陳文龍 戴富臻 邵正勇 蔣 利 徐明清

(成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院普外科，成都 610100)

肝纖維化是一種慢性肝損傷疾病，其特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累和正常肝臟結(jié)構(gòu)的扭曲[1]。由于持續(xù)的慢性肝損傷，肝纖維化可發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡[2]。因此肝纖維化在不同的慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中都起著至關(guān)重要的作用。因此，闡明肝纖維化的分子機(jī)制和尋找治療肝纖維化有效的藥物十分重要。據(jù)報(bào)道，槲皮素具有廣泛的藥理特性，具有抑制肝纖維化的作用[3]。然而，槲皮素的抗纖維化機(jī)制迄今尚未完全闡釋清楚。本文旨在探究槲皮素對(duì)大鼠肝纖維化和炎癥的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡健康Wistar大鼠，雄性，體重150～200 g，購自江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中。

1.1.2主要試劑 槲皮素購自美國Selleck公司；CCl4購自江蘇強(qiáng)盛化工有限責(zé)任公司；TRIzol試劑(15596026)購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒(#6210A)和SYBR green(#RR420Q)購自日本TaKaRa公司；IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購自美國R&D公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)生化分析試劑盒(C009-1)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)生化分析試劑盒(C010-2)和羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)試劑盒(A030-2)購自南京建成生物技術(shù)研究所；anti-α-SMA(ab5694)、anti-collagen-I(ab34710)和anti-β-catenin(ab32572)抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立 大鼠肝纖維化模型根據(jù)文獻(xiàn)[4]建立。Wistar大鼠分為5組(n=10)：對(duì)照組：灌胃橄欖油；模型組：大鼠給予CCl4(CCl4：橄欖油=1∶1，2 ml/kg)灌胃，每周3次，共8周，誘導(dǎo)肝纖維化；低中高劑量治療組(EXP-L、EXP-M、EXP-H)：3組大鼠分別灌胃榭皮素 15、30和50 mg/kg，每天1次，連續(xù)4周；再灌胃CCl4(50%CCl4/橄欖油，2 ml/kg)，每周3次，連續(xù)4周。8周后頸椎脫臼處死，立即采集各組大鼠肝臟。

1.2.2HE染色 處死大鼠后取肝組織，將肝組織固定在4%多聚甲醛，切成5 μm厚的切片。將各組大鼠肝肺組織石蠟切片，用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min ；按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行HE染色，在生物顯微鏡下觀察組織病變情況并拍照。同時(shí)采集血樣，測(cè)量血清中ALT和AST含量。

1.2.3HYP檢測(cè) 采用文獻(xiàn)報(bào)道的肝HYP法測(cè)定肝膠原蛋白含量，并對(duì)其進(jìn)行少量修飾[5]。即將速凍肝組織在5 ml 6 mol/L 濃HCl中于110℃水解16 h。過濾水解產(chǎn)物，真空蒸發(fā)掉鹽酸，并將沉淀物溶于 1.2 ml 50%異丙醇中，并與0.2 ml的0.84%氯胺-T在42 mmol/L乙酸鈉，2.6 mmol/L檸檬酸中酸和39.5%(vol/vol)異丙醇(pH 6.0)，室溫下孵育10 min。隨后添加溶解于0.27 ml 60%高氯酸和0.73 ml的異丙醇中的0.248 g對(duì)二甲基氨基苯甲醛，50℃下孵育90 min。然后，在558 nm處以光度法對(duì)相對(duì)羥基脯氨酸進(jìn)行定量(相對(duì)羥脯氨酸(μg/g肝臟)是根據(jù)個(gè)體肝臟重量計(jì)算的)。

1.2.4ELISA檢測(cè)炎癥因子水平 注射6 h后將各組大鼠血液收集到不同的離心管，5 000 r/min離心10 min，血清獲得和存儲(chǔ)-20℃到使用。血清炎癥細(xì)胞因子(IL-6，TNF-α，IL-1β)水平根據(jù)說明書進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.5RT-PCR 采用TRIzol試劑按標(biāo)準(zhǔn)程序從肝組織中提取總RNA。用PrimeScript RT試劑盒合成第一鏈cDNA，以總RNA(2 μg)為模板。采用SYBR green一步法RT-PCR系統(tǒng)定量表達(dá)目標(biāo)基因mRNA。RT-PCR分析的條件如下：①預(yù)熱期：95℃ 30 s；②循環(huán)階段：95℃ 5 s，60℃ 34 s，40次循環(huán)；③熔融曲線階段：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。將GAPDH擴(kuò)增為內(nèi)參基因。PCR中使用的引物序列如表1所示。用循環(huán)閾值(Ct)測(cè)量表達(dá)水平，然后用2-ΔΔCt方法將其歸一化為GAPDH表達(dá)。

1.2.6Western blot 提取肝臟總蛋白；取20 μg蛋白與適量Loading buffer混合，100℃煮沸10 min；上樣到SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%的脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；分別加入一抗，anti-α-SMA、anti-collagen-Ⅰ和anti-β-cate-nin，4℃過夜孵育，次日，TBST清洗后再加標(biāo)記HRP的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH作為內(nèi)參，至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1榭皮素改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷 如圖1A所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織表現(xiàn)出明顯的肝損傷，出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞形態(tài)異常；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組上述細(xì)胞損傷特征明顯減少，說明榭皮素以劑量依賴的方式降低CCl4誘導(dǎo)肝損傷。如圖1B所示，與對(duì)照組相比，模型組AST和ALT活力均顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組AST和ALT活力隨槲皮素劑量增加依次下降(P<0.01)，該結(jié)果進(jìn)一步說明榭皮素改善CCl4誘導(dǎo)的肝功能損傷。

表1 引物序列

2.2榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的HYP增加 如圖2A所示，與對(duì)照組相比，模型組肝/體重之比明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，EXP-H組肝/體重之比下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如圖2B所示，與對(duì)照組相比，模型組HYP含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組HYP含量隨槲皮素劑量增加依次下降(P<0.01)，說明榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的HYP。

圖1 榭皮素改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷

圖2 榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的肝損傷Fig.2 Quercetin ameliorates liver injury induced by CCl4Note:A.Histogram of liver/body weight ratio;B.Liver HYP assay was used to detect HYP content.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

2.3榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 如圖3所示，與對(duì)照組相比，模型組炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組IL-6、TNF-α和IL-1β水平隨槲皮素劑量增加依次下降(P<0.01)，說明榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖3 榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)Fig.3 Quercetin reduced inflammatory response induced by CCl4Note:ELISA detected concentrations of IL-6(A),TNF-α(B),and IL-1β(C).Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

圖4 槲皮素抑制α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)Fig.4 Quercetin inhibited expression of α-SMA and collagen-ⅠNote:A.Western blot detects protein expression;B.Relative protein expression.1.Control group;2.Model group;3.EXP-L group;4.EXP-M group;5.EXP-H group.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

圖5 槲皮素抑制COL1A1和COL3A1 mRNA表達(dá)Fig.5 Quercetin inhibited mRNA level of COL1A1 and COL3A1Note:Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

圖6 槲皮素抑制Wnt2和β-catenin表達(dá)Fig.6 Quercetin inhibited expression level of β-catenin and Wnt2Note:1.Control group;2.Model group;3.EXP-L group;4.EXP-M group;5.EXP-H group.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

2.4槲皮素抑制α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表達(dá) 如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組α-SMA和collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)水平隨槲皮素劑量增加依次下降(P<0.01)。

2.5槲皮素抑制COL1A1和COL3A1 mRNA表達(dá) 如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組COL1A1和COL3A1 mRNA水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組COL1A1和COL3A1 mRNA水平隨槲皮素劑量增加依次下降(P<0.01)，該結(jié)果進(jìn)一步說明榭皮素減少CCl4誘導(dǎo)的膠原增加。

2.6槲皮素抑制β-catenin/Wnt信號(hào)通路 如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組β-catenin和Wnt2蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，EXP-L、EXP-M、EXP-H組β-catenin和Wnt2蛋白表達(dá)水平隨槲皮素劑量增加依次下降(P<0.01)，結(jié)果表明槲皮素可能抑制β-catenin/Wnt信號(hào)通路。

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，是肝衰竭、肝硬化和癌癥的潛在誘因。這種漸進(jìn)的病理過程是由于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累造成的[6]。CCl4是一種肝毒素，常被用來誘導(dǎo)小鼠或大鼠發(fā)生毒素介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肝纖維化[7]。在肝臟中，CCl4引起毒性三氯甲基(CCl3)自由基，引起炎癥反應(yīng)，激活HSCs，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷[3]。本研究采用2 ml/kg CCl4劑量，每周3次，連續(xù)8周誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。結(jié)果顯示CCl4處理導(dǎo)致肝細(xì)胞廣泛壞死且出現(xiàn)脂肪空泡，說明本研究成功建立了肝纖維化模型。

近年來，中藥抗纖維化治療因其毒性低、副作用少等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到重視。槲皮素是一種多酚類黃酮，含有許多酚類羥基，具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化性能[8]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明槲皮素具有肝保護(hù)和抑制肝纖維化的作用[3,9]。本研究表明，榭皮素能有效改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。CCl4誘導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平以及Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)水平增加，而榭皮素以劑量依賴的方式抑制CCl4誘導(dǎo)的膠原聚集，提示榭皮素具有抑制肝纖維化的作用。同時(shí)，榭皮素能明顯降低羥脯氨酸含量，說明榭皮素降低CCl4大鼠總膠原含量，進(jìn)一步證明榭皮素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化有一定的改善作用。

肝細(xì)胞損傷促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的分泌，直接促進(jìn)肝細(xì)胞的活化，因此肝細(xì)胞的損傷也是肝纖維化發(fā)生的最初因素[10]。許多研究表明，榭皮素能保護(hù)CCl4所致的急性肝損傷[11-13]。與上述研究一致，本文表明，榭皮素改善肝功能，如降低血清ALT/AST水平、炎癥因子水平、肝/體重之比和組織病理學(xué)病變，暗示榭皮素對(duì)肝細(xì)胞有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

激活典型的β-catenin/Wnt通路是肺、腎和肝等器官纖維化疾病的一個(gè)重要特征[14]。在肝纖維性疾病中抑制該途徑已被證明能抑制肝纖維化[15-17]。本文研究表明，CCl4激活了β-catenin/Wnt通路，而榭皮素抑制β-catenin的表達(dá)，可能抑制該通路。本文結(jié)論提示榭皮素可能通過抑制β-catenin/Wnt通路發(fā)揮肝纖維化抑制作用和肝保護(hù)作用。

綜上所述，本文研究結(jié)果表明榭皮素具有抗CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化作用，并對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠具有保護(hù)作用。