徐雪亮 王奮山 劉子榮 范琳娟 季香云 蔣杰賢 姚英娟

（1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200；2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403）

1 RNAi沉默基因機(jī)制

RNAi是由外源雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)引起的目的基因mRNA沉默的現(xiàn)象［1］。自Fire等［2］1998年首次報(bào)道了注射外源dsRNA可造成秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）內(nèi)源性mRNA沉默的現(xiàn)象以來(lái)，RNAi已迅速成為研究基因功能、調(diào)控和有機(jī)體層面的反向遺傳學(xué)技術(shù)手段。隨著RNAi技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，其在病蟲害防治管理方面也顯示出了巨大的潛力，并在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目及鱗翅目等許多昆蟲中已經(jīng)得到了成功應(yīng)用［3］。

目前已知?jiǎng)游镏写嬖?種不同類型的小RNA可以觸發(fā)相應(yīng)的RNAi通路。第一種是由短/小干擾RNA（Short/small interfering RNA，siRNA）調(diào)控的siRNA通路，siRNA由外源或內(nèi)源的dsRNA加工為長(zhǎng)度一般為19-21 bp的dsRNA；第二種是由微小RNA（MicroRNA，miRNA）調(diào)控的miRNA通路，miRNA是長(zhǎng)度21-24 bp的單鏈非編碼RNA；第三種是與PIWI（P-element induced wimpy testis）蛋白相互作用的小RNA（piRNA）調(diào)控的piRNA通路，piRNA是長(zhǎng)度23-36 bp的單鏈RNA［4］。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的dsRNA時(shí)，該mRNA發(fā)生斷裂而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。當(dāng)dsRNA（外源或自身產(chǎn)生）進(jìn)入細(xì)胞后，首先由RNaseIII核酸酶家族的Dicer與dsRNA結(jié)合，隨后dsRNA被降解成19-21 bp長(zhǎng)度的小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA），然后siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，再解旋成單鏈RNA，并由該復(fù)合體主導(dǎo)RNAi效應(yīng)［5］。RISC被活化后，受siRNA引導(dǎo)（Guide-strand），通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性地結(jié)合在同源mRNA（靶標(biāo)）上，切斷標(biāo)靶mRNA，引發(fā)靶標(biāo)mRNA的分解，從而引發(fā)目標(biāo)基因的表達(dá)沉默。

2 雙鏈RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

一般來(lái)說(shuō)，dsRNA進(jìn)入生物體內(nèi)后才能誘導(dǎo)RNA干擾反應(yīng)。目前有兩種潛在的機(jī)制：秀麗隱桿線蟲體內(nèi)跨膜通道介導(dǎo)的途徑和果蠅S2細(xì)胞通過(guò)吞噬作用的途徑。昆蟲對(duì)dsRNA的攝取是高度復(fù)雜的，這不僅是因?yàn)椴煌锓N可能有不同的機(jī)制，還因?yàn)橥晃锓N可能依賴于多種機(jī)制。在昆蟲研究中，最基本的將dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)的方法主要包括顯微注射法、飼喂法、浸泡法和轉(zhuǎn)染法。近些年來(lái)，各種各樣的技術(shù)被開發(fā)并納入這些基本的方法中，包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體輔助、納米顆粒激活、共生體介導(dǎo)和植物介導(dǎo)的傳遞［6］。

2.1 顯微注射法

顯微注射法是應(yīng)用最普遍的傳遞dsRNA的方法［7］，將少量的dsRNA加入適當(dāng)?shù)娜芤褐兄苯幼⑸涞嚼ハx胚胎或體內(nèi)［8-9］。1998年，Kennerdell和Carthew［10］用顯微注射的方法將果蠅翅形成基因frizzled和frizzled2的dsRNA注入胚胎中，分別得到這兩個(gè)基因的缺陷型，首次實(shí)現(xiàn)了顯微注射dsRNA來(lái)研究昆蟲基因的功能。

2.2 飼喂法

飼喂法是與實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合的一種重要方法，在昆蟲的食物或者人工飼料中加入靶標(biāo)基因的dsRNA，dsRNA隨著昆蟲取食進(jìn)入體內(nèi)而達(dá)到導(dǎo)入dsRNA的目的。dsRNA的喂食主要方式：一是在微生物中表達(dá)dsRNA，供昆蟲取食，成功應(yīng)用微生物的有大腸桿菌［11］和釀酒酵母［12］；二是在體外合成dsRNA，再把dsRNA混在食物或溶液直接給昆蟲食用。

2.3 浸泡法

浸泡法是指將溶有dsRNA的液體浸泡或者噴灑于昆蟲的體表或者受精卵，從而達(dá)到靶標(biāo)基因沉默的一種方法。第一例浸泡法的實(shí)驗(yàn)是在線蟲中實(shí)現(xiàn)的，直接將線蟲浸泡在含有dsRNA的溶液中，成功實(shí)現(xiàn)了RNA干擾［13］。在昆蟲中，使用這種方法主要在細(xì)胞株中實(shí)施［14］。

2.4 轉(zhuǎn)染法

轉(zhuǎn)染法通過(guò)轉(zhuǎn)染劑將dsRNA直接傳送到細(xì)胞內(nèi)，比之浸泡法，轉(zhuǎn)染法可以更有效地將dsRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中［15］。Whard等［16］在果蠅幼蟲上測(cè)試了TransFectin、DMRIE-C、Cellfectin和Lipofectamine 2000等幾種轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染法導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)下調(diào)了31%-52%，而浸泡法僅下調(diào)了5%-8%，說(shuō)明轉(zhuǎn)染法有利于蟲體對(duì)dsRNA的吸收，更有效地實(shí)現(xiàn)RNAi效果。

2.5 轉(zhuǎn)基因植物法

轉(zhuǎn)基因植物法是指通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓植物自身表達(dá)靶標(biāo)基因的dsRNA，昆蟲取食植物的同時(shí)攝入dsRNA，可以沉默昆蟲體內(nèi)特定靶標(biāo)基因的表達(dá)，導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育異常甚至死亡從而達(dá)到防控害蟲的作用［17］。

3 RNAi技術(shù)在不同目昆蟲中的應(yīng)用

3.1 RNAi技術(shù)在雙翅目昆蟲中的研究進(jìn)展

雙翅目腹黑果蠅是昆蟲領(lǐng)域被普遍用于科學(xué)研究的最主要的一種模式昆蟲。合成寬帶果實(shí)蠅Zeugodacus scutellata一個(gè)雌成蟲高度表達(dá)的性別決定基因Transformer-2（Zs-Tra2）的dsRNA，通過(guò)向幼蟲顯微注射或者飼喂可表達(dá)該dsRNA的大腸桿菌細(xì)胞，可顯著增加雄蟲的比例［18］。Zeng等［19］研究報(bào)道了利用顯微注射儀將蚊子氣味受體基因dsRNA注入致倦庫(kù)蚊雌蛹，然后通過(guò)排斥性生物活性測(cè)定試驗(yàn)篩選出了介導(dǎo)驅(qū)避對(duì)于特異植物源化合物的氣味受體。通過(guò)飼喂dsRNA沉默遲眼蕈蚊一個(gè)A型谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因BoGSTd2的表達(dá)水平，降低了毒死蜱和噻蟲胺誘導(dǎo)的活性氧的清除能力，從而增強(qiáng)了遲眼蕈蚊對(duì)毒死蜱和噻蟲胺的敏感性。說(shuō)明BoGSTd2基因在毒死蜱和噻蟲胺解毒中起重要作用，保護(hù)遲眼蕈蚊組織不受這些殺蟲劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響［20］。白紋伊蚊卵黃蛋白基因Vitellogenin-2（Vg-2）的高表達(dá)水平與糖喂養(yǎng)的雌蚊最低的求偶活動(dòng)相關(guān)。通過(guò)RNA干擾敲除Vg-2基因恢復(fù)了雌蚊的求偶行為，證明白紋伊蚊Vg-2基因表達(dá)在調(diào)節(jié)求偶行為中起著關(guān)鍵作用［21］。

3.2 RNAi技術(shù)在鞘翅目昆蟲中的研究進(jìn)展

科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）（Say）是一種主要的茄科作物害蟲，MDR基因是一類編碼ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B亞家族（ABCB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的多藥抗性基因。Favell等［22］將可表達(dá)多藥抗性MDR基因dsRNA的細(xì)菌涂抹馬鈴薯葉片飼喂幼蟲，MDR基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照顯著降低了90%以上，生物活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示成蟲的存活率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明馬鈴薯甲蟲的MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與伊維菌素的解毒作用無(wú)關(guān)。茄二十八星瓢蟲是蔬菜上危害最嚴(yán)重的害蟲之一。讓瓢蟲幼蟲和成蟲取食涂抹表達(dá)dsHvSnf7細(xì)菌的龍葵葉片，可導(dǎo)致1齡幼蟲、2齡幼蟲和成蟲的死亡率分別是98%、88%和60%，說(shuō)明HvSnf7可以作為一種潛在的RNAi的靶標(biāo)基因用于防控茄二十八星瓢蟲［23］。胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin/insulin-like growth factor，IGF）信 號(hào)（Insulin/insulin-like growth factor signaling，IIS）是昆蟲在營(yíng)養(yǎng)依賴條件下的性選擇武器生長(zhǎng)的潛在的一種主要生理機(jī)制。然而，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)與武器生長(zhǎng)相結(jié)合的分子機(jī)制仍是未知的。Okada等［24］注射胰島素肽類基因GcorILP2的dsRNA可減小廣角面粉甲蟲Gnatocerus cornutus雄蟲下頜骨的大小，說(shuō)明GcorILP2基因參與調(diào)控廣角面粉甲蟲武器的生長(zhǎng)。Pinheiro等［25］通過(guò)顯微注射法和飼喂法轉(zhuǎn)運(yùn)4個(gè)靶標(biāo)基因（Prosα2、RPS13、Snf7和V-ATPase A）的dsRNA進(jìn)入斯里蘭卡象鼻蟲成蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，兩種轉(zhuǎn)運(yùn)方式均能觸發(fā)穩(wěn)定的RNAi反應(yīng)，這表明基于RNAi技術(shù)可以開發(fā)一種可選擇性的相對(duì)環(huán)境安全的控制這種害蟲的策略。

3.3 RNAi技術(shù)在膜翅目昆蟲中的研究進(jìn)展

經(jīng)過(guò)改造蜜蜂腸道一種共生菌Snodgrassella alvi wkB2，使其可以持續(xù)產(chǎn)生dsRNA，調(diào)控宿主基因表達(dá)，保護(hù)蜜蜂免受病原體和寄生蟲侵害［26］。黃瘋蟻（Nylanderia fulva）是美國(guó)一種新的入侵害蟲，以高繁殖和形成超級(jí)群體的能力對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境為害嚴(yán)重?？蒲泄ぷ髡邔⒖杀磉_(dá)NfCOPβ（參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因）和NfArgK（細(xì)胞能量?jī)?chǔ)備調(diào)節(jié)基因）dsRNA的細(xì)菌加入人工飼料供工蟻取食，導(dǎo)致螞蟻的存活率相對(duì)于對(duì)照顯著降低了15%［27］。蝶蛹金小蜂淀粉酶基因PpAmy1在其消化道高度表達(dá)，利用RNAi技術(shù)沉默該基因可顯著地縮短成蟲壽命［28］。在蜜蜂中，雙鏈RNA（dsRNA）和小干擾RNA（siRNA）均能顯著減少靶向基因的表達(dá)水平，研究表明siRNA混合對(duì)酪胺受體tyr1基因沉默效率優(yōu)于dsRNA，并且dsRNA與siRNA的敲除時(shí)間長(zhǎng)短不同［29］。將合成的葉蜂Ardsx基因dsRNA注射入幼蟲腹部，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)雄蜂生殖器官產(chǎn)生了嚴(yán)重缺陷［30］。

3.4 RNAi技術(shù)在半翅目昆蟲中的研究進(jìn)展

新熱帶棕色椿象Euschistus heros是南美洲大豆生產(chǎn)中一種最主要的害蟲，其轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析鑒定RNA干擾的核心基因發(fā)現(xiàn)缺乏sid-like基因，并通過(guò)注射dsRNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)siRNA機(jī)制的有效性。最后設(shè)計(jì)靶向V-ATPase-A基因的dsRNA，顯微注射96 h后成蟲的死亡率為35%，說(shuō)明盡管缺乏sid-like基因，顯微注射dsRNA仍然具有RNAi效果［31］。向棉粉蚧成蟲和蛹注射DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因PsDnmt1A和PsDnmt1B的小干擾RNA，24 h和72 h后這兩個(gè)基因的表達(dá)水平均顯著下降，導(dǎo)致雌成蟲死亡和體色異常，還造成雄成蟲翅發(fā)育異常。結(jié)果表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因在調(diào)節(jié)棉粉蚧雌雄異形方面起著關(guān)鍵作用［32］。Chen等［33］將合成的兩個(gè)味覺受體基因NlGr10a和NlGr10b的dsRNA，注射入羽化1 d的褐飛虱雌成蟲體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsNlGr10a不會(huì)影響NlGr10b的表達(dá)量。NlGr10a和NlGr10b被敲除后，褐飛虱產(chǎn)卵數(shù)量和孵化率分別下降了43.19%和26.14%，37.82%和10.70%。此外，NlGr10a基因敲除后的卵孵化率明顯低于NlGr10b基因敲除后的卵孵化率，說(shuō)明NlGr10a和NlGr10b調(diào)節(jié)了褐飛虱的繁殖力，NlGr10a對(duì)褐飛虱繁殖力的影響強(qiáng)于NlGr10b。3種蚜蟲——橘蚜（Aphis citricidus）、豌豆長(zhǎng)管蚜（Acyrthosiphon pisum）和桃蚜（Myzus persicae）的一個(gè)表皮蛋白基因CP19s序列相似度為86.6%-94.4%，但與其捕食性天敵龜紋瓢蟲的序列相似度很低。因此，設(shè)計(jì)合成CP19s基因dsRNA，用于飼喂3種蚜蟲，然后將蚜蟲幼蟲供于龜紋瓢蟲取食，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種蚜蟲CP19s基因的表達(dá)水平下降了39.3%-64.2%，導(dǎo)致蚜蟲的死亡率為45.8%-55.8%。同時(shí)，該基因的dsRNA對(duì)龜紋瓢蟲CP19s基因的表達(dá)水平和發(fā)育歷期均無(wú)顯著影響。結(jié)果說(shuō)明這個(gè)表皮蛋白基因CP19是一個(gè)有前途的針對(duì)蚜蟲的RNAi靶點(diǎn)，可以通過(guò)dsRNA設(shè)計(jì)來(lái)控制蚜蟲同時(shí)對(duì)捕食性天敵無(wú)顯著不利影響，是一種有效的RNAi害蟲防治策略［34］。

3.5 RNAi技術(shù)在直翅目昆蟲中的研究進(jìn)展

東亞飛蝗作為一種模式昆蟲，也是直翅目昆蟲中被研究最多的一種昆蟲。DNA甲基化在動(dòng)物的行為可塑性中起著重要的作用。通過(guò)RNAi降低東亞飛蝗DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因Dnmt3的表達(dá)量，顯著改變了蝗蟲大腦基因表達(dá)譜，并抑制了激素受體HR3的表達(dá)，導(dǎo)致獨(dú)居蝗蟲的與群居和擁擠相關(guān)的移動(dòng)能力顯著降低［35］。通過(guò)顯微注射東亞飛蝗的芳烴受體基因LmAhR的dsRNA，有效降低了色氨酸誘導(dǎo)的AhR基因的和細(xì)胞活性氧產(chǎn)物的表達(dá)水平，從而減弱了色氨酸對(duì)蝗蟲的致死作用［36］。在誘導(dǎo)滯育（短光周期）處理下，東亞飛蝗的一種神經(jīng)肽FaRPs的前體基因flrf表達(dá)水平明顯高于非誘導(dǎo)滯育（長(zhǎng)光周期）處理。向東亞飛蝗注射dsflrf，使其表達(dá)量降低了75.8%-89.2%，導(dǎo)致蝗蟲滯育率顯著下降，說(shuō)明flrf基因可促進(jìn)蝗蟲的滯育［37］。

3.6 RNAi技術(shù)在鱗翅目昆蟲中的研究進(jìn)展

Gurusamy等［38］利用Cellfectin II轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)建的dsRNA，將其用于飼喂草地貪夜蛾幼蟲，檢測(cè)到iap基因顯著下調(diào)，導(dǎo)致幼蟲生長(zhǎng)遲緩，甚至死亡，說(shuō)明使用該轉(zhuǎn)染劑傳遞dsRNA可以提高草地貪夜蛾細(xì)胞和組織的RNAi效率。Br-C基因是昆蟲20-羥基蛻皮激素信號(hào)通路中一種重要基因，在昆蟲的生長(zhǎng)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。舞毒蛾4齡幼蟲取食表達(dá)LdBr-C基因dsRNA細(xì)菌的人工飼料，敲除導(dǎo)致幼蟲發(fā)育畸形，體重顯著下降，取食6 d后的死亡率為67.18%。同時(shí)Br-C基因的敲除還顯著下調(diào)了8個(gè)與幾丁質(zhì)合成和代謝有關(guān)的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，這些結(jié)果表明Br-C基因的敲除影響舞毒蛾幼蟲的發(fā)育和幾丁質(zhì)的合成［39］。向小菜蛾敏感種群幼蟲注射PxTryp_SPc1基因的dsRNA，顯著下調(diào)PxTryp_SPc1基因的表達(dá)量，降低顯著降低了酪蛋白水解和胰蛋白酶活性，使Cry1Ac原蛋白激活，從而降低了小菜蛾敏感種群對(duì)Cry1Ac原蛋白的敏感性，這說(shuō)明該基因的低水平表達(dá)促進(jìn)了木小菜蛾對(duì)Cry1Ac的抗性［40］。家蠶Bmsage是一種bHLH轉(zhuǎn)錄因子，參與家蠶胚期絲腺的發(fā)育。Hou等［41］合成家蠶Bmsage的dsRNA并注射入卵內(nèi)沉默該基因的表達(dá)，導(dǎo)致絲腺的細(xì)胞數(shù)量減少，影響蠶絲的合成和產(chǎn)量，證明了Bmsage通過(guò)細(xì)胞周期蛋白通路調(diào)控家蠶絲腺的發(fā)育。

4 總結(jié)與展望

RNAi是現(xiàn)階段研究昆蟲功能基因組領(lǐng)域普遍應(yīng)用的一種技術(shù)，尤其在昆蟲靶標(biāo)基因功能方面表現(xiàn)出高效可靠的潛能［42］。但是，RNAi技術(shù)的應(yīng)用也存在著一些問(wèn)題，最主要的是多種因素的影響會(huì)降低干擾效率，導(dǎo)致干擾效果并不理想。首先是靶標(biāo)基因的選擇，昆蟲不同基因的干擾效果并不相同。其次，不同昆蟲種類間RNAi的效果也有差異，如鞘翅目昆蟲的RNAi效果很好，而鱗翅目昆蟲的RNAi效果均不太理想［43］。再次，昆蟲體內(nèi)的核酸酶可以降解dsRNA，這是對(duì)豌豆蚜進(jìn)行RNAi所需要解決的一大難題［44］。此外，昆蟲不同部位組織的RNA干擾效率也不一致［45］。RNAi在病蟲害管理中的廣泛應(yīng)用面臨主要問(wèn)題包括：昆蟲間RNAi效率不穩(wěn)定、缺乏可靠的dsRNA傳遞方法、脫靶和非靶標(biāo)效應(yīng)以及昆蟲種群中潛在的抗性發(fā)展等。

盡管RNAi效率受到多種因素的影響，但是該技術(shù)已成為一種被廣泛應(yīng)用于研究昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、生理和分子過(guò)程的強(qiáng)有力的工具，其對(duì)環(huán)境友好、安全及對(duì)非靶標(biāo)昆蟲影響小的特點(diǎn)，具有成為害蟲綠色防治新策略的巨大潛力。未來(lái)，RNAi技術(shù)仍將是研究靶標(biāo)基因功能的首選科研手段，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，更高效率和更加快速的RNAi技術(shù)在昆蟲科學(xué)研究中尤其是在開發(fā)dsRNA殺蟲劑防治害蟲中有廣闊發(fā)展前景。