等缺陷。

2.3 落菌檢測技術(shù)

落菌檢測技術(shù)也被稱為自然沉降法，主要是將適合空氣微生物生長的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)過消毒滅菌環(huán)節(jié)后，倒入無菌平皿中制作成落菌平板，放置于待測環(huán)境中。密閉環(huán)境中的空氣微生物會(huì)在重力作用下自然沉降在落菌平板上，通過對(duì)平板內(nèi)的微生物菌群進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)檢測及監(jiān)測的目的。實(shí)際操作中，空氣中的微生物可以在培養(yǎng)基上形成單一的微生物菌落，根據(jù)菌落的數(shù)量可以計(jì)算微生物數(shù)量。

落菌平板的觀察方法較多，如顯微鏡法、基質(zhì)輔助激光解吸電離法（MALDI）、激光誘導(dǎo)熒光法（LIF）等。顯微鏡法是最基本也是應(yīng)用最普遍的落菌平板觀察方法，其借助顯微鏡對(duì)平板中的菌落及有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行觀察，常用于液體樣本中的微生物觀察任務(wù)；MALDI是一種現(xiàn)代化軟電離技術(shù)，但受到信號(hào)強(qiáng)度的影響，只能對(duì)超過600 Da的微生物進(jìn)行觀察，其主要是用來完成大分子顆粒的觀察任務(wù)；LIF是在一定角度下對(duì)落菌平板熒光輻射的二維或三維圖像進(jìn)行分析，有選擇性地獲得微生物分子結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果，主要用于空氣微生物中的細(xì)菌檢測。

落菌檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于造價(jià)低廉、操作方法較為容易、不需要工作人員一直守在待測環(huán)境中以及對(duì)于空氣微生物的損傷較小。但在收集過程中容易受到密閉環(huán)境的氣流、粒子大小、人體活動(dòng)等情況的影響，其檢測結(jié)果存在一定的巧合性，不具備強(qiáng)有力的說服力。

2.4 撞擊檢測技術(shù)

撞擊檢測技術(shù)是當(dāng)下較為普遍的民用密閉環(huán)境中空氣微生物檢測及監(jiān)測技術(shù)。該技術(shù)基于空氣微生物檢測儀，在抽氣動(dòng)力的作用下，使存在于空氣中的帶菌粒子在較為狹窄的縫隙中高速流動(dòng)，并與介質(zhì)表面進(jìn)行接觸，于慣性作用下完成空氣微生物取樣。其中，直徑較小的空氣微生物粒子會(huì)直接通過采樣器，而直徑較大的空氣微生物粒子會(huì)被收集起來。就目前發(fā)展技術(shù)水平而言，撞擊檢測技術(shù)采樣后的器皿溫度通常保持在37 ℃，并在48 h內(nèi)完成帶菌粒子檢測。撞擊檢測技術(shù)的采樣成本較低、操作簡單且培養(yǎng)基處理方便，能夠?qū)崿F(xiàn)不同直徑帶菌粒子的分級(jí)采樣。但就密閉環(huán)境而言，其不能夠直接對(duì)空氣微生物的數(shù)量進(jìn)行檢測，無法滿足全方位監(jiān)測密閉環(huán)境中空氣微生物的要求。

2.5 液體檢測技術(shù)

液體檢測技術(shù)主要是針對(duì)密閉環(huán)境中的浮游微生物進(jìn)行檢測，尤其是浮游細(xì)菌。取密閉環(huán)境中部分待測空氣注入無菌液體培養(yǎng)基中，采用菌液涂抹或倒平板的方法使其均勻分布，便于其在培養(yǎng)基上生長；經(jīng)過一段時(shí)間的繁殖后，進(jìn)行計(jì)數(shù)、分離、鑒定等工序。就原理而言，液體檢測技術(shù)與撞擊檢測技術(shù)有一定的相似性，區(qū)別在于液體撞擊技術(shù)是將空氣微生物收集到液態(tài)化的培養(yǎng)皿中。當(dāng)待測空氣通過狹窄的通道管沖擊到液體培養(yǎng)皿上時(shí)，所有懸浮顆粒物都會(huì)被液體培養(yǎng)基收集起來，并放置于適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行微生物檢測。該過程會(huì)受到空氣沖擊風(fēng)速的顯著影響。若沖擊風(fēng)速為5 m/s，則收集效率在10%左右；而在靜止?fàn)顟B(tài)下，收集效率則接近100%。液體檢測技術(shù)中，大多數(shù)液體沖擊采樣器都是由玻璃制成的，相較于安德森采樣器等金屬采樣器存在著造價(jià)較低的優(yōu)勢，且液體培養(yǎng)基基質(zhì)對(duì)于空氣微生物的損害程度較低。

2.6 酶抑制檢測技術(shù)

酶抑制檢測技術(shù)主要是通過商品化微量生化鑒定試劑盒來檢測密閉環(huán)境中的微生物殘留量，將樣本與反應(yīng)試劑放入儀器中進(jìn)行檢測反應(yīng)，檢測儀會(huì)計(jì)算出密閉環(huán)境空氣樣本中的具體微生物數(shù)值。一般來說，若致病微生物檢驗(yàn)結(jié)果低于10%，說明密閉環(huán)境中微生物含量符合標(biāo)準(zhǔn)，反之則說明環(huán)境中存在致病微生物殘留問題，需要進(jìn)行滅毒殺菌處理。酶抑制檢測技術(shù)操作便捷，對(duì)檢測設(shè)備要求不高，簡單培訓(xùn)即可進(jìn)行檢測，且靈敏度高，檢測結(jié)果較有說服力，常用于細(xì)菌及真菌類微生物的檢測。但是，酶抑制檢測技術(shù)僅限于檢測某些特定微生物，其原理是通過酶的功能基因易于受到某種微生物的影響，從而在一定程度上降低酶自身的活性強(qiáng)度，導(dǎo)致其失去原有生理作用，進(jìn)而達(dá)到檢測密閉環(huán)境中空氣微生物的效果。將酶抑制劑放置于空氣樣品環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)酶抑制劑活性受到抑制的情況，分析密閉環(huán)境空氣樣本中所含微生物含量。酶抑制檢測是目前相對(duì)較為成熟的、應(yīng)用較為廣泛的一種密閉環(huán)境空氣微生物檢測和監(jiān)測方法，其實(shí)驗(yàn)力度強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果具備說服力，但檢測環(huán)節(jié)使用的酶造價(jià)較為昂貴。若使用造價(jià)低廉的反應(yīng)酶，其檢測結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證[5]。

3 結(jié)語

重視空氣微生物檢測和監(jiān)測技術(shù)研究，全面了解空氣微生物的來源、種類、采樣方法和檢測方法，能夠有效控制密閉環(huán)境的空氣質(zhì)量，改善特殊條件下的作業(yè)環(huán)境。隨著現(xiàn)代科技的不斷完善，微生物檢測技術(shù)也會(huì)越來越全面，從而不斷推進(jìn)生物科學(xué)的現(xiàn)代化發(fā)展。