正交試驗設(shè)計優(yōu)選通脈軟膏的輔料組成及其滲透性能與皮膚安全性研究

陳韻蓓，強文社，苗文亮，斯郎巴吉，斯郎格瑪

(1.四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部，四川成都 610041；2.甘孜藏族自治州藏醫(yī)院，四川康定 626000)

藏醫(yī)理論認為人體生命活動由“隆”、“赤巴”、“培根”三種能量物質(zhì)構(gòu)成，由“隆”物質(zhì)構(gòu)成的脈被稱為白脈[1]，著名藏醫(yī)學(xué)家宇妥·云丹貢布的經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》中就早有記載，藏醫(yī)學(xué)認為白脈病主要由“隆”引起，又稱“白痹”[2-3]. 表現(xiàn)為口眼歪斜、癱瘓、小便失禁，或肢體腫脹、萎縮、僵硬等一系列癥狀[3].白脈理論是頗具特色的藏醫(yī)學(xué)獨有理論，而與神經(jīng)系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)等疾病相關(guān)的白脈病以及相應(yīng)的白脈療法在藏醫(yī)學(xué)中則具有重要影響.

通脈方出自《四部醫(yī)典》[4]，是藏醫(yī)治療白脈病的經(jīng)典名方，由姜黃、佛手、肉豆蔻、甘松、藏茴香、干姜、甘草、藏菖蒲、花椒等藏藥組成，具有舒筋活絡(luò)，開竅通絡(luò)的功效.作為國家級重點民族醫(yī)院，該方在甘孜州藏醫(yī)院臨床應(yīng)用已有20 余年，療效確切，是我院國家級重點?？骑L濕科、內(nèi)分泌科專科特色的集中體現(xiàn)，但前期用法為水調(diào)和藥粉后外敷，難以準確控制劑量.本文采用正交試驗設(shè)計通脈軟膏輔料比例，使用HPLC 建立了姜黃素含量測定方法，同時開展體外經(jīng)皮滲透試驗，比較軟膏劑和傳統(tǒng)外敷用法的吸收差別，此外還進行了皮膚過敏性實驗，以期為通脈軟膏用于臨床診療提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，包括LPG-3400SDN 型泵、WPS -3000SL 型進樣器、TCC- 3000SD 型柱溫箱、DAD - 3000 型檢測器以及Chromeleon 7 色譜處理軟件(賽默飛世爾公司)；BT25S 型十萬分之一分析天平、BS124S 型萬分之一分析天平(賽多利斯公司)；TT -6D 透皮擴散儀(天津市正通科技公司).

1.1.2 藥品與試劑

姜黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110823 -201706)；通脈軟膏(自制，批號 20191213、20191216、20191217)；Strat -M 膜(美國 Merck Millipore 公司，批號 K6CA1022)；凡士林(重慶韋伯力揚科技有限公司，批號192482)；羊毛脂(廣州李德化工有限公司，批號190911)；液體石蠟(成都市科龍化工試劑廠，批號2018091202)；色譜乙腈(FISHER 公司，批號188652).

1.1.3 動物

白色豚鼠，普通級，30 只，雌雄兼有，體重220 ～260 g.購自成都達碩生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2015 -030.

1.2 方法

1.2.1 建立姜黃素的含量測定方法

(1)高效液相色譜分析條件 色譜柱:Thermo Hypersil GOLD C18，4.6 mm × 250.0 mm，5 μm；流動相為乙腈-4%冰乙酸溶液(48∶52)；流速1.0 mL/min，檢測波長425 nm，柱溫25 ℃.

(2)配制對照品溶液及線性關(guān)系考察 稱取姜黃素對照品適量，精密稱定后放入25 mL 容量瓶，加入乙醇定容，得0.3332 mg/mL 的姜黃素貯備液，精密吸取該貯備液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加入乙醇定容，得到姜黃素對照品溶液，濃度0.03332mg/mL.稀釋后分別配成 0. 01666、0. 00833、0. 004165、0.002083、0.001041 mg/mL 濃度，進樣 5 μL.

(3)供試品溶液的制備及缺姜黃樣品溶液的制備取通脈軟膏約1 g，精密稱定，然后向其中加入乙醇15 mL，置50 ℃水浴中加熱20 min，超聲處理(功率150 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，置冰水浴中冷卻5 min，過濾，濾液置50 mL 容量瓶中，剩余殘渣置同一50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入乙醇15 mL，超聲處理20 min，放冷，置冰水浴中冷卻5 min，過濾，剩余殘渣再同法處理1 次，收集濾液，加入乙醇至50 mL，采用0.22 μm 微孔濾膜過濾，收集續(xù)濾液即得. 用不含姜黃的處方制備陰性通脈軟膏，再按上述方法制得缺姜黃樣品溶液.

(4)專屬性實驗 進樣供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各5 μL.

(5)精密度實驗 將“1.2.1(2)”項下0.03332 mg/mL 的姜黃素對照品溶液精密吸取5 μL 連續(xù)進樣6 次.

(6)重復(fù)性實驗 取本品約1 g，精密稱定，并平行取6 份樣品，按“1.2.1(3)”項下供試品溶液的制備方法制備供試品，每份供試品進樣5 μL.

(7)穩(wěn)定性實驗 取本品約1 g，精密稱定，按“1.2.1(3)”項下的方法制備，分別在 0、1.5、3、4.5、6、7.5、9 h 進樣 5 μL.

(8)加樣回收率 取已知含量的本品(批號:20191216)約0.5 g，平行取6 份樣品，精密稱定，分別加入0.35 mL“1.2.1(2)”項下的姜黃素對照品貯備液，按“1.2.1(3)”項下的方法分別制備并進樣分析.

1.2.2 通脈軟膏配方篩選

(1)配制通脈軟膏 稱取甘油、凡士林、液體石蠟、羊毛脂適量，加熱后混合均勻，待放冷后加入藥物，攪拌均勻，即得.

(2)測定粒度 取載玻片，在其上涂上樣品，覆蓋載玻片，平行制備三份，以《中國藥典》2015 版四部中的粒度和粒度分布測定法測定，10 分為粒度最細膩的樣品評分，與其比較得出其余樣品評分[5].

(3)測定均勻度 在燒杯中放入適量樣品后靜置，觀察并記錄樣品的沉降情況及顏色的均勻性，10分為最佳的樣品評分，與其比較得出其余樣品評分[5].

(4)優(yōu)化通脈軟膏配方

①選擇因素水平 在前期文獻調(diào)研及預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選擇羊毛脂(A)、液體石蠟(B)及凡士林(C)為正交試驗設(shè)計的因素，采用L9(34)正交表，正交試驗的水平因素見表1.

表1 正交試驗水平因素表Table 1 Factor and level table

②評價指標及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 均勻度評分與粒度評分相加為軟膏的物理性狀得分，并參考姜黃素含量考察配方，得分采用SPSS24.0 軟件進行統(tǒng)計.

③驗證試驗按上述試驗優(yōu)化的方案制備通脈軟膏共三批，檢測相應(yīng)指標.

1.2.3 體外經(jīng)皮吸收試驗

將軟膏均勻涂抹在Strat-M 膜上，將Strat-M 膜夾在透皮杯的釋放池與接收池之間，用配套夾子夾緊，向接收池中放入磁轉(zhuǎn)子，以生理鹽水作為接收液，將其加至刻度線，設(shè)定儀器的攪拌速度為600 r/min，由于是透皮吸收試驗，設(shè)定接收液的溫度為(37 ±0.1) ℃，設(shè)定 6 個時間點:1、2、4、8、12、24 h，在每個時間點取2 mL 接收液，并用生理鹽水補足，將取出的透皮液0.45 μm 微孔濾膜過濾后進樣，檢測其中姜黃素含量，另將處方藥粉加水調(diào)成稠膏狀，同法進行實驗以檢測傳統(tǒng)外敷用法的透皮吸收參數(shù).按下式計算透皮率[6].

上式中，一定時間內(nèi)累積的透皮量為Qn，在第n個時間點時接受液的濃度為Cn，接收池的體積為V，在第i 個時間點時取樣樣品的濃度為Ci，取樣時的取樣體積為Vo，一定時間內(nèi)累積的透皮率為Vn，供試品中姜黃素總的含量為M[6-7].

1.2.4 通脈軟膏皮膚過敏性試驗

將豚鼠按隨機分層法分為空白組、陽性藥組、通脈軟膏組，每組10 只.實驗前將豚鼠背部左右兩側(cè)脫毛，脫毛面積約9 cm2.實驗第1d 將藥物涂抹在動物的左側(cè)脫毛區(qū)，空白組涂抹空白基質(zhì)，陽性藥組涂抹2，4 -二硝基氯化苯，通脈軟膏組涂抹通脈軟膏，將抹藥處覆蓋紗布并固定開始致敏，6 h 后除去藥物.實驗第7、14 d，分別將動物背部左側(cè)脫毛區(qū)域的毛發(fā)剃除干凈后，采用同樣方法在相同部位致敏給藥1 次，同樣保持6 h 致敏時間. 實驗第28 d，在豚鼠未抹藥的背部右側(cè)脫毛區(qū)，以同樣方法敷藥6 h 以激發(fā)[6，8].

2，4 -二硝基氯化苯的藥物濃度為1%，其激發(fā)濃度為0.1%，給藥量為0.2 mL/只，通脈軟膏按成人用量換算，給藥劑量為每100 cm2皮膚涂抹1.2 g/kg，空白組涂抹等量基質(zhì).

各組動物分別在激發(fā)后24、48、72 h 觀察記錄皮膚紅斑和水腫情況，按照皮膚過敏評級表(表2)進行評分[8]，并按下式計算各組別分值:分值＝(紅斑評級分數(shù)+水腫評級分數(shù))/該組動物數(shù)，以及致敏率:致敏率＝(過敏反應(yīng)陽性數(shù)/該組動物數(shù)) ×100%.按藥物致敏性分類表(表3)進行評價.各組別在每個時間點的觀察均拍照記錄，實驗前后測定各組動物體重[6，8].

表2 皮膚過敏評級標準表Table 2 Skin allergy rating scale table

表3 藥物致敏性評級標準表Table 3 Drug sensitization rating scale table

2 結(jié)果

2.1 姜黃素含量測定方法建立

2.1.1 對照品溶液制備及線性關(guān)系考察

縱坐標為峰面積(Y)，橫坐標為姜黃素進樣量(X)，得出姜黃素的線性關(guān)系如下:Y＝144. 62X-0.1836(r＝0.9998)，說明峰面積與姜黃素進樣量在0.0052 μg 到 0.1666 μg 之間時具有較好的線性關(guān)系.

2.1.2 專屬性實驗

姜黃素峰明顯，陰性供試品在相應(yīng)的時間無干擾，見圖1.

圖1 高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC

2.1.3 精密度實驗

經(jīng)過計算RSD(姜黃素峰面積)為1.09%，儀器精密度較好.

2.1.4 重復(fù)性實驗

經(jīng)過計算RSD(姜黃素的平均含量)為3.80%，含量均值為0.2362 mg/g，本方法具備較好重復(fù)性.

2.1.5 穩(wěn)定性實驗

以姜黃素峰面積計算RSD 為0.53%，表明樣品在9 h 內(nèi)穩(wěn)定.

2.1.6 加樣回收率

姜黃素的平均回收率為99. 32%，RSD 為 2.53%，本方法加樣回收率能滿足要求.

2.2 通脈軟膏配方篩選

2.2.1 正交試驗評價指標及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

由表4 可知，通脈軟膏的性狀受不同的基質(zhì)配方的影響比較大，而姜黃素的含量則受影響較小，三個因素中軟膏性質(zhì)受影響最大的是凡士林，羊毛脂稍小，液體石蠟最小，A2B3C2為最佳配方，由表5 可知，凡士林及羊毛脂用量對結(jié)果有顯著性影響，液體石蠟沒有顯著性影響.

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis table

2.2.2 驗證試驗

結(jié)果顯示，正交試驗篩選出的配方穩(wěn)定可行，見表6.

表6 驗證試驗結(jié)果(n ＝3)Table 6 Verification test results (n ＝3)

2.3 體外經(jīng)皮吸收試驗

由SPSS22.0 軟件對兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗得出，通脈軟膏在每個時間點的透皮量和透皮率與外敷藥粉法比較均有顯著性差異(P＜0.05)，以累計透皮率Ln 對時間 t 作圖，見表 7，圖 2.

表7 累計透皮量、透皮率(，n ＝3)Table 7 Cumulative transdermal volume and rate (，n ＝ 3)

表7 累計透皮量、透皮率(，n ＝3)Table 7 Cumulative transdermal volume and rate (，n ＝ 3)

注:軟膏劑與外敷藥粉法比較P*＜0.05

軟膏劑外敷藥粉法時間點(h)累計透皮量(mg/g) 累計透皮率(%) RSD(%) 累計透皮量(mg/g) 累計透皮率(%) RSD(%)1 0.0017 ± 2.2 × 10 -4* 0.71 ± 0.12* 0.88 0.0007 ± 2.0 × 10 -4 0.30 ± 0.12 1.15 2 0.0078 ± 6.3 × 10 -4* 3.28 ± 0.22* 1.29 0.0034 ± 6.7 × 10 -3 1.45 ± 0.19 1.69 4 0.0169 ± 2.4 × 10 -3* 7.10 ± 0.31* 1.55 0.0071 ± 2.1 × 10 -3 3.02 ± 0.29 1.92 8 0.0259 ± 3.1 × 10 -3* 10.88 ± 0.61* 1.71 0.0117 ± 3.2 × 10 -3 4.98 ± 0.48 1.48 12 0.0330 ± 3.7 × 10 -3* 13.87 ± 0.92* 1.69 0.0151 ± 4.4 × 10 -3 6.43 ± 0.61 2.22 24 0.0411 ± 4.2 × 10 -3* 17.27 ± 1.21* 2.66 0.0182 ± 2.6 × 10 -3 7.74 ± 0.58 2.51

圖2 累計透皮率折線圖Fig.2 Line chart ofcumulative transdermal rate

用不同方程進行擬合，結(jié)果顯示通脈軟膏及外敷藥粉法中姜黃素的體外經(jīng)皮吸收過程均符合Higuchi方程，見表8.

表8 累計透皮率擬合方程Table 8 Fitting equation of cumulative transdermal rate

2.4 通脈軟膏皮膚過敏性試驗

結(jié)果顯示，陽性藥組在三個時間點致敏率均為100%，為極度致敏性，空白組與通脈軟膏組均未觀察到過敏反應(yīng)，見表9. 各組豚鼠體重均有不同程度增加，見表10.

表9 皮膚過敏評級結(jié)果Table 9 Skin allergy rating results

表10 豚鼠體重變化表()Table 10 Weight changes of guinea pigs()

表10 豚鼠體重變化表()Table 10 Weight changes of guinea pigs()

組別 動物(只)體重(g)實驗前 第1 周 第2 周 第3 周 第4 周空白組 10 228.3 ±23.1 243.2 ±29.7 324.6 ±32.9 342.7 ±40.4 286.7 ±28.3陽性藥組 10 235.7 ±30.6 251.0 ±40.2 290.1 ±30.6 312.6 ±33.2 349.5 ±24.6通脈軟膏組 10 234.4 ±30.4 250.3 ±20.5 289.0 ±19.2 327.5 ±22.6 356.0 ±26.3

3 討論

通脈軟膏主要由藥物和基質(zhì)成分組成，制備軟膏容易出現(xiàn)的問題是軟膏放置后易分層，尤其是通脈軟膏這類藥粉直接入藥的制備方式，因此需要從配方入手再輔以充分的攪拌，才能避免出現(xiàn)分層[9]. 本文選擇液體石蠟、凡士林為基質(zhì)的主要成分[10]，將藥粉加入基質(zhì)后均勻性較好，膏體性狀較佳，但是內(nèi)容物粒度欠佳，長期放置后仍然會在底部出現(xiàn)少許沉淀. 為了解決此問題，我們結(jié)合文獻篩選了數(shù)種基質(zhì)成分[11-12]，最終發(fā)現(xiàn)羊毛脂能較好地改善膏體的最終物性，于是在基質(zhì)中加入羊毛脂后再加入藥粉，能得到均勻細膩的軟膏，也可以在長期放置過程中保持較好的性質(zhì).

本文結(jié)合相關(guān)文獻及預(yù)實驗[13]，發(fā)現(xiàn)用乙醇多次水浴加熱+超聲處理的方式制備通脈軟膏供試品，其中的有效成分可以較多地保留.在姜黃素的色譜條件考察中，得出乙腈-4%冰乙酸溶液(48∶52)為流動相時，姜黃素峰具備較好的分離效果[14-15]，同時，Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱具有更好的峰形[16].

由表7、圖2 可知，從1 h 開始的每個時間點，通脈軟膏的累計透皮量均較外敷藥粉法為高，而兩藥的姜黃素含量大致相當，因此至24 h，通脈軟膏的累計透皮率已達17.27%，超出外敷用法較多，推測是由于軟膏由親脂性基質(zhì)制成，對藥物經(jīng)皮吸收有促進作用[17]，而傳統(tǒng)外敷用法則是將藥粉加水調(diào)成一定稠度敷在皮膚表面，藥粉未在介質(zhì)中分散均勻，也缺乏促進藥物滲透的基質(zhì).本文采用了人工仿生膜Strat-M，這是一種模仿人體皮膚開發(fā)的仿生膜，在透皮吸收的表現(xiàn)上，它更接近真實的人體皮膚，同時，該仿生膜的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性更是優(yōu)于手工制作的各種動物皮膚[6，18].同時，通過過敏性試驗，我們發(fā)現(xiàn)通脈軟膏反復(fù)用藥后，不會引起皮膚的過敏反應(yīng). 通脈軟膏的研究，對于少數(shù)民族地區(qū)患者用藥的安全性和有效性具有重要的意義，本研究為其推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).