田鶴 稅光厚

（中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101）

代謝組學(xué)作為生物樣本中小分子代謝物定性、定量研究的有力工具，已經(jīng)成為注釋基因功能、揭示細(xì)胞受外源性刺激后產(chǎn)生的各種內(nèi)源性生理、生化反應(yīng)的主要手段，并廣泛用于各個(gè)研究領(lǐng)域，包括生命科學(xué)、疾病診斷、藥物研發(fā)、營養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、環(huán)境學(xué)及植物學(xué)等領(lǐng)域［1-7］。

自從Nicholson等［8］在1999年首次提出代謝組學(xué)概念以來，代謝組檢測技術(shù)得到了快速發(fā)展。代謝組學(xué)研究主要依賴核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）和質(zhì)譜技術(shù)（Mass spectrometry，MS）［9］。表1對NMR與MS技術(shù)特點(diǎn)做了總結(jié)。其中，NMR技術(shù)具有強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)解析能力和無偏向檢測的優(yōu)點(diǎn)［10］。對于跨越時(shí)間長、不同批次大量樣本分析，NMR具有非常穩(wěn)定的檢測靈敏度。由于NMR技術(shù)無需破壞樣品和非接觸式檢測，避免了樣品殘留在儀器系統(tǒng)中而導(dǎo)致的靈敏度和穩(wěn)定性下降，從而有效保證定量的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。然而該技術(shù)對于復(fù)雜體系的生物樣本檢測，只能獲取有限個(gè)代謝物的定性、定量數(shù)據(jù)，通常分析的代謝物數(shù)目不超過100個(gè)［11-12］。在采集代謝組數(shù)據(jù)時(shí)，NMR技術(shù)通過代謝物化學(xué)位移和裂分的特征信號來實(shí)現(xiàn)定性與定量，但是生物樣本成分復(fù)雜，不同組分高低濃度可跨越8個(gè)數(shù)量級，眾多代謝物信號疊加，使得該技術(shù)的特異性降低；同時(shí)，對于低含量成分的檢測靈敏度遠(yuǎn)低于質(zhì)譜技術(shù)，這些因素限制了其在生物樣本中獲取信息量的能力。與NMR技術(shù)相比，MS具有靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對于生物樣本，在一次檢測分析中，可以同時(shí)覆蓋成千上萬個(gè)分子的定性、定量信息。MS與氣相色譜（Gas chromatography，GC）或液相色譜（Liquid chromatography，LC）聯(lián)用技術(shù)，已成為最常用的代謝組學(xué)研究工具［9，13］。

表1 NMR、GC/LC-MS在代謝組分析中的優(yōu)勢和不足

GC-MS比較適合分析熱穩(wěn)定、易揮發(fā)或經(jīng)衍生化后易揮發(fā)成分，不受復(fù)雜生物樣本中基質(zhì)效應(yīng)的干擾［14］。并且在定性方面，具有大量可檢索的質(zhì)譜庫等優(yōu)勢。不論GC-MS來自哪個(gè)廠家，利用電子轟擊離子化（Electron impact ionization，EI）技術(shù)采集的質(zhì)譜圖，均可以很好地與檢索的譜庫匹配，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性。GC-MS方法可以同時(shí)測定幾百個(gè)代謝物，分子量通常在600道爾頓以內(nèi)，包括有機(jī)酸、氨基酸、糖、糖醇、芳胺和脂肪酸等。然而，GC-MS不適合檢測極性大不易揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的代謝物。同時(shí)，在離子化過程中，電子轟擊施加的能量會使結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定成分易于碎裂而難于檢測到化合物的分子離子峰。LC-MS比較適合不穩(wěn)定、難揮發(fā)的成分［14］。在一次檢測分析中，可以檢測生物樣本中幾千到幾萬個(gè)化合物，因此其應(yīng)用于非靶向代謝物分析的覆蓋度遠(yuǎn)高于GC-MS，在代謝組學(xué)研究中更為常用。

常見的適合與LC聯(lián)用的質(zhì)譜儀離子源，主要有電噴霧電離（Electrospray ionization，ESI）和大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI）［15-16］。其中ESI是最軟的電離技術(shù)，可以通過優(yōu)化儀器參數(shù)主要產(chǎn)生分子離子峰，是代謝組學(xué)研究中最常用的離子化技術(shù)，適用范圍廣，適合難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、中到高極性化合物的檢測，比如溶血磷脂膽堿（Lysophosphatidylcholine，LysoPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（Lysophosphatidylethanolamine，LysoPE）、脂酰基肉堿（Acyl carnitines）等。ESI技術(shù)的不足之處在于易受生物樣本中基質(zhì)效應(yīng)的影響，且對弱極性和非極性化合物的離子化能力較弱。與ESI相比，大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI）更適合分析低極性和中性化合物，受基質(zhì)效應(yīng)干擾較小。但是，APCI技術(shù)不適合受熱易分解成分的檢測。此外，大氣壓光致電離（Atmospheric pressure photoionization，APPI）適合分析弱極性或非極性化合物，有較寬的線性動態(tài)范圍和很高的靈敏度，且基質(zhì)效應(yīng)更小。

然而，質(zhì)譜分析方法中，無論靶向還是非靶向檢測，仍面臨諸多挑戰(zhàn)［17］。首先，樣品前處理環(huán)節(jié)，生物樣本中代謝物化學(xué)性質(zhì)各異、成分復(fù)雜，無法用一種方法提取出全部代謝物。如脂溶性成分需要用氯仿等親脂性有機(jī)溶劑提?。凰苄猿煞钟靡译?、甲醇等親水性有機(jī)溶劑提取；酸、堿性成分、易氧化代謝物更需要特定的提取條件；對于極微量成分（激素等）需要衍生化處理以增加儀器檢測靈敏度。其次，樣品檢測環(huán)節(jié)，生物樣本中代謝物高、低濃度間的差異遠(yuǎn)超出儀器檢測動態(tài)范圍，通常從幾個(gè)皮克到幾百個(gè)微克，跨越8個(gè)數(shù)量級，而質(zhì)譜儀器檢測動態(tài)范圍在6個(gè)數(shù)量級，因此在一次分析中，當(dāng)滿足低濃度成分檢測靈敏度時(shí)，高豐度代謝物的檢測往往是過飽和的，導(dǎo)致錯(cuò)誤的定量結(jié)果。同時(shí)，化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)不同的代謝物，其離子化效率會有較大差別，弱極性化合物很難被ESI技術(shù)檢測，導(dǎo)致最終僅能獲得易于離子化的代謝物信息。此外，靶向檢測（Multiple reaction monitor，MRM）的靈敏度雖然很高，多用于絕對定量分析，但是覆蓋的代謝物有限，無法全面真實(shí)反映病理?xiàng)l件下細(xì)胞的整體代謝水平。非靶向檢測（全掃描采集數(shù)據(jù)模式）可以覆蓋所有信號，側(cè)重于含量高或易于電離的成分，一般用于定性、半定量分析。

本文重點(diǎn)討論基于LC-MS技術(shù)的代謝組分析方法學(xué)基本技術(shù)和進(jìn)展，包括不同類型代謝物的前處理方法和與之適應(yīng)的LC-MS方法。并按照代謝通路和代謝物種類來綜述有關(guān)分析進(jìn)展。

1 糖酵解（Glycolysis）通路分析

糖酵解是產(chǎn)生三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）的一種供能方式，該過程從葡萄糖開始，進(jìn)一步產(chǎn)生磷酸化糖代謝物，最后生成丙酮酸和乳酸，同時(shí)生成ATP。對于這一類強(qiáng)水溶性代謝物的提取，通常采用一定比例的有機(jī)溶劑水溶液，如80%甲醇/乙腈［18］。對于生物體液，可直接將有機(jī)溶劑加入到樣品中，渦旋、離心、移取上清液用于下一步分析。對于細(xì)胞樣品，在加入有機(jī)溶劑后，需要震蕩孵化一段時(shí)間以充分提取出細(xì)胞中的代謝物；對于一些細(xì)胞壁在有機(jī)溶劑中難以破碎的樣品，需要添加磁珠或鋼珠來研磨打碎。對于組織樣品的處理，如肝臟、肌肉、植物組織等，通常采用液氮研磨處理，然后用有機(jī)溶劑提取。對于葡萄糖及其磷酸化的代謝物，大多采用正相色譜分離方法，流動相一般是水相和有機(jī)相，并添加醋酸銨和氨水，pH值要求大于9。常規(guī)使用的色譜柱有沃特世的BEH amide、安捷倫的HILIC-z、菲羅門的ACE HILIC等。質(zhì)譜采用負(fù)離子檢測模式。雖然丙酮酸和乳酸也在糖酵解通路中，但是其理化性質(zhì)與上游代謝物不同，通常需要反相色譜條件檢測。需要注意的是，丙酮酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，要通過衍生化手段使其變成穩(wěn)定的產(chǎn)物后，才可以準(zhǔn)確定量檢測，同時(shí)衍生化處理還可以大幅提高其檢測靈敏度［19］。

2 三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）分析

TCA是為細(xì)胞生命活動提供能量的過程，存在于所有需氧生物機(jī)體中的一條核心分解代謝途徑，其中間產(chǎn)物也是合成許多生物分子的前體。對于生物樣品中該途徑的代謝組分析，關(guān)注的成分包括檸檬酸、異檸檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、草酰乙酸。這些物質(zhì)與糖酵解代謝物的提取方法相同。其LC-MS分析方法和乳酸一樣，需要用反相色譜條件分離，質(zhì)譜采用負(fù)離子模式［20］。而草酰乙酸和丙酮酸性質(zhì)一樣不穩(wěn)定，可以使用相同的衍生化試劑處理，以得到可靠的定量結(jié)果［19］。

3 脂酰輔酶A與脂酰肉堿分析

脂酰輔酶A是一種高能化合物，作為中間體代謝物在主要的代謝通路中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［21］。短至中長鏈的脂酰輔酶A可以滲透進(jìn)入線粒體內(nèi)膜。長鏈的脂酰輔酶A則很難穿透線粒體內(nèi)膜，需要與極性的肉堿分子結(jié)合進(jìn)入線粒體基質(zhì)，下一步釋放出游離脂肪酸后，進(jìn)行β氧化為代謝提供所需的能量。脂酰肉堿含量的高低可以反映其對應(yīng)的脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體和被利用的效率。脂酰輔酶A的碳鏈數(shù)目分布較廣（從短鏈C2-C6，到中鏈C7-C14，再到長鏈≥C16），極性跨越大，前處理方法無法兼顧短鏈的極性成分和長鏈的弱極性成分的提取效率，也很難在一個(gè)色譜條件將這些全部鏈長的代謝物獲得有效分離。通常使用一定比例的甲醇水溶液來提取生物樣本中的脂酰肉堿，采用反相色譜分析，流動相為水和乙腈，添加0.1%的甲酸，質(zhì)譜設(shè)定正離子模式檢測。反相色譜中對于短鏈脂酰輔酶A的分析，需要流動相中加入甲酸來確保其在色譜柱上獲得理想的保留與分離。而對于長鏈脂酰輔酶A的洗脫，則需要堿性流動相使其保持中性分子狀態(tài)，減少色譜上的拖尾；質(zhì)譜條件設(shè)定為負(fù)離子模式。有研究報(bào)道嘗試在一個(gè)梯度洗脫中分析鏈長在C2-C18的脂酰輔酶A，但是效果并不理想，當(dāng)碳鏈延長至C16-C18時(shí)，色譜峰發(fā)生明顯拖尾，導(dǎo)致定量靈敏度和準(zhǔn)確度下降；反之，如果色譜條件比較適合長鏈脂酰輔酶A，則短鏈長的成分色譜效果不理想。雖然有研究人員用二維液相色譜對不同鏈長的脂酰輔酶A獲得了較為理想的分析結(jié)果，然而該儀器普及率不高，一定程度上缺乏實(shí)用性。近期，報(bào)道了基于LC-MS技術(shù)的整合式脂酰輔酶A與脂酰肉堿的靶向分析方法，可以同時(shí)定量不同鏈長的脂酰輔酶A與脂酰肉堿。該方法的建立極大提高了脂酰輔酶A與脂酰肉堿的檢測通量與準(zhǔn)確性［21］。

4 核苷酸分析

核酸的基本單位是核苷酸。核酸代謝與核苷酸代謝密切相關(guān)。遺傳信息的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄等均需要通過核酸代謝來完成。核苷酸幾乎參與細(xì)胞的所有代謝過程。核苷酸具有很強(qiáng)的親水性，因此在正相色譜方法中有較好的保留與分離，其色譜質(zhì)譜檢測條件與磷酸化糖代謝物相同。NAD+、FAD、NADP等電子載體參與體內(nèi)重要的氧化還原反應(yīng)，不斷為機(jī)體提供ATP。因此定量分析這類成分可以獲得重要的生物學(xué)信息。雖然這些代謝物的LC-MS分析條件與糖酵解相同，但是它們的活性很強(qiáng)，例如NADPH與ATP即使發(fā)生少量的降解，也會導(dǎo)致NADP、ADP和AMP的含量顯著增加［22］。因此，提取這類成分時(shí)，要求滅活處理?xiàng)l件比較嚴(yán)格。有研究報(bào)道，可以向提取溶劑中加入酸來加速酶的失活，一定比例的甲酸混合溶劑（乙腈∶甲醇∶水，40∶40∶20，0.1 mol/L甲酸），幾分鐘后再添加碳酸氫銨可以有效滅活樣品，準(zhǔn)確獲得NADPH和ATP及其下游成分的含量信息。

5 氨基酸分析

氨基酸代謝與糖酵解、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)緊密相連，因此在代謝組學(xué)分析中，是備受關(guān)注的成分。這類代謝物水溶性較強(qiáng)，通常用一定比例的有機(jī)溶劑水溶液提取，如80%甲醇或80%乙腈等［2］。然而有些具有重要生物學(xué)功能的氨基酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，需要特殊的前處理方法。像同型半胱氨酸在維持氧化還原平衡狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與很多人類疾病的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。由于其結(jié)構(gòu)中的巰基具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，易于形成二硫化物，因此需要衍生化反應(yīng)來穩(wěn)定這類具有巰基基團(tuán)的代謝物，以保證定量結(jié)果準(zhǔn)確［23］。

6 類固醇激素（Steroid hormone）分析

類固醇激素對人體多種生物學(xué)反應(yīng)都起著重要調(diào)節(jié)作用，包括雄激素、雌激素、孕酮、鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素等。這類成分不僅具有重要的生物學(xué)功能，還可以被運(yùn)動員用作興奮劑，因此對于類固醇激素的定量分析顯得尤為重要。由于類固醇激素在生物體液中的含量很低，對其前處理提取的要求比較嚴(yán)格。對于尿液或血液中的這類成分提取，較為常用的溶劑是甲基叔丁基醚，也有用固相萃取的方法。這類成分在尿液中主要與葡萄糖苷酸和硫酸鹽結(jié)合的形式存在，因此在提取之前需要進(jìn)行水解處理，可以使用葡糖醛酸糖苷酶來獲得游離的類固醇激素［24］。一般選用反相色譜發(fā)分離激素類成分，水相選用含0.1%的甲酸水溶液，有機(jī)相選含0.1%的甲酸甲醇或乙腈溶液。色譜柱使用C18類型的調(diào)料。質(zhì)譜使用ESI或APCI離子源。

7 膽汁酸分析

膽汁酸是膽固醇代謝的終產(chǎn)物，被認(rèn)為可以促進(jìn)脂肪和脂溶性維生素的乳化和吸收［25］。近期研究表明，膽汁酸廣泛參與各種生理過程，包括能量利用、膽汁輸送、小腸運(yùn)動、細(xì)菌生長和炎癥反應(yīng)等。膽汁酸還與退行性肝臟腎臟疾病、慢性炎癥、腸道黏膜功能障礙、膽汁淤積、癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這類成分的提取，通常使用極性有機(jī)溶劑，如甲醇、乙腈［26］。對于組織樣品的提取，需要預(yù)先液氮研磨或加入磁珠打碎。色譜分離采用常規(guī)的反相色譜法。

圖1是基于LC-HRMS的非靶向反相色譜方法常規(guī)覆蓋的典型代謝物。

8 脂質(zhì)組分析

脂質(zhì)作為構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，具有結(jié)構(gòu)與功能多樣性的特點(diǎn)，其在生物體組織或體液中的含量遠(yuǎn)高于其它代謝物，脂質(zhì)組學(xué)已成為獨(dú)立于代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域。根據(jù)LIPIDMAPS的劃分，脂質(zhì)主要包括脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、甾醇酯、異戊烯 醇脂、鞘脂、糖脂、聚酮［27］。

脂肪酸是大多數(shù)脂質(zhì)分子的核心構(gòu)成單元，具有重要生物學(xué)功能?？梢宰鳛槟芰縼碓春图?xì)胞膜脂質(zhì)的前體。脂肪酸衍生物發(fā)揮著激素和胞內(nèi)信使的功能，參與多種疾病的進(jìn)程。例如，血液中脂肪酸水平升高，代表機(jī)體能量供應(yīng)不足。雖然常規(guī)代謝組提取溶劑，如甲醇或乙腈，可以從生物樣本中提取出短鏈到長鏈脂肪酸，然而由于從中鏈、至長鏈脂肪酸，其脂溶性逐漸增強(qiáng)，為得到較高的提取效率，脂肪酸的分析，通常使用一定比例的氯仿/甲醇/水/甲酸的混合液作為提取溶劑［2］。可以選用反相色譜發(fā)分析，流動相中，水相使用一定比例的乙腈/水溶液，有機(jī)相選擇適當(dāng)比例的乙腈/異丙醇。

圖1 基于LC-MS技術(shù)采集細(xì)胞樣品獲得的典型代謝物提取離子流色譜圖

甘油磷脂是細(xì)胞膜的主要成分，參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)。根據(jù)其極性基團(tuán)的特點(diǎn)，磷脂可以進(jìn)一步分為卵磷脂（Phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰 乙 醇 胺（Phosphatidylethanolamine，PE）、磷 脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）、磷 脂 酸（Phosphatidic acid，PA）、心 磷 脂（Cardiolipin，CL）等。鞘脂主要包括神經(jīng)酰胺（ceramide，CM）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、糖鞘脂類（Glycosphingolipid）。例如，人體鞘脂水平的紊亂可能代表糖尿病并發(fā)心血管疾病。中性脂包括甘油三酯（Triacylglycerols，TAGs）、甘油二酯（Diacylglycerols，DAGs）和膽固醇（Cholesterol）。甘油三酯參與各種疾病的進(jìn)程，包括心血管疾病、缺血性中風(fēng)和血脂異常等。甘油二酯與胰島素抵抗、老年癡呆和高血壓發(fā)病密切相關(guān)。膽固醇是動物細(xì)胞中含量最高的脂，不僅是構(gòu)建細(xì)胞膜的基礎(chǔ)成分，同時(shí)也是合成類固醇荷爾蒙、膽汁酸和維生素D的前體。

常規(guī)脂質(zhì)組的提取溶劑包括氯仿、甲醇、甲基叔丁基醚、異丙醇/甲醇等［28-29］。雖然在樣品的前處理過程中使用這些有機(jī)試劑可以提取到大多數(shù)類型高含量且具有代表性的脂質(zhì)。然而，對于特定感興趣脂質(zhì)的提取，則需要采用優(yōu)化過的提取溶劑體系。例如，單一有機(jī)溶劑提取體系，提取液中不會產(chǎn)生兩相分層，能夠更有效的提取整體脂質(zhì)組，如果使用兩相溶劑萃取會產(chǎn)生液面分層，導(dǎo)致極性脂質(zhì)的損失，包括鞘氨醇-1-磷酸、短鏈至中鏈游離脂肪酸等。然而，像Bligh-Dter這種兩相溶劑萃取的優(yōu)點(diǎn)是，水溶性雜質(zhì)進(jìn)入上面的水層后，可以減少脂質(zhì)組檢測時(shí)的基質(zhì)干擾和對儀器的污染。

脂質(zhì)組和代謝組一樣，某些成分提取時(shí)要求溶劑滿足特定pH值的要求。例如，磷脂酸、鞘氨醇-1-磷酸、磷酸肌醇需要酸性提取條件，否則會減低這類成分的提取效率。整體脂質(zhì)組的色譜分離，通常采用正相或反相色譜方法［30-33］。例如，水相選擇高比例的乙腈（乙腈∶水/60∶40）；有機(jī)相選擇一定比例的異丙醇/乙腈水；兩相均含有一定濃度的甲酸銨或乙酸銨［34-35］?；蜻x擇洗脫能力更強(qiáng)的氯仿、甲醇混合體系，以氨水或醋酸銨作為流動相添加劑。

9 代謝物成像

質(zhì)譜成像技術(shù)（Imaging MS，IMS）與GC/LCMS不同，在一次分析中能夠采集樣品中分子的空間分布種類與含量信息，包括代謝物、脂質(zhì)、多肽、多糖和蛋白等［36］。IMS對樣品處理要求簡單，只需將組織切成薄片，通過敞開式離子化技術(shù)，將質(zhì)譜檢測器獲得的數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為可視化的二維分布圖，即可獲得生物樣本中化學(xué)信息的空間分布。該技術(shù)要求首先設(shè)定（定義）好切片表面的橫軸與縱軸，以及網(wǎng)格區(qū)域。切片表面的分子被離子化后，進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，獲得對應(yīng)的網(wǎng)格區(qū)域（像素）質(zhì)譜圖。像素點(diǎn)的多少取決于IMS技術(shù)的空間分辨率。計(jì)算機(jī)軟件可以從采集的所有像素?cái)?shù)據(jù)中提取出特定質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio，m/z）的代謝物和其強(qiáng)度數(shù)據(jù)，然后以熱圖的形式呈現(xiàn)出樣品表面該分子的強(qiáng)度二維分布信息。IMS技術(shù)的不足之處在于靈敏度低、定量的可重復(fù)性有待提升。IMS與顯微鏡技術(shù)、拉曼光譜、磁共振成像技術(shù)（Magnetic Resonance Imaging，MRI）結(jié)合，可以顯著提升生物學(xué)信息的解析能力。隨著IMS采集數(shù)據(jù)速率、空間分辨率和檢測通量的提升，IMS已成分臨床和制藥領(lǐng)域的有力研究工具［37］。

1 0 總結(jié)與展望

雖然代謝組學(xué)的概念中涵蓋了分子量小于1500 kD的內(nèi)源性代謝物，然而這些成分結(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致其理化性質(zhì)各異，根據(jù)相似相溶原理，任何一種溶劑都局限于極性相似代謝物的提取。因此需要根據(jù)研究目的，首先提出所關(guān)注的代謝通路，然后選擇對應(yīng)的前處理方案。例如，選擇單一溶劑還是兩相溶劑萃取，溶劑pH值的調(diào)整，衍生化方法處理等。

基于HRMS技術(shù)的非靶向檢測，理論上可以覆蓋生物樣本中的全部小分子代謝物。然而，質(zhì)譜儀器具有檢測偏向性的特點(diǎn)，使得只有易于離子化的成分可以獲得檢測信號。對于低含量成分，需要采用檢測數(shù)目有限但靈敏度更高的靶向方法，必要時(shí)進(jìn)行衍生化前處理來增加其檢測靈敏度。對于常規(guī)ESI源難于電離的代謝物，通常采用APCI源來增強(qiáng)其離子化效率。

因此，要想全面獲得生物樣本中盡可能多的整體代謝組信息，需要不同前處理方法、多種色譜分析條件（正相、反相）、不同離子化方式（ESI、APCI）的高分辨質(zhì)譜非靶向掃描等多個(gè)分析策略相組合，同時(shí)還要結(jié)合高靈敏度的靶向檢測方法。然而，很多生物樣本比較珍貴，研究資源、儀器和經(jīng)費(fèi)等條件有限，運(yùn)用已知的全部分析手段來開展代謝組學(xué)研究是不現(xiàn)實(shí)的。所以，對于沒有明確目標(biāo)代謝通路的代謝組學(xué)研究，首選基于LC-（ESI）HRMS技術(shù)的非靶向代謝組檢測，采用反相色譜條件，正、負(fù)兩種電離模式，以獲取各條代謝通路中高豐度或易于離子化的代表性成分含量。當(dāng)從非靶向數(shù)據(jù)中挖掘出感興趣的代謝物時(shí)，根據(jù)需要，可以進(jìn)一步采用更加專屬的前處理和LC-MS靶向分析方法，采集候選代謝物所對應(yīng)的代謝通路及其上下游中所有成分的精準(zhǔn)定量數(shù)據(jù)，來揭示發(fā)生變化的代謝機(jī)制。隨著前處理方法的不斷開發(fā)、色譜儀器分析更加快速、質(zhì)譜儀器掃描速度和靈敏度持續(xù)增加，在一次非靶向分析生物樣品中，代謝組檢測的覆蓋度和通量將得到不斷提升。