豬口腔液中偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸穩(wěn)定性研究

郭振華，喬松林，鄧瑞廣，張改平,2,3*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450002；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

哺乳動物口腔液(oral fluids，OF)是一種由唾液和黏膜滲出液組成的混合液體，包含多種電解質(zhì)、蛋白、酶類、抗菌因子和糖蛋白等，同時也含有通過齒齦溝和毛細(xì)血管進(jìn)入口腔的血清滲出液等[1]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，口腔液已廣泛用于疾病診斷和病原微生物、激素及藥物等的檢測[2]；在獸醫(yī)領(lǐng)域，最早于1905年就有俄羅斯學(xué)者利用馬口腔液開展疫病診斷的報道[3]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，最早的報道見于1976年利用豬口腔液開展豬瘟抗體檢測的研究[3]。2010年以來，隨著對豬口腔液作為生物檢材的系統(tǒng)研究，口腔液在豬群健康監(jiān)測和疫病病原檢測中才逐漸得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。豬口腔液作為抗體和病原檢測的有效檢材，與傳統(tǒng)生物檢材如血液和組織相比，具有明顯的優(yōu)勢，包括采集極為方便、簡易，對豬群無應(yīng)激，少量樣品就可以代表較大的動物群體，更為經(jīng)濟(jì)有效[6-7]。目前，豬口腔液已廣泛用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)[8]、豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)[9]、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)[10]、豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)[10]、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)[11]、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)[12]、豬沙門氏菌(SwineSalmonella)[13]、豬支原體(Mycoplasmasuis)[14]等重要病原的臨床監(jiān)測。

鑒于口腔液成分相對較為復(fù)雜，目前關(guān)于病毒核酸在口腔液中穩(wěn)定性的相關(guān)報道較少。本研究利用PRV和PRRSV評估核酸保護(hù)劑和溫度對口腔液中病毒核酸穩(wěn)定性的影響，以期為口腔液樣品的正確保存和運(yùn)輸提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口腔液采集 豬口腔液采自河南鶴壁某規(guī)?；B(yǎng)殖場12周齡左右的豬群。具體方法如下：取直徑1.6 cm、長度約1.2 m的純棉繩一條，懸掛于欄位的一側(cè)，繩子一端的高度在豬的肩部，以豬方便咬到為宜。讓豬咬繩子約20 min～30 min左右，將繩子潤濕的一端放入收集袋中，用力擠壓，以≥2 mL為有效采樣量，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，低溫運(yùn)輸至實驗室?？谇灰簶悠? 000 r/min離心3 min，除去大的顆粒物，取上清分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行熒光定量PCR檢測，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗方案見表1。核酸保護(hù)劑和口腔液按照1∶1體積比進(jìn)行混合，然后分別加入5 × 103TCID50的PRV或者1 × 105TCID50的PRRSV培養(yǎng)液，同時設(shè)置PBS對照組，分別在4 ℃和室溫條件下保存，在保存后的第1、2、3、4、7天分別收取200 μL樣品，置-80 ℃冰箱備用。

表1 試驗方案設(shè)計

表2 本研究所用引物信息

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 所獲得的數(shù)據(jù)利用GraphPad Prim 7進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗。*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 核酸保護(hù)劑對口腔液中病毒核酸穩(wěn)定性的影響

含有PRRSV或PRV的口腔液，在4 ℃和室溫條件下分別進(jìn)行保存，在指定的時間點(diǎn)進(jìn)行取樣，然后利用熒光定量PCR技術(shù)評估各組樣品中PRRSV或PRV的核酸拷貝數(shù)。如圖1所示，核酸保護(hù)劑組(DNA/RNA shield)和PBS組相比，在4 ℃條件下保存1 d后，PRRSV核酸含量要比對照組高10倍～20倍(圖1A)，PRV核酸含量則要高6倍～40倍(圖1B)；而在室溫條件下保存1 d后，PRRSV核酸含量要比對照組高40倍～60倍(圖1C)，而PRV的核酸含量則要高100倍～200倍(圖1D)。病毒核酸含量在PBS組和核酸保護(hù)劑組之間存在顯著差異。結(jié)果表明，核酸保護(hù)劑可以有效保護(hù)口腔液中的病毒核酸不被降解。

A.PRRSV/4 ℃;B.PRV/4 ℃;C.PRRSV/室溫;D.PRV/室溫A.PRRSV/4 ℃;B.PRV/4 ℃;C.PRRSV/Room temperature;D.PRV/Room temperature

2.2 溫度對口腔液中病毒核酸穩(wěn)定性的影響

核酸保護(hù)劑(DNA/RNA shield)組(圖2A和圖2C)和PBS對照組(圖2B和圖2D)分別在保存1、2、3 d時采集樣品，然后利用熒光定量PCR評估樣品中PRRSV和PRV的核酸含量。結(jié)果如圖2所示。當(dāng)添加核酸保護(hù)劑時，樣品在4 ℃或者在室溫條件保存1 d～3 d，PRRSV和PRV的核酸含量都基本一致(圖2A和圖2C)，各組之間差異不顯著；而在PBS對照組，樣品在4℃和室溫保存1d后，4 ℃條件下的PRRSV和PRV的核酸含量要比室溫條件下高10倍左右(圖2B和圖2D)。結(jié)果表明低溫條件可以有效延緩病毒核酸的降解，當(dāng)加入核酸保護(hù)劑時，基本可以克服溫度對樣品保存過程中核酸穩(wěn)定性的影響。

A.PRRSV/核酸保護(hù)劑;B.PRRSV/PBS;C.PRV/核酸保護(hù)劑;D.PRV/PBSA.PRRSV/Nucleic acids shield;B.PRRSV/PBS;C.PRV/Nucleic acids shield;D.PRV/PBS

2.3 核酸保護(hù)劑對不同核酸提取試劑盒提取核酸效率的影響

核酸保護(hù)劑是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，為進(jìn)一步評估核酸保護(hù)劑的使用是否能夠兼容不同公司的核酸提取試劑盒。本研究針對同一份樣品，分別用配套的核酸提取產(chǎn)品(ZYMO RESEARCH)和TaKaRa公司的核酸提取產(chǎn)品，進(jìn)行病毒核酸的提取，然后利用熒光定量PCR分別評估PRRSV和PRV的核酸含量。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)使用TaKaRa公司(T company)的核酸提取產(chǎn)品時，與核酸保護(hù)劑自帶的核酸提取產(chǎn)品(Z company)相比，PRRSV和PRV的核酸得率基本一致，二者之間無顯著差異。

A.PRRSV;B.PRV

3 討論

傳統(tǒng)意義上豬病的臨床診斷和豬群健康監(jiān)測，主要以豬的血液和組織作為臨床檢測材料，采集過程中對豬的應(yīng)激較大，且耗時費(fèi)力，當(dāng)檢測樣本量大時又面臨高昂的費(fèi)用成本，且樣品采集有一定的技術(shù)要求。針對以上問題，體液檢測或者豬的排泄物、分泌物等越來越被獸醫(yī)技術(shù)人員和養(yǎng)殖生產(chǎn)者所青睞。其中豬口腔液具有采樣簡便易行、對動物無應(yīng)激、更為經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的被作為臨床疫病診斷和豬群健康監(jiān)測的材料使用[6-7,17]。Klaas D等報道了利用口腔液開展豬瘟病毒早期檢測的研究[18]；Alejandro R等利用豬口腔液對10個豬場開展了PCV2、PRRSV和SIV等病毒感染情況的監(jiān)測，結(jié)果顯示PCV2的檢出率為85%，PRRSV的檢出率約為12%，而SIV的檢出率約為8%[3]；Yaowalak P等比較了PRV感染后豬口腔液和血清中PRV核酸的檢出情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后3 d～21 d，口腔液樣品的檢出率為20%～100%，而血清樣品中未檢測到病毒核酸[11]。Marisa等以PRRSV為例，系統(tǒng)介紹了利用口腔液開展動物疫病監(jiān)測時的采樣方案及注意事項[19]。此外，也有多篇研究報道了利用口腔液開展豬丹毒絲菌、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，PM)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)和豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)等細(xì)菌的檢測[5]。

我國自2018年非洲豬瘟暴發(fā)以來，豬口腔液是臨床開展疫病監(jiān)測和非洲豬瘟定點(diǎn)清除時使用的最為廣泛的一種生物檢材[12,20]?？谇灰簶悠返谋４婧瓦\(yùn)輸，很大程度上影響了后續(xù)檢測環(huán)節(jié)的成敗[17]。同時，口腔液成分相對較為復(fù)雜，包括黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶、富脯氨酸糖蛋白以及血清滲出液等[1-2]，目前病原微生物核酸在口腔液中穩(wěn)定性的研究還相對較少。柴偉東等[21]以PRRSV和PRV的核酸為例，報道了樣品保存液在豬口腔液檢測中的應(yīng)用，評估了不同樣品保護(hù)液對病毒核酸的保護(hù)作用。本研究旨在評估核酸保護(hù)劑以及口腔液樣品保存運(yùn)輸?shù)臏囟葘RRSV和PRV核酸穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)使用核酸保護(hù)劑時，口腔液樣品保存1 d后，PRRSV和PRV的核酸含量在低溫條件下(4 ℃)會比PBS對照組高10倍左右，而在室溫條件下，PRRSV和PRV的核酸含量則要高100倍左右；當(dāng)不使用核酸保護(hù)劑時，口腔液樣品在4 ℃與室溫條件下保存1 d后，4 ℃保存條件下，PRRSV和PRV的核酸含量仍比室溫條件下高10倍左右。而在核酸保護(hù)劑存在的條件下，PRRSV和PRV的核酸在室溫與4 ℃條件下保存1 d～3 d，核酸含量基本保持一致，不受外在保存溫度的影響。本研究還進(jìn)一步評估了核酸保護(hù)劑對不同核酸提取產(chǎn)品提取核酸效率的影響。結(jié)果顯示核酸保護(hù)劑可以兼容不同的核酸提取產(chǎn)品。此外，核酸保護(hù)劑作為一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，可以殺滅細(xì)菌、病毒和真菌等多種微生物，因此，經(jīng)過核酸保護(hù)劑處理的樣品，在最大限度保持所含核酸物質(zhì)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，還有助于避免在樣品運(yùn)輸及后續(xù)的處理過程中帶來的二次污染問題，具有重要的生物安全意義。

核酸保護(hù)劑的使用和低溫運(yùn)輸對于維持口腔液中核酸穩(wěn)定性具有重要的作用，為口腔液作為生物檢材的科學(xué)使用提供了有價值的信息。