孫洪超，付 媛，黃 靖，張紅麗，石團(tuán)員*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物寄生蟲病研究室，浙江杭州 310021;2.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310000)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種寄生于有核細(xì)胞的頂復(fù)門原蟲，生活史復(fù)雜且宿主范圍廣泛，可感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物及鳥類。終末宿主為貓及貓科動物，卵囊隨貓糞便排出體外，在適當(dāng)條件下發(fā)育為有感染性的孢子化卵囊，中間宿主接觸后便會造成感染，隨后以迅速增殖的速殖子及緩慢增殖的緩殖子等形式存在。正常情況下人感染弓形蟲不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但免疫低下患者如艾滋病病人感染后可出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀甚至死亡。

作為單細(xì)胞真核生物，弓形蟲具有多種與真核細(xì)胞類似的信號調(diào)節(jié)通路及蛋白激酶途徑，以利于蟲體正常生長及存活。由于其只能依靠寄生在細(xì)胞內(nèi)存活，在入侵宿主細(xì)胞時(shí)，其必須具備充足的營養(yǎng)物質(zhì)以及抵抗細(xì)胞免疫清除的能力，宿主細(xì)胞的營養(yǎng)代謝物質(zhì)可為弓形蟲增殖提供養(yǎng)料。真核細(xì)胞在正常生長過程中需要不斷產(chǎn)生能量以利于細(xì)胞增殖，那么弓形蟲如何獲得自身生長所需能量？了解這一過程，將有助于從源頭徹底切斷弓形蟲生長增殖，為后續(xù)開發(fā)抗弓形蟲藥物及疫苗提供幫助。

1 弓形蟲的營養(yǎng)攝取方式

弓形蟲速殖子及緩殖子在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)可不斷從宿主獲得營養(yǎng)物質(zhì)，大約20 s～30 s蟲體便能迅速侵入吞噬細(xì)胞，而這一過程不依賴于細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制。蟲體進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)發(fā)生內(nèi)陷而形成納蟲空泡(parasitophorous vacuole,PV)[1]，弓形蟲在這樣的“小房間”內(nèi)不斷生長增殖，待時(shí)機(jī)成熟便從空泡中溢出進(jìn)而侵襲其他細(xì)胞。大量的蟲體蛋白對納蟲空泡進(jìn)行修飾，以此調(diào)控蛋白質(zhì)輸出以及脂質(zhì)的輸入。其中分子質(zhì)量低于1.3 ku的蛋白均可自由進(jìn)入空泡膜內(nèi)，這些可以被自由穿梭的“小孔”的主要成份為弓形蟲致密顆粒蛋白GRA17和GRA23[2]。這些納蟲空泡膜的孔隙對于蟲體存活至關(guān)重要，是其攝取宿主代謝物的主要途徑之一，同時(shí)也利于蟲體自身排出有毒的代謝物如乳酸等。

2 弓形蟲的糖代謝

2.1 糖酵解

頂復(fù)門寄生蟲具有完整的糖酵解途徑[3]、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)過程的所有酶類及線粒體電子傳遞鏈。在植物中，糖酵解途徑磷酸化中間體，如葡萄糖-6磷酸(glucose-6 phosphate)、磷酸丙糖(triose phosphate)及磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，均由一系列的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(plastidic phosphate translocator，pPT)來運(yùn)輸。在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)pPT，其中6個(gè)pPT編碼功能基因[4]，瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)體內(nèi)最新鑒定出5種新的假定pPT[5]，而在弓形蟲(Toxoplasmagondii)及泰勒蟲(Theileria)體內(nèi)僅表達(dá)1種pPT，起運(yùn)輸糖類的作用。

弓形蟲的獨(dú)特之處在于其寄生在哺乳動物有核細(xì)胞中，這也決定了其特殊的代謝途徑。己糖(包括葡萄糖)在細(xì)胞代謝中至關(guān)重要，對于胞內(nèi)寄生蟲的增殖非常關(guān)鍵，胞內(nèi)寄生蟲通過表達(dá)單一或多種糖通透酶來攝取葡萄糖。瘧原蟲(Plasmodium)體內(nèi)介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)是重要的藥物靶標(biāo)[6-7]，在利什曼原蟲(Leishmania)和伊氏錐蟲(Trypanosomaevansi)中葡萄糖攝取同樣是維持其正常生長的先決條件[8]。弓形蟲速殖子階段主要通過糖酵解途徑分解葡萄糖并獲得能量，糖酵解不僅為脂肪酸合成提供碳源，同時(shí)對于驅(qū)動蟲體運(yùn)動并入侵細(xì)胞起重要作用[9]。弓形蟲入侵或溢出的過程中，其主要能量來源在細(xì)胞質(zhì)和膜之間是不斷相互轉(zhuǎn)移的，這利于其自身增殖。位于弓形蟲質(zhì)膜的黏附素促使弓形蟲肌動蛋白依賴ATP聚集并介導(dǎo)蟲體移動及入侵宿主細(xì)胞的過程，蟲體蛋白MIC2通過與糖酵解途徑中醛縮酶1結(jié)合進(jìn)而錨定到細(xì)胞骨架上發(fā)揮作用[10]。

2.2 三羧酸循環(huán)

真核生物中線粒體是細(xì)胞的發(fā)電站，其通過三羧酸循環(huán)氧化碳水化合物、脂質(zhì)及氨基酸等，從而通過電子傳遞鏈產(chǎn)生有效的ATP。在頂復(fù)門原蟲中，管狀的線粒體結(jié)構(gòu)攜帶部分生物合成的血紅素，F(xiàn)e-S簇及硫辛酸(lipoic acid)補(bǔ)救途徑等，參與多種代謝中間體的合成。但頂復(fù)門寄生蟲線粒體缺少Ⅰ型NADH脫氫酶及多種參與脂肪酸β氧化過程的酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體，在能量產(chǎn)生過程中所發(fā)揮的具體作用尚不明確。

頂復(fù)門原蟲TCA過程中，負(fù)責(zé)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)僅存在于頂質(zhì)體。其中除隱孢子蟲(Cryptosporidium)完全喪失TCA外，其余頂復(fù)門寄生蟲的基因組注釋中均顯示其具有參與TCA的全套酶類。對于弓形蟲來說，TCA在線粒體外同樣發(fā)揮重要作用，同時(shí)葡萄糖可以為脂肪酸合酶Ⅱ(fatty acid synthase Ⅱ，F(xiàn)ASⅡ)途徑及頂質(zhì)體內(nèi)類異戊二醇生物合成途徑提供碳源[11]。

細(xì)胞內(nèi)增殖的速殖子利用來自宿主的葡萄糖及谷氨酰胺作為“原料”來完成經(jīng)典的TCA。谷氨酰胺酶(glutaminase)可以通過轉(zhuǎn)化為戊二酸或通過γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)分流參與TCA，其中后者主要為細(xì)胞外寄生蟲存活貯存能量[12]。

3 弓形蟲消化和吸收來自宿主細(xì)胞質(zhì)的蛋白

弓形蟲入侵宿主細(xì)胞后可形成納蟲空泡(PV)，蟲體不斷分泌GRA蛋白至PV，同時(shí)包括一些參與形成內(nèi)部管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)(intravacuolar network，IVN)的蛋白質(zhì)[13]。已有報(bào)道顯示IVN可從宿主細(xì)胞攝取營養(yǎng)物質(zhì)，如脂類[14]及細(xì)胞衍生物[15]。弓形蟲在PV內(nèi)生長增殖過程中，其膽固醇來自于宿主細(xì)胞的供給，膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將宿主細(xì)胞膽固醇運(yùn)至納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)，隨后IVN負(fù)責(zé)將PVM上的營養(yǎng)物質(zhì)輸送至蟲體，或?qū)⒐蜗x的代謝物通過IVN-PVM運(yùn)送至宿主細(xì)胞[16]。宿主內(nèi)吞作用是沿著微管(microtubules,MTs)轉(zhuǎn)移到PV的，是基于MTs的PVM內(nèi)陷并被完整的輸送至PV中，這一精密的過程可保證將宿主消化的一系列小分子物質(zhì)成功運(yùn)輸至PV內(nèi)。

弓形蟲GRA7參與蟲體獲取營養(yǎng)的過程[17]，當(dāng)弓形蟲遷移至細(xì)胞核周圍區(qū)域時(shí)，細(xì)胞微管組織中心(MT-organizing center,MTOC)與PVM產(chǎn)生聯(lián)系，蟲體PV陷入MTs網(wǎng)絡(luò)中。宿主內(nèi)溶酶體沿著MTs轉(zhuǎn)移至PV附近，且在內(nèi)化至PV之前與PVM是緊密相連的。弓形蟲GRA7蛋白可以通過調(diào)控PVM收縮而隔離宿主的內(nèi)溶酶體，溶酶體內(nèi)的分子被水解后，便可通過載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穿過溶酶體膜，一旦其進(jìn)入液泡腔，這些分子便可通過特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被運(yùn)送并穿透弓形蟲質(zhì)膜。

4 嘧啶及其衍生物的來源

頂復(fù)門原蟲可通過簡單的氨基酸如谷氨酰胺(glutamine，Gln)和天冬氨酸(aspartic acid，ASP)前體合成嘧啶。這是一個(gè)多達(dá)6步的反應(yīng)過程，首先組裝嘧啶衍生物乳清酸，隨后加到核糖5'-磷酸上形成乳糖核苷5'磷酸，進(jìn)一步通過脫羧基將其轉(zhuǎn)化為單核苷酸尿苷5'-磷酸(UMP)，其為所有其他嘧啶核苷酸的前體物質(zhì)。當(dāng)UMP被雙磷酸化為UTP后，CTP合酶(CTPs)在限速步驟中轉(zhuǎn)化為CTP，這是從頭合成胞嘧啶衍生物的唯一已知途徑，在弓形蟲體內(nèi)同樣存在CTP合成酶(CTPs)[18]，蟲體在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)CTPs應(yīng)具備高活性來滿足核苷酸及脂質(zhì)的形成。CTPs在蟲體發(fā)育的所有階段均有表達(dá)，其活性對于弓形蟲的急慢性感染都很重要。嘧啶從頭合成途徑對于蟲體的存活及生長不可或缺，是抗弓形蟲藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)[19]。

5 輸出多種維生素作為必須酶類的輔助因子

生物素是多種羧化酶反應(yīng)的輔助因子，包括乙酰輔酶A羧化酶，這對于頂質(zhì)體的脂肪酸從頭合成途徑至關(guān)重要[20-21]。早期報(bào)道顯示弓形蟲體內(nèi)缺乏經(jīng)典的生物素合成途徑，瘧原蟲體內(nèi)的生物素連接酶主要負(fù)責(zé)修飾翻譯后的乙酰輔酶A羧化酶，這對其肝臟生活史階段非常關(guān)鍵[22]，隨后弓形蟲體內(nèi)同源性的生物素才受到重視，深入探索可利于調(diào)控弓形蟲的生長發(fā)育，最終試圖通過抑制弓形蟲的存活而起到防護(hù)作用。

6 糖酵解與弓形蟲緩殖子形成

弓形蟲速殖子因易于在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)的特點(diǎn)，對其相關(guān)研究較多，但在中間宿主體內(nèi)，弓形蟲多數(shù)情況下是以緩殖子形式存在的。緩殖子階段蟲體與宿主細(xì)胞之間是如何建立聯(lián)系的？弓形蟲組織包囊多存在于在腦、肌肉、眼及心臟等組織[23]，目前尚不清楚蟲體是否具有特殊細(xì)胞偏好性或更喜歡長期“棲居”在某一場所。試驗(yàn)表明，在成纖維細(xì)胞(HFF)及骨骼肌細(xì)胞(HSKMC)中[24-25]，弓形蟲期特異性分化的概率升高，這可能是因?yàn)樵擃惙窃鲋臣?xì)胞表達(dá)了一種特殊的未知產(chǎn)物或提供了特定的壓力條件，但在HFF細(xì)胞蛋白質(zhì)被豆蔻酸?；?，Akt激酶被激活并通過增加葡萄糖的產(chǎn)量而激活糖酵解途徑，進(jìn)而抑制了弓形蟲的分化[26]。對于增殖細(xì)胞而言，其產(chǎn)生大量的糖酵解中間產(chǎn)物及乳酸以此來維持糖酵解代謝，這個(gè)過程對于速殖子增殖較關(guān)鍵但不利于緩殖子的形成。一系列壓力因素介導(dǎo)體外誘導(dǎo)緩殖子形成的過程，如精氨酸或碳酸氫鹽的缺乏及酸堿應(yīng)激等，這些因素的存在也極顯著的抑制了速殖子的增殖[23]。

當(dāng)抑制弓形蟲營養(yǎng)物質(zhì)的儲存時(shí)，緩殖子變得較為敏感，于是其通過其他方式如自噬、脂質(zhì)儲存、碳水化合物儲存等獲取營養(yǎng)，緩殖子利用此方式避免蟲體營養(yǎng)過剩。弓形蟲是多種代謝缺陷型蟲株，如精氨酸(arginine)、嘌呤(purine)、半胱氨酸(cysteine，Cys)等[27]，當(dāng)限制這些必需因子及基礎(chǔ)營養(yǎng)的供應(yīng)時(shí)，弓形蟲便更傾向于向緩殖子分化，利用含有少于5 μmol/L～10 μmol/L的精氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)弓形蟲時(shí)，便會出現(xiàn)速殖子向緩殖子分化的現(xiàn)象[28]。進(jìn)一步探索糖酵解及營養(yǎng)物質(zhì)儲存在緩殖子階段的作用，將有助于揭示包囊形成過程中的營養(yǎng)需求，以及明確其與宿主持續(xù)性代謝的關(guān)系。

7 展望

弓形蟲的代謝與頂質(zhì)體關(guān)系密切，因此，頂質(zhì)體相關(guān)功能基因也是目前開發(fā)抗弓形蟲藥物的重要靶位點(diǎn)。頂復(fù)門寄生蟲的脂肪酸合成場所是頂質(zhì)體，其中弓形蟲主要依靠FASⅡ合成脂肪酸并為自身存活提供能量。因多數(shù)真核生物都是通過FASⅠ途徑來合成脂肪酸并為自身供能，因此干擾弓形蟲Ⅱ型脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶類，可影響弓形蟲的正常生長但卻不影響宿主的脂肪酸合成途徑，這利于新型抗弓形蟲藥物靶位點(diǎn)的開發(fā)。

任何生物的存活均離不開能量代謝，其中三羧酸循環(huán)及β氧化過程是多數(shù)生物獲得能量的主要來源[29]。糖酵解是生物體最經(jīng)典的能量獲取途徑，弓形蟲只能通過糖酵解途徑獲取自身存活所需的能量[30]，其中己糖激酶主要介導(dǎo)蟲體的能量代謝。干擾弓形蟲己糖激酶可導(dǎo)致蟲體能量代謝異常，進(jìn)而抑制其生長增殖[31]，因此，己糖激酶在新型抗弓形蟲藥物研發(fā)過程中也是重要的藥物靶標(biāo)。

綜上所述，深入研究弓形蟲的代謝途徑及其關(guān)鍵酶類，通過干擾其關(guān)鍵代謝酶的合成可影響蟲體正常的能量代謝，進(jìn)而抑制蟲體的生長及增殖，這可為新型有效抗弓形蟲藥物的開發(fā)提供思路。