AmpC ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中的相關(guān)性研究

胡穎嵩，衛(wèi) 明，唐 晶，葉 巍，楊 楷

(湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430015)

肺炎克雷伯菌具有多重耐藥性，可以產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)超光譜β內(nèi)酰胺酶，對于頭孢菌素等多種抗菌藥物均會產(chǎn)生耐藥，近年來還發(fā)現(xiàn)了對亞胺培南耐藥肺炎克雷伯菌，因此對肺炎患者的治療產(chǎn)生嚴重的影響，目前認為引發(fā)耐藥主要是孔蛋白確實導(dǎo)致了外模滲透性發(fā)生改變，同時形成了水解亞胺培南β內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變[1]。近年來隨著基因?qū)W的飛速發(fā)展通過對耐藥菌株進行分析了解耐藥過程中的變化已成為臨床熱點，目前認為耐藥的重要機制是膜蛋白缺失，ompK35是細菌耐藥主要膜蛋白，AmpC則是腸桿菌或者綠膿假單胞菌染色體或者質(zhì)粒介導(dǎo)形成的β內(nèi)酰胺酶，可以被誘導(dǎo)形成對β-內(nèi)酰胺抗菌素抑制劑不敏感，但是兩者具體的作用機制臨床說法不一[2]。為了進一步深入分析AmpC、ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中情況，本研究進行了觀察，以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù)，現(xiàn)匯報如下。

1 材料與方法

1.1細菌株來源：2015年1月至2020年1月，收集我院分離培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌200株，其中耐亞胺培南菌株50株(A組)，不耐亞胺培南菌株150株(B組)。

1.2試劑及儀器：全自動鑒定系統(tǒng)：美國BD公司Phoenix 100；高速低溫離心機：安徽中科中佳公司 HC 3018R；PCR擴增儀：德國Biometra公司；自動型DNA序列分析儀：美國ABI公司3730型；臺式高速低溫離心機：德國 Eppendorf公司5417R；恒溫水浴箱：廣州明珠電器廠；比濁儀：法國生物梅里埃公司；藥敏紙片：OXOID公司；亞胺培南：深圳市海濱制藥有限公司。

1.3試驗方法：采用CLSI紙片擴散法開展菌株藥敏試驗，選擇純培養(yǎng)菌落接種肉湯培養(yǎng)基，使用無菌棉蘸取菌液布滿瓊脂表面，室溫下干燥5min后使用無菌鑷子將含藥紙片平鋪在瓊脂表面。溫箱中孵育，測量抑菌環(huán)直徑。使用瓊脂稀釋法測定次抑菌濃度IMP菌株對耐藥IMP的最低抑菌濃度(MIC)值。IMP的MIC判斷標準：MIC低于4ug/mL判斷為敏感，MIC=8ug/mL判斷為中介，MIC超過16ug/mL判斷為耐藥。三維水解實驗檢測β-內(nèi)酰胺酶：經(jīng)高壓滅菌棉簽從培育好的菌懸液中沾取0.5麥氏單位肺炎克雷伯菌菌懸液，均勻涂抹在M-H瓊脂平板上，孵育培養(yǎng)24h矢狀菌苔生長方向都指向紙片為陽性。提取肺炎克雷伯菌基因組DNA：選擇分離培養(yǎng)菌體2g置于LB培養(yǎng)基，37℃恒溫搖床培養(yǎng)18h，離心后加入GN結(jié)合液混合均勻靜置5min，再次離心后漂洗30s，清洗3次去除離心純化柱殘留漂洗液，純化柱套入干凈1.5mL離心管加入100ul緩沖液心1min，收集液體是洗脫下來的基因組DNA，加入ompK35引物：FOR GCGCATCTCCAAGACCATG REV GCCACGCGATTTGACGGAG進行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物5ul，加上樣緩沖液1ul，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30min在紫外成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1A組和B組AmpC基因和蛋白表達比較：A組AmpC基因、蛋白相對表達量明顯高于B組(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 A組和B組AmpC基因和蛋白表達比較

2.2A組和B組ompK35基因和蛋白表達比較：A組ompK35基因、蛋白相對表達量明顯低于B組(P<0.05)，見表2和圖1。

表2 A組和B組ompK35基因和蛋白表達比較

圖1 Western blot檢測圖

2.3相關(guān)性分析：AmpC基因與ompK35基因呈負相關(guān)(r=-0.329，P<0.05)；AmpC蛋白與ompK35蛋白呈負相關(guān)(r=-0.435，P<0.05)。見圖2。

圖2 相關(guān)分析圖

3 討 論

肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌科革蘭氏陰性菌，也是引發(fā)肺炎重要的致病菌，會導(dǎo)致肺部感染形成高熱狀態(tài)，在老年人群、長期飲酒和營養(yǎng)不良人群中極易感染，研究還發(fā)現(xiàn)在長期住院尤其是出現(xiàn)臟器功能衰竭患者容易感染肺炎克雷伯菌，增加了臨床治療難度，患者病死率升高[3,4]。隨著現(xiàn)代臨床應(yīng)用抗菌藥物越來越廣泛，肺炎克雷伯菌對于第三代頭孢菌素耐藥率接近三分之一，國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致呼吸道感染顯著升高[5,6]。目前研究發(fā)現(xiàn)由多藥耐藥病原菌導(dǎo)致肺部感染最佳治療方案尚未明確，需要進行藥物敏感性檢測，而對于耐藥病菌特效治療方案較少，提示臨床可用有效治療方法不多[7]。β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物屬于常見的抗生素，治療細菌感染效果顯著，但是耐藥性報道也越來越常見，耐藥性出現(xiàn)多源化與多樣化，目前認為β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性桿菌發(fā)送耐藥的主要機制可以水解β-內(nèi)酰胺類抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)造成活性喪失繼而導(dǎo)致耐藥[8]。目前大量的研究證實了AmpC酶表達是細菌對β-內(nèi)酞胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性主要原因，同時膜蛋白缺失也是重要機制，ompK35則是肺炎克雷伯菌細菌耐藥主要膜蛋白[9]。

本研究分析了AmpC、ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中的情況，通過分離耐藥菌株后進行試驗了解肺炎克雷伯均對于亞胺培南耐藥特點。AmpC酶為頭孢菌素酶，分子結(jié)構(gòu)屬于C類，和超廣譜β內(nèi)酰胺酶不同，優(yōu)選底物屬于頭孢菌素，對頭霉烯類抗菌藥物具有高水平耐藥性，而且金屬酶類可以產(chǎn)生多重耐藥，只對單環(huán)類抗菌藥物形成敏感性，其可以水解大部分β內(nèi)酰胺類抗菌藥物[10]。研究顯示由質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶可以在外膜蛋白缺失狀態(tài)下依然引發(fā)細菌對于亞胺培南耐藥，主要是其可以進行水解，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶ACT-1能夠在一株產(chǎn)氣腸桿菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)CMY-10，均具有水解碳霉烯類藥物的特點[11]。膜蛋白ompK35是亞胺培南進入菌體的主要通道，研究發(fā)現(xiàn)ompK35基因減少同耐亞胺培南肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥有關(guān)，發(fā)揮耐藥作用主要是表達量的減少，而且不管AmpC酶表達量超過或低于正常只要同時存在ompK35基因表達異常均會導(dǎo)致肺炎克雷伯菌株對亞胺培南耐藥[12,13]。還有研究發(fā)現(xiàn)疏水性和帶負電荷越多抗菌藥物分子、較大藥物分子均不容易通過，而外膜蛋白缺失會造成抗菌藥物、營養(yǎng)物質(zhì)運輸過程異常，造成了藥物通透性降低，而且通過傳代后膜蛋白可以逐漸恢復(fù)，膜蛋白恢復(fù)對亞胺培南滲透性增加導(dǎo)致了敏感性可以得到恢復(fù)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，A組AmpC基因、蛋白相對表達量明顯高于B組，提示了耐亞胺培南肺炎克雷伯菌AmpC表達顯著升高。A組ompK35基因、蛋白相對表達量明顯低于B組，提示了耐亞胺培南肺炎克雷伯菌ompK35基因和蛋白表達量明顯降低。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)AmpC基因與ompK35基因呈負相關(guān)；AmpC蛋白與ompK35蛋白呈負相關(guān)。本研究通過分析了AmpC、ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中的變化，證實了AmpC酶是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥的重要因素，ompK35基因明顯降低同樣是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥的重要因素，而且兩者具有相關(guān)性，為臨床了解亞胺培南導(dǎo)致肺炎克雷伯菌耐藥機制提供了相應(yīng)的依據(jù)，但是本研究對于具體機制以及兩種基因之間是否存在相互影響未能深入研究，還需擴大樣本量、長期隨訪論證。

綜上述所，耐亞胺培南肺炎克雷伯菌AmpC表達量升高，ompK35表達量降低，兩者可能在耐藥機制中有重要作用。