程勤，胡承孝，明佳佳，蔡苗苗，劉康，湯艷妮，趙小虎

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/微量元素研究中心/新型肥料湖北省工程實(shí)驗(yàn)室/土壤環(huán)境與污染修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

植物根際微生態(tài)環(huán)境中，微生物顯著影響著“土壤-植物”系統(tǒng)中礦質(zhì)元素的生物有效性及植物生長(zhǎng)環(huán)境的健康狀況[1-3]。微生物群落的功能與群落的結(jié)構(gòu)和多樣性密切相關(guān)[4-5]。任何影響根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的因素，都會(huì)影響到群落的功能，進(jìn)而影響到植物的健康生長(zhǎng)。因此，研究根際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化，有助于理解外界因素促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)的根際過(guò)程。

硒是人體必需的微量元素，也是植物的有益元素。土壤中施用適量硒有助于植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗逆能力[6-8]。此外，土壤環(huán)境中，適量硒可直接或間接抑制白腐真菌（Phanerochaete chrysosporium）、青霉菌（Penicillium expansum）、核盤菌（Sclerotinia sclerotio?rum）等多種病原微生物的生長(zhǎng)[9-12]。有關(guān)硒與微生物生態(tài)的研究結(jié)果表明，硒可顯著改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及其多樣性[13]。低濃度硒可提高土壤微生物的數(shù)量和多樣性，高濃度硒則表現(xiàn)出抑制效果[14]。不同硒含量土壤的微生物群落特征及多樣性與土壤性質(zhì)等因素密切相關(guān)[15-16]。

前期研究發(fā)現(xiàn)：向土壤中施用適量硒顯著提高了油菜體內(nèi)礦質(zhì)元素的含量，促進(jìn)了油菜的生長(zhǎng)；恩施地區(qū)油菜主產(chǎn)區(qū)土壤微生物群落與硒含量密切相關(guān)[17-18]。綜合上述研究結(jié)果及其他研究報(bào)道推測(cè)，土壤施硒促進(jìn)植物生長(zhǎng)與硒改變根際微生物群落組成進(jìn)而影響土壤微生態(tài)環(huán)境有關(guān)。為明確外源硒對(duì)根際土壤細(xì)菌及真菌群落的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)其土壤生態(tài)安全性，本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，分析了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)與多樣性對(duì)外源硒的響應(yīng)，以期從微生物生態(tài)調(diào)控的角度，研究硒與植物生長(zhǎng)的關(guān)系，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)農(nóng)田施硒對(duì)土壤微生態(tài)安全的影響提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油菜品種為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所培育的中雙9號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

盆栽試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微量元素中心盆栽場(chǎng)（30°28′26″N，114°02′15″E）完成。土壤類型為酸性黃棕壤，種植油菜前采樣分析測(cè)定其基本理化性質(zhì)如下：pH 4.8，有機(jī)質(zhì)含量21.2 g·kg-1，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為69.73、29.87、47.64 mg·kg-1，土壤全硒含量12.37 μg·kg-1。試驗(yàn)以亞硒酸鈉（Na2SeO3）作為硒源，共設(shè)置3 個(gè)處理，土壤施硒濃度依次為0（CK）、0.5、1.0 mg·kg-1，分別記為Se0、Se0.5 和Se1.0（土壤硒濃度參照本團(tuán)隊(duì)前期相關(guān)研究結(jié)果設(shè)定），每個(gè)處理3 次重復(fù)。在油菜播種前，將所有營(yíng)養(yǎng)元素配成溶液施入土壤，其中，N、P、K 元素的施用量分別為N 0.2 g·kg-1、P2O50.15 g·kg-1、K2O 0.2 g·kg-1，營(yíng)養(yǎng)元素來(lái)源分別為尿素、磷酸二氫銨和硫酸鉀。微量元素以每千克土壤中加入1 mL 阿農(nóng)營(yíng)養(yǎng)液（1 000 倍）補(bǔ)充。先將硒配制成一定濃度的溶液，施入土壤后迅速拌勻。油菜按照當(dāng)?shù)夭シN時(shí)間于2017 年9 月16 日播種。植物生長(zhǎng)期間以去離子水作為水源。將盆栽放置于防雨棚下防止雨水中微量元素對(duì)試驗(yàn)的污染。

1.3 根際土壤樣品采集

根際土壤于2018 年3 月15 日（油菜花期）采用抖根法收集，即從盆栽土壤的20～50 cm 土層選取帶完整根系的土塊，然后輕輕抖落，緊附在根系表面且不易被抖落的土壤即為根際土壤。再去掉土壤中的根系和小石塊，過(guò)2 mm篩后將土樣裝于無(wú)菌封口袋中，冰上放置帶回實(shí)驗(yàn)室后保存在-80 ℃冰箱中。

1.4 根際土壤微生物總DNA提取和高通量測(cè)序

取0.5 g 根際土壤樣品，采用土壤DNA 試劑盒（MOBIO，美國(guó)）提取油菜根際土壤微生物總DNA。以紫外分光光度法測(cè)定提取的DNA 純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后用于構(gòu)建文庫(kù)。以提取的總DNA 為模板，以細(xì)菌V4 區(qū)特異性引物（338F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[19]和真菌ITS2 區(qū)特異性引物（ITS2 F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；2043R 5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增[20]。采用Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。土壤樣品的微生物測(cè)序及數(shù)據(jù)分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)去除接頭序列和低質(zhì)量的堿基處理后，獲得高質(zhì)量序列。通過(guò)Flash 軟件對(duì)每個(gè)樣品的Reads 進(jìn)行拼接，按照堿基數(shù)對(duì)Tags 進(jìn)行截?cái)嗪瓦^(guò)濾并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到最終的有效數(shù)據(jù)。利用QIIME 軟件（V1.9.1）對(duì)序列進(jìn)行識(shí)別，再利用USEARCH 選出優(yōu)質(zhì)序列后，以97%的序列相似度將序列聚類成操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU），將選取出的OTU 代表序列與16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)和ITS 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋后開展后續(xù)的測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒對(duì)油菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)計(jì)算不同硒處理土壤樣品中細(xì)菌和真菌在門水平上的物種平均相對(duì)豐度，同時(shí)選取相對(duì)豐度在1%以上的物種，繪制了門水平上的物種相對(duì)豐度分布圖（圖1）。由圖1A 可知，油菜根際土壤中細(xì)菌相對(duì)豐度較大的門類為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和酸桿菌門（Acidobacteria）等。硒處理（0.5、1.0 mg·kg-1）增加了土壤酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度，降低了放線菌門（Actinobacteria）的豐度。由圖1B可知，土壤中真菌相對(duì)豐度最大的門類為子囊菌門（Ascomycota），硒處理（0.5、1.0 mg·kg-1）增加了土壤子囊菌門（Ascomycota）的相對(duì)豐度。

圖1 不同施硒濃度下油菜根際土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）在門水平上的相對(duì)豐度Figure 1 The relative abundances of bacterial（A）and fungal（B）phyla in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

Venn 圖展示了不同濃度硒處理組土壤微生物群落共有或特有的OTU 數(shù)，進(jìn)而分析了各處理間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性、重疊情況以及特異性（圖2）。由圖2A 可知，硒處理土壤中細(xì)菌群落共有OTU 個(gè)數(shù)為670，而Se0、Se0.5 和Se1.0 處理土壤細(xì)菌群落特有的OTU 個(gè)數(shù)分別為213、117和113。由圖2B 可知，硒處理土壤中真菌群落共有OTU 個(gè)數(shù)為48，而Se0、Se0.5 和Se1.0 處理土壤真菌群落特有的OTU 個(gè)數(shù)分別為5、8和14。結(jié)果表明，對(duì)照組（無(wú)外源硒處理組）根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，特異性最高，硒處理降低了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的特異性，增加了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的特異性。

2.2 硒對(duì)油菜根際土壤微生物群落Alpha多樣性的影響

Alpha 多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析。本研究中，以Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)表示樣本中微生物的多樣性，前者數(shù)值越大或后者數(shù)值越小，表明群落多樣性越大。Chao1 指數(shù)可表征微生物群落豐富度，該指數(shù)的大小與微生物群落豐富度大小相對(duì)應(yīng)。由表1 可知，土壤施硒對(duì)油菜根際土壤細(xì)菌和真菌群落Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)的影響均未達(dá)到顯著水平，但顯著降低了土壤細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)，對(duì)土壤真菌群落的Chao1 指數(shù)影響不顯著。土壤微生物群落Alpha 多樣性分析結(jié)果表明：硒的施用未顯著改變油菜根際土壤樣品中微生物的多樣性，降低了土壤細(xì)菌群落的豐富度。

圖2 不同施硒濃度下油菜根際土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）OTU Venn圖Figure 2 The Venn diagram of bacterial（A）and fungal（B）OTU in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

表1 不同施硒濃度下油菜根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性與豐富度Table 1 The diversity and richness of bacteria and fungi in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

2.3 硒對(duì)油菜根際土壤微生物群落Beta多樣性的影響

圖3 不同施硒濃度下油菜根際土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）PCoA分析Figure 3 PCoA analysis of bacteria（A）and fungi（B）in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

根據(jù)樣本的OTU 豐度信息計(jì)算Unweighted Unifrac 距離，對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA），評(píng)價(jià)硒對(duì)油菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響（圖3）。由圖3 可知，不同施硒濃度中的3 個(gè)重復(fù)并不聚類于同一象限，表明組內(nèi)變異較大。由圖3A 可知，PC1 軸上Se0.5、Se1.0 處理集中分布在正方向，Se0 處理分布在負(fù)方向，Se0 與Se0.5、Se1.0 之間差異顯著，Se0.5 和Se1.0 之間差異不顯著，說(shuō)明影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子較為明顯。由圖3B 可知，PC1 軸上Se0、Se0.5、Se1.0 處理集中分布在正方向；Se0、Se0.5、Se1.0處理間的差異不顯著，表明影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子并不明顯?；贐ray-Curtis距離進(jìn)行Adonis分析，結(jié)果表明：硒對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著（R2=0.346，P=0.044）；硒對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響不顯著（R2=0.294，P=0.324）。綜合土壤微生物群落Beta多樣性結(jié)果可知，硒對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響比真菌群落更為明顯。

2.4 硒對(duì)油菜根際土壤微生物群落差異物種特征的影響

分析不同施硒濃度下土壤細(xì)菌和真菌群落的差異物種特征，對(duì)評(píng)價(jià)土壤硒與微生物多樣性的關(guān)系十分重要。本研究對(duì)三個(gè)濃度硒處理土壤間的細(xì)菌群落采用線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA），估算了硒處理下物種豐度對(duì)差異效果影響的大小。分析結(jié)果見顯著差異物種LDA 值分布柱狀圖（圖4），該圖反映了每個(gè)組內(nèi)顯著富集的物種及其差異影響。由圖4 可知：未施硒的油菜根際土壤中顯著富集乳桿菌目（Lactobacillaceae）、德庫(kù)菌屬（Trichococcus）、肉桿菌科（Carnobacteriaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、紅長(zhǎng)命菌屬（Sphaerotilus）；Microtrichales顯著富集于低濃度硒處理土壤中；而產(chǎn)黃桿菌（Rhodanobacter）、Nitrolancea、熱微菌科（Thermomicrobiaceae）和無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）則顯著富集于高濃度硒處理土壤中。

圖4 不同施硒濃度下油菜根際土壤細(xì)菌存在顯著差異物種的LDA值分布柱圖Figure 4 Histogram of LDA value distribution of species with significant difference between bacteria in the rhizosphere soil of oilseed rape under different selenium treatments

3 討論

土壤微生物在土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)中具有關(guān)鍵作用。植物在生長(zhǎng)過(guò)程中與土壤微生物密切接觸，其根系可塑造根際土壤微生物群落[21-23]。與此同時(shí)，根際微生物群落中的有益微生物如叢枝菌根真菌（AMF）和植物生長(zhǎng)促生菌（PGPR），有助于增強(qiáng)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)其對(duì)病原菌的抵抗能力[24]。根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性可通過(guò)“土壤-植物”互作系統(tǒng)直接影響到植物生長(zhǎng)的微生態(tài)環(huán)境。任何影響土壤微生物生態(tài)的外源因素都可能間接影響植物的生長(zhǎng)與安全。

本研究基于前期研究發(fā)現(xiàn)的“硒維護(hù)植物良好生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收”等相關(guān)結(jié)果，結(jié)合根際微生物生態(tài)功能，研究了硒作用下土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)與多樣性的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)油菜根際土壤中細(xì)菌相對(duì)豐度較大的門類為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）等。于冰[25]研究表明，變形菌門對(duì)多種植物根際微環(huán)境（如：擬南芥、玉米、枸杞等）具有良好的適應(yīng)能力，酸桿菌門能夠降解復(fù)雜的木質(zhì)素和纖維素，從而為土壤提供養(yǎng)分[26]。本研究中，硒處理下增加了根際土壤酸桿菌門（Acidobacteria）的豐度，表明土壤施硒可通過(guò)增加酸桿菌門細(xì)菌的豐度進(jìn)而促進(jìn)木質(zhì)素和纖維素的分解，以增強(qiáng)油菜對(duì)養(yǎng)分的吸收。這與明佳佳等[17]研究結(jié)果一致。此外，有研究指出，外源條件增加土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的豐度，改變微生物種群的相互作用和平衡，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)，抑制土傳病害的發(fā)生[27-28]。本研究數(shù)據(jù)驗(yàn)證了Liu等[18]土壤施硒降低了油菜菌核病的發(fā)病率相關(guān)研究結(jié)果。

Alpha多樣性是有效評(píng)價(jià)土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤施硒未顯著改變油菜根際土壤樣品中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。有研究報(bào)道，不同硒含量土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征明顯不同[15-16]，低濃度硒提高了土壤微生物的數(shù)量和多樣性，高濃度硒則表現(xiàn)出抑制效果[14]。本研究Beta多樣性分析結(jié)果表明，相比硒對(duì)土壤真菌群落的影響，硒對(duì)細(xì)菌群落的影響更為明顯。由此可見，油菜根際土壤中細(xì)菌群落對(duì)硒濃度響應(yīng)表現(xiàn)更為敏感。

本研究中，差異物種分析結(jié)果表明，較高濃度硒（1.0 mg·kg-1）處理土壤中顯著富集產(chǎn)黃桿菌（Rho?danobacter）、Nitrolancea和無(wú)色桿菌屬（Achromo?bacter）。其中，產(chǎn)黃桿菌（Rhodanobacter）和Nitrolan?cea有助于降解土壤抗生素[29]；無(wú)色桿菌屬（Achromo?bacter）是一種對(duì)植物有益的菌屬，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)量[30]。Jurado 等[31]研究表明Microbacteriaceae可以產(chǎn)生某些生物活性物質(zhì)，可用于防控植物病害。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Microbacteriaceae顯著富集于低濃度硒（0.5 mg·kg-1）處理土壤中，由此推測(cè)，施硒有助于特異性富集一些利于植物生長(zhǎng)的有益微生物。

盡管硒能夠改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性[13]，但不同硒含量的土壤微生物群落特征及多樣性不盡相同，這與植物類別、土壤性質(zhì)、養(yǎng)分含量、理化性質(zhì)等密切相關(guān)[16，32]。因此，后續(xù)研究有必要借助基因芯片技術(shù)，聯(lián)合土壤理化因子冗余分析，進(jìn)一步深入揭示土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化功能菌、植物生長(zhǎng)促生菌、土傳病害病原菌等豐度及其與硒含量的關(guān)系。此外，由于數(shù)據(jù)庫(kù)物種注釋的限制，本研究暫未確定種屬的物種，未能對(duì)其在微生態(tài)環(huán)境中的功能進(jìn)行解釋，有待利用其他先進(jìn)手段對(duì)這些物種進(jìn)行更詳細(xì)的物種注釋。

4 結(jié)論

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，借助高通量測(cè)序技術(shù)分析并明確了硒對(duì)油菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響。得到如下結(jié)論：

（1）硒對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落的多樣性無(wú)顯著影響，但影響了細(xì)菌和真菌群落中菌群的相對(duì)豐度，如增加了土壤酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度，但降低了放線菌門（Actinobacteria）的豐度；在真菌群落中，增加了土壤子囊菌門（Ascomycota）的相對(duì)豐度。

（2）硒對(duì)油菜根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著，對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

（3）硒促進(jìn)油菜根際土壤富集對(duì)植物生長(zhǎng)有益的微生物。因此，本研究結(jié)果可為從根際微生態(tài)的角度解釋“硒增強(qiáng)植物抗性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)”提供數(shù)據(jù)參考。