過氧化物酶體降解與疾病

牛 彥，郝夢格，姜玲玲，石 蕓

(河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究室神經與血管教育部重點實驗室，中國河北石家莊050017)

過氧化物酶體是存在于真核細胞中的一種具有單層膜結構的細胞器，因富含過氧化氫酶和多種過氧化物酶而得名，在脂肪酸氧化、磷脂合成和氧化應激等方面發(fā)揮重要作用[1]。過氧化物酶體的數量在不同細胞、不同生理和疾病狀態(tài)下各不相同，表明過氧化物酶體在數量上存在異質性[2]，而探討過氧化物酶體的這種異質性在研究微環(huán)境對細胞狀態(tài)的影響方面具有重要作用。過氧化物酶體的數量由其生物發(fā)生[3]和降解兩方面決定。哺乳動物過氧化物酶體的降解途徑有3種:過氧化物酶體自噬、依賴LON多肽酶的過氧化物酶體降解和依賴12/15-脂氧合酶(12/15-lipoxygenase，12/15-LOX)的過氧化物酶體降解。本文就這些降解途徑及其與疾病的關系進行綜述，以期對過氧化物酶體的降解過程及其在疾病中的作用有更深的認識。

1 過氧化物酶體自噬

過氧化物酶體自噬是過氧化物酶體降解的主要形式[4]。雖然不同刺激因素引起的過氧化物酶體自噬的具體過程不盡相同，但目前較為確定的一個模式是，當各種因素導致過氧化物酶體自噬發(fā)生時，首先，過氧化物酶體膜上的某些蛋白質發(fā)生泛素化，隨后泛素化的膜蛋白由NBR1(neighbor of BRCA1 gene 1)或p62或其他蛋白質介導與微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3)結合，形成自噬小體，這些自噬小體進一步與溶酶體融合而被降解[5]。

過氧化物酶體膜上存在多種蛋白質，它們被稱為過氧化物酶體膜蛋白(peroxisomal membrane protein，PMP)，其中，在過氧化物酶體生物發(fā)生中發(fā)揮重要作用的一類蛋白質被稱為PEX(peroxin)。目前研究最透徹的是PEX5與過氧化物酶體自噬的關系。在過氧化物酶體生物發(fā)生過程中，PEX5負責過氧化物酶體基質蛋白向基質內的轉運，但在氧化應激發(fā)生時，PEX5會將一個重要的蛋白激酶——毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白激酶(ataxia telangiectasia-mutated kinase，ATM)定位到過氧化物酶體膜上，從而開啟過氧化物酶體自噬。研究發(fā)現，給予小鼠肝癌FAO細胞或人肝癌HepG2細胞過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)刺激后，細胞中的ATM激酶通過其氨基酸序列中的PEX5結合區(qū)與PEX5結合，進而定位到過氧化物酶體膜上而活化，活化的ATM隨后磷酸化PEX5的S141位點，磷酸化的PEX5會使同樣位于過氧化物酶體膜上的PEX2/10/12復合體發(fā)生構象改變，從而發(fā)揮出E3連接酶活性，泛素化PEX5的K209位點，泛素化的PEX5進而與p62結合，最終引發(fā)自噬[6]。將此過程中任何一個環(huán)節(jié)阻斷，比如通過點突變分別抑制ATM到過氧化物酶體的定位、PEX5的磷酸化、PEX5的泛素化，再給予H2O2刺激，過氧化物酶體自噬均被抑制。除了外源給予H2O2外，利用干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)敲低或特異性抑制劑3-氨基三唑抑制過氧化氫酶的表達或活性也能增加細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，促進過氧化物酶體自噬[7]。這些結果表明，氧化應激引起的過氧化物酶體自噬是ATM-PEX5依賴性的。有意思的是，PEX5的泛素化位點并不局限于K209，另一個位點C11的泛素化也由PEX2/10/12復合體催化，但C11泛素化的PEX5，會在同樣位于過氧化物酶體膜上的AAA ATP酶復合體(ATPases associated with diverse cellular activities)的核心組分PEX1和PEX6形成的六聚體作用下，從過氧化物酶體膜上脫離，從而阻止過氧化物酶體的自噬[8]。所以，雖然由相同的泛素化酶催化，但催化的位點不一樣，過氧化物酶體的結局也就不同。

除了氧化應激，氨基酸饑餓是另一個引起過氧化物酶體自噬的常見因素。用不含氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細胞24 h后，檢測細胞的過氧化物酶體自噬情況，發(fā)現細胞中過氧化物酶體自噬被促進。進一步研究發(fā)現，這種由饑餓引起的自噬也需要PEX5的泛素化[9]。那么，此時PEX5的泛素化是否與氧化應激條件下一致，都是由PEX2/10/12復合體催化的呢？將HEK293-HAUb(HA-tagged ubiquitin)細胞中的 PEX2、PEX10和PEX12分別敲低，再給予不含氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測細胞中PEX5的泛素化情況，發(fā)現只有PEX2敲低的細胞中沒有檢測到PEX5的泛素化，而敲低PEX10或PEX12并不影響PEX5的泛素化，表明正是 PEX2，而非PEX10或 PEX12，使PEX5發(fā)生了泛素化，這一點與氧化應激刺激下需要PEX2/10/12復合體來泛素化PEX5并不相同。除了PEX5，相同條件下，研究人員也檢測到PMP70的泛素化改變，而且變化情況與PEX5一致。PMP70是過氧化物酶體膜上含量最高的膜蛋白，這一結果表明除了PEX5，PMP70也是PEX2這一E3連接酶的底物，而且泛素化的PMP70也參與氨基酸饑餓誘導的過氧化物酶體自噬[9]。除了泛素化，這些過氧化物酶體的膜蛋白還受到去泛素化調節(jié)。去泛素化也需要酶的催化，而泛素特異性肽酶30(ubiquitin specific peptidase 30，USP30)就是一個新近確認的能抑制過氧化物酶體自噬的去泛素化酶[10]。在HeLa細胞中過表達USP30，檢測其亞細胞定位后發(fā)現，USP30與過氧化物酶體存在共定位，但是關于USP30是如何定位到過氧化物酶體的，目前還沒有直接證據，推測可能與PEX16 或 PEX19 有關[11～12]。進一步的研究發(fā)現，過表達USP30后，原本由于氨基酸饑餓誘導的過氧化物酶體自噬被逆轉，而突變的USP30卻沒有這種逆轉能力，說明USP30確實能夠抑制過氧化物酶體的自噬。既然USP30是去泛素化酶，那么，它的底物是否也是這些過氧化物酶體的膜蛋白呢？將HEK293-HA-Ub細胞中的USP30敲低，再給予不含氨基酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測細胞中PEX5、PMP70以及過氧化物酶體基質蛋白過氧化氫酶的泛素化情況，發(fā)現PEX5和PMP70的泛素化程度增加，而過氧化氫酶的泛素化程度沒有明顯改變[11]。PEX5和PMP70是泛素化酶PEX2的底物，這一結果表明USP30能夠通過拮抗PEX2來調節(jié)過氧化物酶體的自噬情況，從而平衡細胞中過氧化物酶體的數量。

低氧也能誘導自噬。低氧條件下，脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)的活性受到抑制，使低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)不能被羥化，進而不能被泛素化酶VHL(von Hippel-Lindau)泛素化，導致HIF不能進入蛋白酶體降解而穩(wěn)定存在于細胞中，因此，HIF常被認為是低氧的標志物[13]。利用VHL-/-基因敲除小鼠[14]或PHD抑制劑二甲基乙二?；拾彼?(dimethyloxaloylglycine，DMOG)[15]穩(wěn)定組織或細胞中HIF的水平來模擬低氧環(huán)境，再檢測過氧化物酶體的自噬情況，發(fā)現過氧化物酶體的自噬均被促進，并且這種自噬是HIF-2α依賴性的。低氧在惡性腫瘤中廣泛存在，既然低氧能促進過氧化物酶體自噬，那么，過氧化物酶體自噬是否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關呢？研究發(fā)現，PEX2在肝癌組織中表達增加，而敲低PEX2的表達會顯著抑制肝癌細胞的增殖；不出所料，敲低PEX10或PEX12也得到了相同的結果[16]。同樣，敲低ATM的表達也能抑制結腸癌細胞的增殖，不僅如此，還能抑制其遷移和侵襲[17]。這些過氧化物酶體自噬相關分子在腫瘤中的表達變化，很可能意味著過氧化物酶體自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

過氧化物酶體生物發(fā)生缺陷病(peroxisome biogenesis disorder，PBD)是最為典型的與過氧化物酶體自噬異常有關的疾病。一直以來，人們都認為是參與過氧化物酶體生物發(fā)生的PEX基因突變，使過氧化物酶體的生物發(fā)生過程不能正常進行，導致成熟的過氧化物酶體缺失，從而引發(fā)PBD，但最近這種觀點卻有所改變，因為最常見的PBD的基因突變是發(fā)生在構成AAA ATP酶復合體的3個基因，即PEX1、PEX6和PEX26，突變占比分別為48.5%、13.1%和3.4%。如前所述，AAA ATP酶復合體能夠使泛素化的PEX5從過氧化物酶體膜上脫離，從而阻止過氧化物酶體自噬的進程，進而使其保留下來，但突變的復合體就喪失了這種能力，過氧化物酶體會繼續(xù)自噬的進程從而導致過氧化物酶體數量的減少[18]，所以，目前認為，至少65%的PBD都與過氧化物酶體的過度自噬有關[19]。如果真是這樣，反而為PBD提供了一個新的治療方向，即通過藥物抑制過氧化物酶體自噬，以達到增加過氧化物酶體數量的目的。已有研究發(fā)現，以PEX1缺失(PEX1 null)或突變(PEX1-G843D)病人的成纖維細胞作為研究對象，分別給予3種不同的自噬抑制劑(LY294002、bafilomycin A1或chloroquine)刺激24 h，細胞中過氧化物酶體的數量均顯著增加，其中，PEX1-G843D細胞中過氧化物酶體的數量甚至達到與野生型細胞中相似的程度[18]。因此，抑制過氧化物酶體的自噬有望成為新的PBD治療靶點。

2 依賴LON多肽酶的過氧化物酶體降解

LONP2(Lon peptidase 2，peroxisomal)是過氧化物酶體特異的LON多肽酶，其主要功能是催化過氧化物酶體內部基質蛋白的降解[20]。正常情況下，LONP2會發(fā)揮類似分子伴侶的功能，協助蛋白質進行正確折疊；而當氧化應激、衰老等因素導致過氧化物酶體基質蛋白發(fā)生錯誤折疊或損傷時，LONP2會及時降解這些蛋白質，以保證過氧化物酶體的正常運行。但是，當錯誤折疊或受損的蛋白質過多，超過LONP2的降解能力時，過氧化物酶體就會發(fā)生自溶，由于這種過氧化物酶體降解的方式需要LONP2的參與，因此，稱其為依賴LON多肽酶的過氧化物酶體降解。

目前，對于這個過程的很多細節(jié)尚不清楚，而有關其與疾病之間關系的研究更是少之又少。有學者將LONP2與存在于線粒體中的另一種LON多肽酶——LONP1進行了對比，發(fā)現二者在結構上有近40%的相似性，結構上的相似決定了功能上的相似，而目前發(fā)現，二者在蛋白質的水解以及對氧化應激的反應性上差別不大，又由于LONP1已被證實在衰老以及衰老相關疾病中對維持線粒體完整性起重要作用，因此，推測在結構和功能上與LONP1都相似的LONP2，也應該在這些疾病中發(fā)揮作用，但目前為止，尚沒有這方面的報道[20]。不過值得注意的是，LONP2與癌癥之間關系的研究已有所突破。研究發(fā)現，與正常組織相比，宮頸癌組織中LONP2的mRNA和蛋白質表達均明顯增加；而敲低人宮頸癌SiHa和HeLa細胞中LONP2的表達水平能夠抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，同時降低ROS水平[21]。這些結果提示，LONP2促進宮頸癌的發(fā)生，可能是宮頸癌潛在的生物標志物和治療靶點，但是LONP2如何促進宮頸癌的發(fā)生？是否與過氧化物酶體降解有關？還需要進一步的研究。

3 依賴12/15-LOX的過氧化物酶體降解

12/15-LOX是一種特殊的酶，它可以在無需磷脂酶的情況下，直接氧化含有多不飽和脂肪酸的脂膜，從而達到破壞細胞器，甚至細胞的目的。12/15-LOX和過氧化氫酶的雙免疫熒光染色以及免疫電鏡膠體金標記法都確認12/15-LOX定位到過氧化物酶體，而有活性的12/15-LOX能夠破壞過氧化物酶體的膜結構，致使位于內部的基質蛋白(過氧化氫酶)外泄，說明12/15-LOX能夠通過破壞過氧化物酶體的單層膜結構而導致過氧化物酶體降解[22]。12/15-LOX在糖尿病腦病[23]、中風[24]和阿爾茨海默病[25]等神經系統(tǒng)疾病中表達上調，利用12/15-LOX基因敲除小鼠或特異性抑制劑抑制12/15-LOX的活性，能相應減輕神經細胞的損傷[24～26]。在體內構建的Lewis肺癌小鼠模型中，12/15-LOX在內皮細胞中的特異性過表達能夠促進癌細胞的死亡[27]。這些結果都提示，12/15-LOX的表達或活性異常與神經系統(tǒng)疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此，通過開發(fā)相應的藥物來糾正這種異常很可能為這些疾病的治療提供新的方向，但12/15-LOX引發(fā)這些疾病的具體機制以及過氧化物酶體降解在其中的作用，目前為止，尚不得而知。

4 總結與展望

綜上所述，過氧化物酶體的降解與其生物發(fā)生過程一起，共同維持著細胞中過氧化物酶體數量的動態(tài)平衡。平衡一旦被打破，將會引發(fā)過氧化物酶體的功能紊亂，最終導致疾病的發(fā)生。目前，過氧化物酶體降解發(fā)生的具體過程尚有許多方面有待完善，比如:1)除了PEX5和PMP70，還有沒有其他關鍵分子也是過氧化物酶體自噬的開關分子，這些分子一旦發(fā)生泛素化，就使得過氧化物酶體朝著自噬的方向發(fā)展；2)除了泛素化這種修飾，還有沒有其他修飾方式也能誘導過氧化物酶體自噬；3)氧化應激、氨基酸饑餓、低氧等不同刺激方式均能誘導過氧化物酶體自噬，但這些“殊途”的刺激方式是如何共同誘導過氧化物酶體自噬而達到“同歸”效果的，導致這種現象發(fā)生的關鍵節(jié)點到底是什么；4)為什么過氧化物酶體自噬在過氧化物酶體的降解中占主要地位，而依賴LON多肽酶和依賴12/15-LOX的過氧化物酶體降解的發(fā)生卻相對較少。這些問題只是冰山一角，而隨著這些問題的出現和不斷被解答，我們對于過氧化物酶體的降解過程及其與疾病關系的認識將會愈加深入，最終有利于為這些疾病的預防和治療提供新的思路。