李信申 黃小梅 吳淑秀 黃瑞榮 魏林根 華菊玲

（1. 江西省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，南昌 330200；2. 江西生物科技職業(yè)學院，南昌 330200；3. 江西省鷹潭市農(nóng)業(yè)和糧食局，鷹潭 335000；4. 江西省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料與資源環(huán)境研究所，南昌 330200）

作物青枯病為毀滅性的土傳病害，是世界上第二種具有重要研究價值及危害嚴重的細菌病害［1］。病原菌為屬于革蘭氏陰性的β-變形菌綱的茄科雷爾氏菌，簡稱青枯病菌（Ralstonia solanacearum）。青枯病菌寄主范圍十分廣泛，可侵染番茄、馬鈴薯、煙草、茄子、花生、四季豆、香蕉、生姜、桑樹、桉樹和木麻黃等54個科的450余種植物［2-3］。青枯病菌地理分布范圍也十分廣泛，遍及熱帶、亞熱帶、溫帶乃至中高緯度地區(qū)［4］。青枯病菌生態(tài)適應性強，可長期存在于包括地表水體和各種類型土壤在內(nèi)的各種環(huán)境條件下。作為土壤習居菌，即使缺乏感病的寄主植物，青枯病菌也可長期存活在土壤中［5］。青枯病菌傳播途徑廣泛，可通過農(nóng)事操作、地表流水及帶菌植物材料調(diào)運進行傳播，且近年來青枯病菌在世界上傳播的范圍在逐漸擴大。青枯病菌主要隨病殘體在土壤中越冬，從根部或莖基部傷口或自然孔口侵入，在根部皮層定殖，隨后侵入木質(zhì)部導管，并沿著植物木質(zhì)部導管蔓延擴散，導致植株出現(xiàn)萎蔫、維管束褐變、直至整株枯死［6］。對青枯病害的快速、準確地檢測診斷，可為采取及時有效的防控措施提供依據(jù)。

目前，除了常規(guī)的選擇性分離技術，還形成了酶聯(lián)免疫反應、限制性片段長度多態(tài)性和聚合酶鏈式反應等多種青枯病菌檢測方法。半選擇性分離技術檢測時間長，且靈敏度比較低；酶聯(lián)免疫反應、間接免疫熒光抗體染色法和免疫熒光菌落染色法中多克隆抗體對青枯病菌特異性差，常出現(xiàn)假陽性檢測結果；限制性片段長度多態(tài)性和聚合酶鏈式反應檢測法靈敏度高，但PCR反應體系易受到植物和土壤中抑制劑影響［7-8］。近些年，隨著PCR檢測技術的不斷完善，形成了基于16S rDNA、內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase，egl）、hrpB和鞭毛蛋白fliC基因等目標基因的PCR、Co-PCR和RT-PCR檢測技術［9-12］。這些PCR檢測技術具有靈敏度高、特異性好、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點，但過分依賴昂貴的儀器設備［13］。

2000年，Notomi等［14］報道了一種新型的用于核酸高效擴增的環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。該技術針對目的基因序列的6個特異性區(qū)域設計6對引物，在60-65℃等溫條件下，恒溫30-60 min，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶催化下，實現(xiàn)目的基因的擴增，具有特異性好、靈敏度高、反應時間短、操作方便和不需要昂貴的儀器等優(yōu)點。目前，已報道了基于青枯病菌16S rRNA、fliC基因、egl基因及l(fā)pxC基因的LAMP檢測方法［13，15-18］?，F(xiàn)有的青枯菌檢測方法在生產(chǎn)實踐中的應用仍具相當?shù)木窒扌裕狙芯窟x取了細胞色素C信號肽序列設計引物，建立了簡單、快速的檢測植物青枯病菌的LAMP技術體系，并分析了LAMP技術的特異性、通用性和靈敏度。為植物青枯病的早期診斷和帶菌繁殖材料檢測提供技術支持，從而降低植物青枯病造成的損失，對植物青枯病的防控具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人工接種和田間自然發(fā)病條件下芝麻、花生、馬鈴薯、辣椒、番茄、茄子和凹頭莧病株，對照為芝麻、花生、馬鈴薯、辣椒、番茄、茄子和凹頭莧健株。菌株：12個青枯病菌菌株和2個非青枯病菌菌株（表1）由本實驗室保存。

表1 用于檢測引物特異性的青枯病菌和非青枯病菌菌株

細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（北京）；Bst2.0 DNA聚合酶購于New England Biolabs公司（美國）；硫酸鎂、鈣黃綠素與甜菜堿購自Sigma Aldrich公司（美國）；rTaq DNA聚合酶、dNTP Mixture和DL2000 Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。HHS型水浴鍋購于上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，JY600C 型電泳槽購自北京君意東方電泳設備有限公司，MyCycler PCR儀與Gel DocTM XR+凝膠成像儀購于美國bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 挑取培養(yǎng)于 0.1×TSB 固體平板上的青枯雷爾氏菌單菌落，接種于5 mL 0.1×TSB 液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌體，按照天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明操作，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣量為5 μL。

1.2.2 引物設計與合成 選擇菌株GMI1000細胞色素C信號肽序列作為檢測靶標。利用 LAMP 在線引物免費設計軟件Primer Explorer 4.0（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）進行引物設計，其中包括兩條內(nèi)引物 FIP、BIP，兩條外引物 F3、B3（表1）；PCR驗證方法中所用引物為外引物，由上海捷瑞基因技術有限公司合成。引物序列如下（表2）。

表2 用于環(huán)式擴增細胞色素C信號肽的引物序列

1.2.3 反應體系的優(yōu)化 參照Notomi等［19］所報道的文獻配制檢測體系，LAMP反應體系為25 μL，終濃度反應物包括：2.5 μL 10×Thermo Pol buffer，1.4 mmol/L dNTP，1 μLBst2.0 DNA聚合酶（8000 U/μL），1 μL DNA 模板（菌株Seppx05），優(yōu)化過程中分別試 驗 了0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 μL 100 mmol/L 7種濃度MgSO4；設置了內(nèi)外引物濃度比 梯 度 為2∶1（0.4∶0.2 μmol/L）、4∶1（0.8∶0.2 μmol/L）、6∶1（1.2∶0.2 μmol/L）、8∶1（1.6∶0.2 μmol/L）、10∶1（2.0∶0.2 μmol/L）和12∶1（2.4∶0.2 μmol/L）的不同濃度內(nèi)外引物；設置反應溫度梯度為59、60、61、62、63、64、65℃ 恒溫溫育60 min，80℃保溫10 min，使 BstDNA聚合酶變性失活終止反應；顯色反應時添加1 μL鈣黃綠素，1 μL MnCl2。

1.2.4 PCR反應體系及反應條件 PCR反應體系為25 μL，終濃度反應物包括：2.5 μL 10×Taq buffer，0.2 μL d NTP，0.2 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL），0.5 μmmol/L上下游引物（F3和B3引物），1 μL DNA 模板，去離子水補足至 25 μL。PCR反應條件如下：預變性，95℃ 3 min；35個循環(huán)：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；最后72℃ 5 min.

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 LAMP反應結束后，通過觀察顏色的變化進行判斷，實驗結果利用Nikkon相機記錄；LAMP產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物電泳分析：取2 μL反應產(chǎn)物，在2%的瓊脂糖凝膠上90 V恒壓電泳30 min，凝膠成像儀掃描拍照。

1.2.6 特異性實驗 為了驗證引物檢測青枯病菌菌株的特異性，分別以分離于茄子、番茄、辣椒、花生、芝麻、姜、馬鈴薯和煙草的青枯病菌菌株為模板（表1），以滅菌水為對照，按照1.2.3所述體系操作進行LAMP擴增和PCR擴增，每個實驗重復3次。

1.2.7 靈敏度實驗 將提取的青枯病菌菌株Seppx05基因組濃度稀釋至100 ng/μL，以此為初始模板，隨后按照1∶10的比例進行梯度稀釋，各濃度級分別取1 μL作為LAMP反應模板，滅菌水為對照；并以上述各濃度級基因組為模板分別進行LAMP擴增和PCR擴增反應，每個實驗重復3次。

1.2.8 人工接種罹病植物樣品青枯菌LAMP檢測 接種方法參照華菊玲等［20］的試驗方法進行操作，即將所選5個菌株Ejxnc01、Tjxjx01、Pjxga01、Seppx05和JSja03接種于蔗糖蛋白胨瓊脂（SPA）培養(yǎng)基上，28℃過夜培養(yǎng)，配成1×108CFU/mL菌懸液。用滅菌剪刀蘸取菌液在花生完全展開的葉片進行剪葉接種；用滅菌注射器吸取菌液在茄子、番茄、芝麻和凹頭莧莖稈中部葉腋處注射菌懸液進行針刺接種，每株注射0.1 mL。26-30℃溫室條件下定時噴水保濕。分別取所選菌株接種7 d 后表現(xiàn)明顯萎蔫癥狀的茄子、番茄、花生、芝麻和凹頭莧病株和對應的健康植株各1 株，截取癥狀典型的病莖5 cm左右，剪去兩頭，懸浮于5 mL無菌水的試管中并剪碎，靜置30 min后，以此懸浮液為模板，以無菌水為空白對照，采用LAMP技術檢測。采用離體接種法將青枯病菌菌株Pjxnc01接種馬鈴薯塊莖，利用75%乙醇溶液對塊莖進行表面消毒，并用無菌水清洗兩次，晾干，再用滅菌手術刀將薯塊切成厚0.5 cm左右的薯片，放在有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中，薯片表面均勻涂布0.1 mL 1×108CFU/mL菌懸液，28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，截取約2×2 cm 的罹病和健康塊莖組織，懸浮于5 mL無菌水中并研碎，靜置30 min后，以該液體為模板，以無菌水為空白對照進行LAMP檢測。

1.2.9 田間疑似罹病植株青枯病菌LAMP檢測 為檢驗該技術對田間樣品檢測的可行性，先后采集了芝麻、花生、番茄疑似罹病植株地上部分，甘薯、馬鈴薯疑似罹病塊莖（表2）。采用1.2.8的方法進行LAMP檢測，并同步進行PCR檢測。

2 結果

2.1 LAMP反應體系的優(yōu)化

2.1.1 鎂離子濃度優(yōu)化 試驗中鎂離子添加濃度設置了終濃度分別為0、2、4、6、8、10 和12 mmol/L等7個不同處理，以無菌水為模板作空白對照。結果圖1-A中可以看出，當 MgSO4濃度在2-12 mmol/L時，均出現(xiàn)明亮的DNA 擴增產(chǎn)物，其中當MgSO4添加濃度為6 mmol/L時，DNA 擴增條帶均清晰且達到最亮。因此，本試驗中鎂離子最適濃度為 6 mmol/L。

圖1 LAMP反應體系的優(yōu)化

2.1.2 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化 設置內(nèi)外引物濃度比 梯 度 為2∶1（0.4∶0.2 μmol/L）、4∶1（0.8∶0.2 μmol/L）、6∶1（1.2∶0.2 μmol/L）、8∶1（1.6∶0.2 μmol/L）、10∶1（2.0∶0.2 μmol/L）和12∶1（2.4∶0.2 μmol/L）分別進行 LAMP 擴增，以探索適用于植物青枯病菌LAMP檢測體系的最佳內(nèi)外引物濃度比，以無菌水為模板作空白對照，結果圖1-B中可以看出，在內(nèi)外引物濃度比為6∶1、8∶1、10∶1和12∶1時產(chǎn)生了清晰的梯度性條帶，從條帶亮度上看，內(nèi)外引物濃度比8∶1時使用的內(nèi)引物較少且能產(chǎn)生相似的擴增效果，因此選擇內(nèi)外引物濃度比8∶1作為該擴增體系的內(nèi)外引物濃度比。

2.1.3 反應溫度的優(yōu)化 設置溫度梯度為：59、60、61、62、63、64和65℃進行LAMP擴增，以優(yōu)化植物青枯病菌檢測體系的最佳反應溫度，以無菌水為模板作空白對照。從圖1-C中可以看出，59-65℃條件下均產(chǎn)生了清晰的梯度性條帶，本文選用63℃作為本實驗的溫度。

2.2 特異性實驗

利用本試驗所建立的LAMP體系，分別以12個青枯病菌菌株和2個非青枯病菌菌株為模板，以無菌水為對照，進行LAMP 擴增反應。結果如圖2所示，含有青枯病菌菌株反應管中溶液顏色均變?yōu)榫G色，表明LAMP反應體系內(nèi)大量目的片段進行了擴增；含有非青枯病菌菌株及陰性對照的反應管中溶液顏色均為桔紅色，表明LAMP反應體系內(nèi)的目的片段未進行大量擴增，且該檢測過程未出現(xiàn)假陽性。

2.3 靈敏度實驗

以提取的100 ng/μL青枯病菌基因組為初始模板，按照1∶10的比例進行梯度稀釋，依次為模板進行LAMP擴增和PCR擴增反應。結果如圖3所示，LAMP擴增反應檢測結果的最低靈敏度為1 pg /μL，比常規(guī)PCR檢測方法高100倍。

2.4 人工接種植物青枯病樣品LAMP 檢測

在茄子、番茄、花生、芝麻和凹頭莧接種青枯病菌7 d后，分別以這些植物病株和對應健株的組織浸出液為模板進行LAMP 擴增，以無菌水為空白對照。結果見圖4所示，茄子、番茄、花生、芝麻和凹頭莧病株反應液均呈現(xiàn)綠色，茄子、番茄、花生和芝麻病株健株及空白對照的反應液保持桔紅色，表明茄子、番茄、花生、芝麻和凹頭莧病株中青枯病菌的LAMP檢測結果為陽性。分別以人工接種青枯病菌菌株Pjxnc01后的馬鈴薯罹病塊莖組織液及健康塊莖組織液為模板，以無菌水為空白對照，進行LAMP 擴增，結果見圖5所示，罹病馬鈴薯塊莖反應液呈現(xiàn)綠色，健康馬鈴薯塊莖及空白對照的反應液保持桔紅色，表明罹病馬鈴薯塊莖樣品中LAMP檢測結果為陽性。因此，本研究建立的LAMP檢測技術可用于不同植物組織內(nèi)青枯病菌的檢測，且不受植物組織浸出液內(nèi)物質(zhì)的干擾。

圖2 LAMP反應的特異性

圖3 LAMP反應的靈敏度

圖4 茄子、番茄、花生、芝麻和凹頭莧罹病組織液中青枯菌的LAMP檢測

圖5 馬鈴薯罹病樣品組織液中青枯菌的LAMP檢測

2.5 田間疑似罹病植株LAMP檢測

利用建立的植物青枯病菌LAMP檢測體系，對采集的不同植物疑似罹病樣品進行的LAMP檢測表明，利用LAMP 擴增法對芝麻、花生、番茄的莖桿和馬鈴薯、甘薯的塊莖進行檢測，檢測率分別為100%、95.83%、100%、95.83%和95.45%；而用PCR擴增方法對芝麻、花生、番茄、馬鈴薯的莖桿和甘薯的塊莖進行檢測，檢測率分別為92.00%、87.50%、91.30%、91.67%和90.91%。健康植株和無菌水的LAMP和PCR檢測結果均為陰性，電泳結果與致病性檢測結果一致，沒有出現(xiàn)假陰性和假陽性（表3）。由此可見構建的LAMP方法靈敏快速地檢測出罹病芝麻、花生、番茄、馬鈴薯、甘薯等5種作物中的青枯病菌，且其檢出率遠高于PCR擴增法。

表3 疑似罹病植株樣本LAMP和PCR檢測結果

3 討論

植物青枯病是世界范圍內(nèi)具有致病性強、寄主范圍廣和土壤生存時間長特點的毀滅性細菌病害之一［21］。目前，青枯病菌的新寄主植物范圍在不斷擴大，僅在我國分布的寄主植物就高達90多種，除了常見的茄科植物外，還包括新報道的苦瓜［22］、葉甜菜［23］、無花果［24］和藍莓等植物［3］，以及藍眼菊、長春花和雪朵花等自然條件下無癥狀寄主［25］。并且青枯病菌在番茄、馬鈴薯、大麗花、鳳仙花和天竹癸等植株莖內(nèi)分布的菌量低于臨界閾值 108CFU/g時，不表現(xiàn)青枯癥狀，達到臨界閾值時，植株才出現(xiàn)萎蔫癥狀［26-28］。這就造成了植物青枯病早期診斷的困難，延誤了藥劑防治的最佳防治時期。因此，建立快速有效的檢測方法，及時檢測出植物繁殖材料、幼苗和植株中攜帶的青枯病菌，進行藥劑防治，可減弱病害的發(fā)生和流行，減少植物產(chǎn)量的損失。

目前植物病原菌常用的檢測方法，包括平板培養(yǎng)基分離純化法、免疫血清學、常規(guī)PCR和熒光定量PCR等方法；但傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)基分離純化法所需時間較長、且靈敏度低，免疫血清學技術檢測靈敏度低、特異性差、易造成假陰性，常規(guī)PCR和熒光定量PCR等技術嚴重依賴于儀器設備和人員?；贚AMP技術的新基因擴增方法，憑借反應快速、靈敏度高、特異性強和操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生等諸多領域［19］?，F(xiàn)今，在農(nóng)業(yè)領域，LAMP技術廣泛運用于馬鈴薯環(huán)腐病菌［29］，番茄細菌性斑點病菌［30］、馬鈴薯黑脛病菌［31］、柑橘潰瘍病菌［32］、柑橘頑固?。ń┗。┚?3］、煙草野火病菌［34］、煙草角斑病菌［34］和魔芋軟腐病菌［35］等植物病原細菌的檢測，甚至人工難以培養(yǎng)的柑橘黃龍病菌也可利用LAMP技術進行檢測［36］。

細胞色素C是一種小球形的蛋白，為線粒體電子傳遞鏈中的載體，參與細胞的呼吸過程，在能量轉移過程中發(fā)揮著極為重要的作用。此外，還在細胞凋亡、細胞修復過程等生命活動中發(fā)揮作用［37］。所有的細胞色素C蛋白都要部分相同的結構特征，但序列卻高度變異，顯示出較強的物種特異性，常作為靶標基因進行目標物種檢測。Kang等［38］基于細胞色素C信號肽序列設計了PCR引物，對多個國家分離的13個不同演化型菌株進行擴增，表現(xiàn)出高度特異性，運用于植物青枯病的檢測。胡利偉等［39］報道以細胞色素C基因為靶標，采用鎖核苷酸增敏的熒光定量PCR技術，可高效快速地對煙草土壤中青枯病菌進行定量檢測。目前，青枯病菌的檢測大多利用16S rRNA、fliC、egl和lpxC為靶標基因建立LAMP檢測方法，未見以細胞色素C基因為靶標基因建立LAMP檢測方法的報道，本研究以細胞色素C基因為靶標，建立了鑒定青枯病菌的LAMP檢測方法，除了茄子、番茄、花生和芝麻植株外，還在隱性寄主—凹頭莧病株上檢測出青枯病菌的存在，證明了此方法對青枯病菌的檢測具有高度特異性和通用性，可高效、快速和特異性檢測出田間自然發(fā)病的芝麻、花生、番茄、馬鈴薯和甘薯等病株內(nèi)青枯病菌，且檢出率均高于普通PCR的檢出率。本研究在反應管中直接加入鈣黃綠素染料，實現(xiàn)可視化檢測，避免了通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察擴增結果，造成實驗室氣溶膠污染的缺點；以不同演化型和生理小種的青枯病菌菌株為檢測對象，確保本研究建立的LAMP檢測方法具有通用性、適用性和特異性。通過對人工接種發(fā)病的茄子、番茄、辣椒、芝麻和凹頭莧莖部浸出液和馬鈴薯塊莖組織液中的青枯病菌，以及田間自然發(fā)病的芝麻、花生、番茄、馬鈴薯和甘薯病株內(nèi)青枯病菌進行檢測，證明了本研究所建立的LAMP檢測方法的適用范圍更廣，適于在基層推廣運用，因而具有廣闊的應用前景。

自Notomi等［14］首次報道的LAMP技術以來，還形成了多種以LAMP技術為核心的檢測技術，其中包括逆轉錄LAMP（Reverse transcriptase LAMP，RT-LAMP）技術、多重LAMP技術和Electric LAMP技術等。RT-LAMP技術以逆轉錄酶合成的cDNA為模板進行核酸擴增，增加了以RNA為遺傳物質(zhì)的檢測對象的種類［14］。多重LAMP 技術對多個目標片段進行核酸擴增，實現(xiàn)了2種及以上病原菌的檢測［40］。Electric LAMP技術利用電子模擬快速篩選LAMP引物，提高LAMP檢測的效率［41］。In-disc LAMP技術通過電子設備實時測定動態(tài)變化，實現(xiàn)了對少量目標DNA的監(jiān)測［42］。盡管這些LAMP技術在田間檢測中具有巨大的應用潛力，仍存在一些不足。主要為：（1）難以選擇正確、合適的基因高度保守區(qū)域及某些特異性靶點；（2）引物設計難；（3）適用范圍窄，不適用于克隆產(chǎn)物為小型DNA片段；（4）實驗操作過程中易污染；（5）易出現(xiàn)假陽性結果；（6）檢測人員對反應結果顏色變化的判斷易出現(xiàn)偏差；難以出客觀的檢測結論［43-44］。為了克服這些缺點，使之更加適于田間檢測，Chen等［45］將混合后的LAMP反應試劑進行了凍干處理，降低了周圍環(huán)境溫度變化對反應試劑的影響，延長了儲存期，簡化了田間檢測的操作過程。為了提高LAMP檢測技術的靈敏度和特異性，近年來，將LAMP技術 與 基 于CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/ Cas9 的基因編輯系統(tǒng)相結 合，建 立 了CAS-EXPAR（Cas9）、SHERLOCK（Cas13））、DETECTR（Cas12a）和Cas14-DETECTR檢測技術，將檢測的特異性提高到單個堿基水平，檢測的靈敏度提高到了attomolar 水平［46-47］。為了避免污染對LAMP檢測結果的影響，LAMP技術結合CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)，建立了CUT-LAMP檢測技術，對非靶位點區(qū)進行切除，消除了交叉污染物對LAMP檢測結果的干擾，進而避免產(chǎn)生假陽性結果［48］。此外，基于 LAMP 的比色生物傳感器、熒光生物傳感器、電化學生物傳感器以及其他種類的生物傳感器被廣泛應用于植物病原菌檢測［49］。在這些檢測方法中，光學檢測方法操作簡單、不需要昂貴的儀器，可直接用肉眼判斷出結果，更適用于田間現(xiàn)場快速檢測領域的應用，其中側向流層析試紙條（LFD）是所有檢測設備中最受歡迎、應用做多的一種核酸擴增產(chǎn)物分析工具［50］。而LAMP技術、CRISPR / Cas9基因編輯系統(tǒng)及LFD 相結合可為病原菌的檢測提供一個更便攜、簡單、高靈敏度和特異性的可視化田間檢測技術［51］?？傊?，隨著LAMP檢測技術的不斷改進，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病害的檢測提供了技術保障，為植物病害的有效防控奠定基礎，降低植物病害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所造成的損失。

4 結論

以細胞色素C信號肽序列作為檢測靶標，建立的環(huán)介導等溫擴增檢測技術，具有快速高效、特異性強、靈敏度高、操作簡單、不依賴于復雜儀器的優(yōu)點，適用于田間青枯病菌的大量檢測，易于在基層推廣運用。